严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白核酸疫苗的构建及免疫原性研究

目的:构建SFTSV的核蛋白核酸疫苗并探讨其免疫原性?方法:采用PCR方法扩增SFTSV核蛋白基因,并用引物引入限制性内切酶酶切位点,克隆入载体pJW4303?经酶切和测序鉴定正确的质粒,用PEI瞬时转染HEK293T细胞,用免疫印迹法鉴定核蛋白的表达?同时以质粒pJW4303作为阴性对照,免疫BALB/c小鼠,酶联免疫法验证其免疫原性?结果:成功构建质粒pJW4303-N,经Western blot证实SFTSV核蛋白能够在HEK293T细胞中表达?ELISA检测免疫后小鼠血清特异性IgG抗体及其亚型发现,IgG抗体及其亚型较免疫前明显升高,亚型中以IgG2a升高为主?结论:SFTSV核蛋白核酸疫苗pJW4303-N具有良好的免疫原性,为进一步研究SFTSV核蛋白奠定了基础?     

结核杆菌ESAT-6抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建可同时表达flt3配体(flt3-ligand,FL)和结核杆菌6kD早期分泌蛋白(ESAT-6)的重组pIRES质粒,并在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中表达,为进一步研究结核杆菌DNA疫苗提供实验基础.方法:采用PCR方法将FL和ESAT-6基因分别定向克隆入真核双表达载体pIRES.在酶切分析及序列测定后,用脂质体转染至GMC细胞,Western blot鉴定其体外表达.结果:核酸序列测定证实重组质粒构建正确,该重组质粒在体外GMC细胞中能表达FL和ESAT-6两种蛋白.结论:成功构建了结核杆菌FL和ESAT-6双顺反子真核表达质粒,并在体外实现了共表达.     

FasL和Der p2双基因共表达真核表达载体的构建及其在树突状细胞中的表达

目的 构建小鼠FasL基因和屋尘螨主要抗原Der p2双基因共表达载体,并检测其在树突状细胞(DC)中的表达.方法 以plambd-Der p2为模板扩增Der p2基因,双酶切pIRES2EGFP和Der p2基因,将Der p2基因克隆入pIRES2EGFP得pIRES2EGFP-Der p2.双酶切pMD18T-FasL质粒获得FasL片段,克隆入pIRES2EGFP-Der p2,获得FasL和Der p2共表达重组载体pIRES2EGFP-FasL-Der p2,采用酶切及测序鉴定重组质粒.将重组质粒转染DC,采用RT-PCR和Western Blot法检测FasL和Der p2基因的mRNA及蛋白水平的表达.结果 测序证实FasL和Der p2基因序列完全正确.重组质粒转染DC后,能表达FasL和Der p2 的mRNA和蛋白.结论 成功构建FasL和Der p2双基因共表达重组载体pIRES2EGFP-FasL-Der p2,转染DC后能在体外正确表达FasL和Der p2基因.     

SFTSV糖蛋白Gn重组质粒的构建及其体液免疫原性研究

目的:研究严重发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)糖蛋白Gn的体液免疫原性?方法:将PCR方法扩增的SFTSV糖蛋白Gn基因和密码子优化后Gn基因克隆入载体pJW4303,构建Gn野生型和双优化重组质粒;经酶切和测序鉴定确认为目的质粒后,分别转染HEK293T细胞,Western blot检测糖蛋白Gn的表达;用Gn重组表达质粒及空载体分别免疫BALB/c小鼠,ELISA检测免疫后小鼠血清抗Gn特异性IgG抗体?结果:成功构建Gn重组野生型质粒pJW4303-WSP-Gn和双优化质粒pJW4303-tPA-Gn-opt;Western blot证实pJW4303-WSP-Gn编码Gn可在HEK293T细胞内表达,pJW4303-tPA-Gn-opt编码Gn在HEK293T细胞内表达并分泌到细胞外;ELISA检测免疫后小鼠血清抗Gn特异性IgG抗体证实各重组质粒均能诱导特异性IgG抗体产生,双优化质粒较野生型质粒诱导产生的IgG时间更早?滴度更高?结论:SFTSV的糖蛋白Gn具有良好的免疫原性;和野生型质粒相比,双优化质粒更有利于糖蛋白Gn的表达和分泌,并且具有更好的体液免疫原性?     

结核杆菌Esat6与hGM-CSF双顺反子表达载体的构建及鉴定

目的 从质粒pVAE中克隆目的基因Esat6,与hGM-CSF一起构建双顺反子表达载体pIEG,并进行鉴定.方法 以质粒pVAE为模板扩增出Esat6基因,与pIRES的MCS A进行重组,构建pIEsat6重组质粒.然后再以pORF-hGM-CSF为模板扩增出hGM-CSF基因,与pIRES载体的MCS B进行重组,构建pIGM重组质粒,上述两重组质粒经PCR、限制性内切酶图谱及DNA序列测定分析等多种方法进行鉴定后,再通过酶切、连接把hGM-CSF构建于pIEsat6质粒中,形成双顺反子真核表达载体pIEG.结果 通过PCR可克隆得到相应大小的产物,酶切鉴定所切下的两片段大小约为0.29 kb和0.47 kb,与预计相符.测序结果与报道一致.结论 成功构建结核杆菌Esat6基因与hGM-CSF双顺反子真核表达载体,为进一步研究其结核融合DNA疫苗及其转染DC疫苗原型的免疫保护效果奠定了基础.     

携带IRES的hBDNF绿色荧光蛋白表达载体的构建和鉴定

目的构建表达人脑源性神经生长因子(hBDNF)基因的真核细胞表达载体,并且观察重组质粒在真核细胞中的表达情况。方法采用PCR方法从健康人基因组中扩增出该基因,将hBDNF的PCR产物用XhoⅠ和SalⅠ双酶切后克隆到用XhoⅠ和SalⅠ双酶切的带有EGFP和内部核糖体转入位点(IRES)的真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中。对重组质粒进行双酶切和质粒测序鉴定后,采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将重组的质粒转染至真核细胞中,用RT-PCR和荧光显微镜检测基因在细胞中表达的情况。结果双酶切和质粒测序结果证明hBDNF已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,质粒能在细胞中正常表达。结论成功构建了EGFP/hBDNF表达载体,为应用hBDNF治疗中枢神经系统疾病奠定坚实的基础。     

含结核分枝杆菌ESAT6和CFP10基因的重组腺病毒表达载体的构建

目的克隆结核分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,构建能同时表达两基因的重组腺病毒活载体,为研制能有效防治结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法首先利用PCR技术克隆结核分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,将两者通过IRES串连插入腺病毒转移载体中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10。该穿梭质粒转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAdeasy-1-pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10。PacI酶切线性化该质粒,转染AD293细胞进行病毒包装。结果ESAT-6和CFP-10基因成功克隆,其序列与GenBank公布的一致。两者通过IRES串连插入腺病毒转移载体,获得的重组穿梭质粒经同源重组,成功获得复制缺陷型重组腺病毒质粒Adeasy-1-pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10,转染该质粒的AD293细胞出现细胞病变效应。结论成功克隆了分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,构建了含IRES串连的ESAT-6和CFP-10基因的重组腺病毒,为重组腺病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。     

TH和GDNF双基因表达载体的构建及其在MES23.5细胞中的表达

目的 构建酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)双基因表达载体并检测其在体外的表达,为帕金森病提供新的治疗措施.方法 采用分子克隆技术,从pWAV2-TH质粒酶切获得人TH基因片段,将其克隆入真核表达质粒载体pIRES的上游,构建出pIRES-TH.PCR法扩增小鼠GDNF基因片段,克隆入pIRES-TH的下游,构建出携带TH和GDNF双基因的重组质粒pIRES-TH-GDNF.用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检测质粒重组后的序列.随后将重组质粒用Lipofectamine2000转染至MES23.5细胞,经G418筛选后,以RT-PCR及免疫荧光法检测TH和GDNF基因在mRNA及蛋白水平的表达.结果 重组质粒酶切后其片段大小与预期结果相同,测序发现基因序列完全正确.转染后MES23.5细胞中TH和GDNF基因的水平明显升高(P＜0.05).结论 重组pIRES-TH-GDNF质粒构建成功并能在体外正确表达TH和GDNF基因.     

小鼠CD160胞外段真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠CD160胞外段的真核表达载体,并稳定转染CHO细胞进行真核表达.方法 从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增CD160胞外段,然后将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1和pEGFP-N1两种质粒中,构建重组质粒psCD160和pEGFP-sCD160.重组质粒经双酶切鉴定及测序正确后,用脂质体转染CHO细胞,并用RT-PCR和Western blot检测CD160胞外段的表达,流式细胞术检测重组psCD160与其配体的结合能力.结果 获得长度约为520 bp的小鼠CD160胞外段基因,经测序证实其序列正确.用脂质体将含有CD160胞外段基因的重组质粒载体转染CHO细胞后.RT-PCR和Western blot分析证实转染的CHO细胞可表达重组的psCD160基因,并且表达的可溶性CD160可与其配体结合.结论 成功构建小鼠CD160胞外段基因的真核表达载体,并转染CHO细胞后表达出相应蛋白,为进一步研究CD160胞外段的功能效应奠定实验基础.     

HBV中片段表面抗原及E抗原真核表达质粒的构建与体外表达

目的 构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）中片段表面抗原真核表达质粒和Ｅ抗原真核表达闰。方法 将编码ＨＢＶ中片段表面抗原（ｐｒｅＳ２＋Ｓ）的基因片段和Ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ＿的基因片段分别插入真核细胞表达载体（ｐＪＷ４３０３）中,构建成的重组体经筛选鉴定后,再转染哺乳动物细胞,检测表达产物。结果 电泳鉴定显示目的基因片段正确插入了表达载体。经筛选、纯化的阳性克隆转染哺乳动物细胞后可表达ｐｒｅＳ２＋Ｓ和ＨＢｅＡｇ     

结核杆菌ＥＳＡＴ-６抗原多表位ＤＮＡ疫苗的构建与表达

目的:构建含3个结核杆菌ESAT-6抗原T细胞表位及Fh3配体基因的重组质粒,并使其在大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)中表达.方法:用计算机软件预测结核杆菌ESAT-6抗原的T细胞表位谱,选取3个T细胞表位,并以Ala-Ala-Tvr(AAY)序列作为接头,合成全基因序列,定向克隆入真核双表达载体pIRES及质粒plRES-FL.在酶切分析与序列测定后.用PEI转染至GMCs细胞,并行Western blot鉴定其体外表达.结果:核酸序列测定证实重组质粒构建正确,Western blot证实该重组质粒能在体外GMCs细胞中表达融合蛋白.结论:成功构建了结核杆菌ESAT-6抗原多表位基因重组质粒.     

前列腺特异性膜抗原、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子双顺反子DNA疫苗的构建及其免疫活性的测定

目的:构建前列腺特异性膜抗原(PSMA)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)核酸疫苗并测定其免疫活性.方法:应用DNA疫苗载体pIRES构建pIRES-PSMA-mGM-CSF、pIRES-PSMA、pIRES-mGM-CSF重组质粒,酶切鉴定正确后与pIRES空质粒分别免疫C56BL/6小鼠(每组15只),LDH释放试验测定各自免疫后小鼠的特异性细胞毒性T细胞(CTL)杀伤活性.结果:成功构建上述重组质粒;pIRES-PSMA-mGM-CSF免疫后小鼠特异杀伤率最高,pIRES-PSMA、pIRES-mGM-CSF次之,pIRES空质粒最差(P＜0.05),各组杀伤效果以效靶比为101时最高.结论:PSMA及mGM-CSF双顺反子DNA疫苗有望在前列腺癌的基因治疗中发挥积极的作用.     

重组表达载体pIRES-CD、pIRES-TK的构建及其在ACC-2细胞中的表达

目的：运用分子生物学技术扩增CD、TK基因，进行其DNA序列分析，并构建真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK，将其共同转染ACC-2细胞，为进一步研究双自杀基因对ACC-2细胞杀伤作用奠定基础。方法：根据CD和TK基因DNA的序列分别设计、合成引物，构建克隆载体pMD18-T-CD和pMD18-T-TK,并进行DNA序列分析；构建以内部核糖体进入位点 (IRES)相连的CD和TK基因的真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK，用电穿孔法以真核表达质粒共同转染ACC-2细胞，用RT-PCR检测CD和TK的表达。结果：克隆DNA片段和GeneBank上报道的CD、TK序列基本一致，且经酶切鉴定,CD、TK基因成功插入真核表达质粒IRES，R-PCR检测表明，以真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK共同转染的ACC-2细胞能表达CD和TK。结论：成功扩增了CD、TK的DNA片段，并进行了序列分析；成功构建CD和TK基因的重组真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK，将其转染ACC-2细胞后能分泌性表达CD和TK，为肿瘤基因治疗的研究提供一定途径。     

人KiSS-1和p27^Kip1基因在骨肉瘤MG63细胞株中的共表达

目的克隆肿瘤转移抑制基因KiSS-1和细胞周期依赖性激酶抑制剂基因p27^Kip1的表达序列,应用内部核糖体插入位点（IRES）序列构建共表达载体pIRES-KiSS-1-p27^Kip1,测序鉴定,并获得稳定表达目的蛋白的细胞株。方法利用RT-PCR从人正常胎盘组织中获得KiSS-1和p27^Kip1基因开放阅读框的cDNA序列,将两目的基因的eDNA序列重组至pIRES载体,构建共表达载体pIRES-KiSS-1-p27^Kip1,应用脂质体转染骨肉瘤MG63细胞,并通过RT-PCR和Westernblot检测目的蛋白的表达情况。结果经PCR、酶切鉴定和基因序列测定,证实重组人pIRES载体上的两个片段均为目的基因开放阅读框的核苷酸序列,KiSS-1和p27^Kip1蛋白在转染后的细胞中有表达。结论成功构建共表达载体pIRES-KiSS-1-p27^Kip1,获得稳定表达KiSS-1和p27^Kip1蛋白的细胞株,为进一步观察目的基因对骨肉瘤细胞体内外效应奠定基础。     

结核杆菌Hsp65和hGM-CSF双顺反子表达质粒的构建与表达

目的:应用分子生物学技术,构建pIHsp65GM双顺反子真核表达质粒,并在真核细胞中表达.方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因,同时从质粒pORF-hGM-CSF中扩增出基因佐剂hGM-CSF,分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建pIHsp65GM真核表达质粒,并转染HepG-2细胞中表达和检测.结果:酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.64 kb和0.47 kb,测序分析表明克隆的Hsp65和hGM-CSF序列与GenBank上公布序列完全一致;免疫组织化学方法检测到表达Hsp65的阳性细胞;ELISA方法检测到pIHsp65GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达,与空载体对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论:成功构建和表达了pIHsp65GM质粒,为研制优于卡介苗的新型抗结核病DNA疫苗奠定基础.     

Construction and Expression of Bivalent Membrane-anchored DNA Vaccine Encoding Sj14FABP and Sj26GST Genes

In order to construct a eukaryotic co-expression plasmid containing membrane-anchored Sjc14FABP and Sjc26GST genes and identify their expression in vitro, Sj 14 and Sj26 genes were obtained by RT-PCR with total RNA of Schistosoma japonicum adult worms as the template and cloned into eukaryotic expression plasmid pVAC to construct recombinant plasmids pVAC-Sj14 and pVAC-Sj26. Then a 23 amino-acid signal peptide of human interleukin-2 (IL-2) upstream Sj14 or Sj26 gene and a membrane-anchored sequence containing 32 amino-acids of carboxyl-terminal of human plaeental alkaline phosphatase (PLAP) downstream were amplified by PCR as the template of plasmid pVAC-Sj14 or pVAC-Sj26 only to get two gene fragments including Sj14 gene and Sj26 gene. The two modified genes were altogether cloned into a eukaryotic co-expression plasmid pIRES, resulting in another new recombinant plasmid pIRES-Sj26-Sj 14. The expression of Sl14 and Sl26 genes was detected by RT-PCR and indirect immunofluorescent assays (IFA) when the plasmid pIRES-Sj26-Sj14 was transfected into eukaryotic Hela cells. Restriction enzyme analysis, PCR and sequencing results revealed that the recombinant plasmids pVAC-Sj14, pVAC-Sj26 and pIRES-Sj26-Sj 14 were successfully constructed and the expression of modified Sj 14 and Sj26 genes could be detected by RT-PCR and IFA. A bivalent membrane-anchored DNA vaccine encoding Sj14 and Sj26 genes was acquired and expressed proteins were proved to be mostly anchored in cellular membranes.