猕猴对乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗的特异性细胞免疫应答

目的 观察乙型肝炎病毒核心抗原核心酸疫苗即ＨＢｃＡｇ核酸疫苗（ｐＪＷ４３０３／ＨＢｃ）免疫猕猴的特异性细胞免疫应答。方法 猕猴分别在第０、２、４、６个月肌肉注射法接种核酸疫苗（ｐＪＷ４３０３／ＨＢｃ）或对照质粒（ｐＪＷ３０３）；ＥＬＩＳＡ法检测猕猴外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ），经特异性抗原（ＨＢｃＡｇ）刺激后，培养上清中人白细胞介素－４（ＩＬ－４）和干扰素γ（ＩＦＮ－γ）以及猕猴血清中抗－ＨＢｃｌ     

乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗对猕猴的体液免疫原性观察

核酸疫苗 ( DNA疫苗 )能够有效地刺激机体的特异性免疫应答已经成为共识。鉴于乙型肝炎病毒核心抗原 ( HBc Ag)是机体细胞毒性 T细胞 ( CTL )识别和攻击 HBV感染肝细胞的主要靶抗原 ,我们构建了 HBc Ag核酸疫苗 ,并已观察到该核酸疫苗经不同接种方法免疫不同品系小鼠均可引起特异性体液免疫和细胞免疫应答。为进一步观察该核酸疫苗对非人灵长类动物的免疫原性 ,我们用该核酸疫苗接种猕猴 ,发现猕猴对该核酸疫苗具有良好的抗体应答反应。1　材料和方法( 1 ) HBc Ag核酸疫苗的制备　 HBc Ag核酸疫苗 ( p JW430 3/HBc)及对照质粒 ( …     

乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达

目的:用基因工程的方法对乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达进行分析与探讨。方法:利用ELISA方法,使得HBcAg基因片段扩增,构建含有HBcAg基因的表达质料与克隆质粒,以IPTG诱导大肠杆菌BL21(DE3)plys中蛋白的重组表达,并且,采用酶联免疫测定方法检测重组蛋白。结果:在大肠杆菌中,重组HBcAg得到表达,经过酶联免疫测定方法检测,在预期位置显示有特异性条带。结论:采用基因工程的方法对乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达,成功构建了HBcAg原核表达系统,并获取重组HBcAg,有效地推进了重组蛋白的相关功能研究,具有很高的研究推广价值。     

乙型肝炎病毒核心启动子缺失变异对病毒抗原表达的影响

目的：为研究乙型肝炎病毒（HBV）核心启动子（CP）20／21bp部分缺失（nt1748/1747至nt1767)及同时存在的A1896点变异对病毒抗原表达的影响。方法：利用前期构建的HBV全基因的重组载体转染HepG2细胞后,对病毒抗原进行ELISA检测及Western-blotting分析。结果：变异株分泌到细胞外的HBsAg,HBeAg及细胞内的HBcAg表达量较野毒株均明显减少。结论：HBV CP20／21bp部分缺失株及同时存在的A1896点变异株的病毒抗原表达较野毒株显著下降。     

乙型肝炎病毒核心抗原DNA疫苗对小鼠和猕猴的免疫原性观察

目的 :观察乙型肝炎病毒核心抗原 ( HBc Ag) DNA疫苗对小鼠和猕猴的免疫原性。方法 :肌内注射法接种 HBc AgDNA疫苗 ;EL ISA法检测小鼠和猕猴血清抗 - HBc Ig G终点滴度和 Ig G亚类水平 ;51铬释放法测定小鼠脾细胞 HBc Ag特异性细胞毒性T细胞 ( CTL )活性 ;EL ISA法检测猕猴外周血单个核细胞 ( PBMC)培养上清中 IFN -γ及 IL - 4水平 ;3H - Td R掺入法检测猕猴PBMC HBc Ag特异性增殖反应。结果 :小鼠和猕猴经接种该 DNA疫苗后均产生高滴度抗 - HBc抗体 (分别达 1∶ 3 2 80 5 0和1∶ 10 93 5 0 ) ;小鼠抗 - HBc Ig G亚类以 Ig G2 a为主 ,猕猴抗 - HBc Ig G亚类以 Ig G2占优势 ( Ig G1/Ig G2 <1) ;小鼠的 HBc Ag特异性CTL杀伤活性达 5 0 %以上 ;猕猴 PBMC培养上清中 ,IFN-γ水平与 IL - 4相比占明显优势 ( 15 .63 pg/ml vs <3 .13 pg/ml) ,猕猴PBMC抗原特异性增殖反应阳性 (刺激指数 =2 .12～ 3 .83 )。结论 :HBc Ag DNA疫苗对小鼠和猕猴均具有良好的体液免疫和细胞免疫原性。     

Flt3配体免疫佐剂作用的研究进展

Flt3配体(FL)是近年来发现的早期造血细胞生长因子，能在体内、体外扩增树突状细胞(DC)，特别对DCI亚群的扩增作用更为明显。大量的研究证实了FL能有效提高HIV、HCV、HBV和肿瘤疫苗的细胞免疫应答水平，展示了FL在治疗性疫苗中的应用前景；同时也发现FL不仅有单纯的免疫增强作用，其也能诱导免疫耐受，显示了FL生物学作用的多样性和复杂性。     

乙型肝炎病毒全抗原亚型疫苗的免疫原性实验

本文报告了一种乙型肝炎全抗原亚型疫菌,该疫苗不去除Dane颗粒,它是用HBsAg和HBeAg阳性携带者血清。并且为adr。adw及ayw三种亚型。分别经聚乙二醇沉淀和超速离心纯化。产物在电镜下除HBsag外可见到Dane颗粒,然后除菌、甲醛灭活。稀释并加入氢氧化铝佐剂制成的,每种亚型疫苗分别多部位(脚掌、腹服沟、颌下等),皮下接种豚鼠每次总量1ml,三次免疫后。全部动物均产生抗—HBs。抗—HBc每批动物仅个别阳性。抗—HBe全部阴性,但必须考虑豚鼠对HBV三个抗原系统免疫应答灵敏性远较人类和黑猩猩差,作为全抗原乙肝疫苗研制、本文进行了初步尝试。     

乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心抗原（ayw亚型）转基因小鼠模型。方法：采用受精卵显微注射的方法制备转基因小鼠，以PCR、免疫组化和H－E染色法分析导入基因在小鼠基因组中的整合，肝脏中的表达及肝组织的病理变化。结果：得到6只基因组中整合了核心抗原基因的首建者（founder）小鼠，其中1只在肝细胞核和胞浆均有HBcAg的表达。将肝脏中表达的小鼠继续传代，F1代10只小鼠中的4只小鼠肝细胞有HBcAg的表达。结论：建立了乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠，核心抗原基因能够在小鼠肝脏中表达，并且可以遗传。     

人Flt3配体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的 克隆人Flt3配体(Flt3 LIg and,FL),并在CHO细胞中进行表达.方法 从健康人外周血中提取总RNA,通过RT-PCR技术,扩增Flt3配体胞外区cDNA功能性片段,经DNA测序证实后,将得到的片段基因插入pcDNA3.0表达载体,构建了pcDNA3.0-FL真核表达载体;将重组质粒pcDNA3.0-FL转染CHO细胞,经G418筛选出阳性细胞克隆,扩大培养,提取细胞总蛋白,用SDS-PAGE分离并Western blotting检测到在相对分子质量约24 000处有一显色条带.结果 FL胞外区cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3.0中并在CHO细胞中成功表达.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-FL并在CHO细胞中成功表达,为FL的相关研究和应用开发奠定了基础.     

利用杆状病毒表达载体系统表达重组乙型肝炎病毒核心蛋白

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组乙型肝炎病毒核心蛋白。方法构建含有HBVC基因的杆状病毒转移载体pFastBac Dual—HBV core，转化大肠埃希菌DH10Bac进行转座，提取重组Bacmid DNA转染昆虫细胞Sf9，获得含有HBVC基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染Sf9细胞进行乙型肝炎病毒核心蛋白表达，然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达情况。结果成功构建了含HBVC基因的重组杆状病毒，而且在昆虫细胞Sf9中表达了乙型肝炎病毒核心蛋白。结论利用Bac to Bac杆状病毒表达系统，成功地表达了乙型肝炎病毒核心蛋白，为进一步研究奠定了基础。     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的 构建乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)强制泛素(Ub)化的DNA疫苗表达质粒.方法 以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBV pADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(-),构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1(-),并行酶切鉴定和基因测序.结果 构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的 基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致.结论 成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗.     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的构建乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）强制泛素（Ub）化的DNA疫苗表达质粒。方法以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBVpADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1（-）,构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1（-）,并行酶切鉴定和基因测序。结果构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致。结论成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗。     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒的构建及表达

采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出经过测序鉴定的乙肝表面抗原中蛋白（preS2 S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX-S2S,酶切鉴定后将重组质粒体外转染COS7细胞,ELISA法检测上清液中的HBsAg呈阳性,说明重组质粒pVAX-S2S在体外能够有效表达HBsAg,为进一步的体内免疫反应打下基础。     

插入CpG序列的乙肝病毒核心抗原基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(Iss)基因真核表达载体,为研制乙肝治疗性疫苗奠定基础.方法 根据乙肝病毒核心抗原基因序列,设计合成3对引物,在引物中引入分别针对人、鼠敏感的CpG片段和不合CpG的片段.用PCR方法从慢性乙肝患者血清DNA中扩增出乙肝核心抗原基因片段,将扩增的产物与真核表达质粒pZeoSV2(+)连接,构建重组体pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(ISS),进行酶切、PCR及测序鉴定.结果 乙肝核心抗原基因体外扩增产物大小约为530bp.所构建的pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(1ss)重组体经双酶切及PCR鉴定,与预期片段的大小相符;测序结果与GenBank中收录的HBcAg全长序列一致,表明pzeoSV2(+)/CpG-HBcAg(ISS)真核表达载体构建正确.结论 成功地构建了真核重组表达载体pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(Iss).为CpG的功能研究和乙肝治疗性疫苗的研制提供了物质基础.     

强制泛素化乙肝病毒核心抗原融合基因表达质粒的构建

目的 构建强制泛素化乙肝病毒核心抗原(HBcAg)融合基因真核表达质粒.方法 以HBV adr亚型全基因质粒pADR.为模板,PCR扩增HBcAg基因片段;无茵操作下分离Balb/C小鼠肝脏,提取mRNA,RTPCR扩增小鼠泛素基因片段.PCR产物经测序鉴定后双酶切,插入真核表达质粒pcDNA 3.1(-),构建重组真核表达质粒ub-HBcAg-pcDNA 3.1(-)酶切鉴定和基因测序.结果 扩增的泛素基因片段和HBcAg基因片段经测序证实序列正确;将上述基因双酶切后插入质粒pcDNA 3.1(-)中,构建强制泛素化rmcAg融合基因表达质粒ub-HBcAg-pcDNA3.1(-);融合基因真核表达质粒ub-HBcAG-pcDNA 3.1(-)经酶切、基因测序等鉴定证实目的基因序列和插入方向正确,与预期结果一致.结论 成功构建了强制泛素化乙肝病毒核心抗原融合基因真核表达质粒,为进一步研究强制泛素化HBcAg诱导HBV特异性CTL奠定了实验基础.     

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白去糖基化对体液免疫应答的影响

目的:观察乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原中蛋白(MHBs)中去糖基化对体液免疫应答的影响.方法:在MHBs核酸疫苗(pSW3891/MHBs/adr)基础上,通过PCR扩增基因修饰法,使MHBs上编码第4、59、146位氨基酸密码子基因由AAT/AAC突变为CAG,从而使AAT/AAC编码的天冬酰胺Asn(N)突变为CAG编码的谷氨酰胺Gln(Q),使得N-糖基化位点NXS、NXT突变为QXS、QXT.构建3株去糖基化核酸疫苗(dG1,去除Asn4处糖基化位点,位于preS2上;dG23,去除Asn59、Asn146处糖基化位点,均位于HBs上;dG123,去除Asn4、Asn59及Asn146位糖基化位点).脂质体法转染293T细胞,Western blot检测,观察它们在293T细胞中瞬时表达的差异;肌肉注射法免疫BALB/c小鼠,观察MHBs去糖基化对小鼠体液免疫应答的影响.结果:adr、dG23转染293T细胞后,在细胞内及上清液中均检测到HBsAg;dG1、dG123转染293T细胞后,在细胞内检测到HBsAg,但是上清液中未测到.adr、dG1及dG23免疫BALB/c小鼠后均产生抗-HBs抗体,最高滴度均达到1∶102 400;dG123几乎无抗体反应(＜1∶200).结论:Asn4去糖基化导致MHBs向细胞外的分泌障碍,但是对小鼠抗-HBs的产生无影响.Asn59、Asn146两处同时去糖基化对MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生影响轻微.Asn4、Asn59及Asn 146三处同时去糖基化明显影响MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生.     

乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠。方法：构建乙型肝炎病毒核心基因真核表达载体pcDNA3-HBc;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核巾,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管;取其产10d龄子代鼠进行鉴定。结果与结论：表达载体内切酶酶切及序列分析结果与预期一致;PCR鉴定转基因阳性小鼠比例为25％(6／24)。可表达核心蛋白基因的转基因小鼠成功建立。     

乙型肝炎表面抗原基因植物高效表达载体的构建

目的构建果实特异性启动子驱动的含乙肝表面抗原(hepatitis B virus surface antigen, HBsAg)植物表达载体,进一步提高外源目的基因的表达量,为研制有效的转基因植物防乙肝病毒疫苗打下基础。方法将番茄果实特异性启动子基因2A12和E8 ,分别插入到pBPFΩ7构建中间载体pB2A12和pBE8 ;酶切YEP-HBs载体中的HBsAg小蛋白,并插入到pB2A12和pBE8 ,得到载体pB2A12-HBs和pBE8-HBs ;将其中“p35S 2A12 Ω HBsAg-s Tnos”片段和“p35S E8 Ω HBsAg-s Tnos”片段分别亚克隆到pCAMBIA1301 ,得到植物表达载体pCAM2A12-HBs和pCAME8-HBs。测序鉴定pCAM2A12-HBs、pCAME8-HBs中的启动子和HBsAg片段。最后将pCAM2A12-HBs、pCAME8-HBs转化根癌农杆菌EHA105。结果重组质粒用酶切鉴定均得到预期片段,pCAM2A12-HBs、pCAME8-HBs的测序结果正确。结论本实验成功构建了番茄果实特异性启动子和Ca MV35S组成型启动子共同驱动HBsAg基因的植物表达载体。     

时间分辨免疫荧光分析检测乙型肝炎病毒表面抗原

目的 时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)是当前标记免疫分析研究应用领域的热点之一,具有高灵敏性和高特异性,用于生物分子的超微量检测.本研究者在建立一种灵敏度高、特异性强、操作简便的检测方法.方法 以Eu-DTTA{N1-(P-异硫氰基苄基)-二乙三胺四乙酸铕钠}为示踪物,建立了用TRFIA检测乙型肝炎血清学标志物乙型肝炎病毒表面抗原的方法.结果 所建立的标准曲线分析范围分别为0.2～300 ng/ml,分析灵敏度为0.05 ng/ml,检测参考标准品的批内变异系数均小于10%,与免疫放射测定同时定量检测多份血清样本,相关系数高达95%.结论 TRFIA分析范围宽,灵敏度高,操作简便,具有优越的定量检测能力,价格适中,十分适合临床推广应用.