病毒介导的基因转染在组织工程中的应用

目的构建重组病毒载体,将较多细胞因子通过病毒载体转入种子细胞,提高细胞增殖及分泌基质能力,维持表型,延缓老化.方法应用基因工程技术,构建缺陷型逆转录病毒重组载体和缺陷性腺病毒重组载体.分别通过PT67包装细胞筛选克隆及293细胞扩增,获得假病毒上清液,经浓缩纯化后转染靶细胞.结果成功构建胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、Fas 配体(Fas-Ligand)、绿色荧光蛋白(GFP)等逆转录病毒载体以及TGFβ1、人骨形成蛋白因子-7(hBMP7)、端粒酶、Smad3、Smad7等腺病毒载体,其中GFP-逆转录病毒重组载体在软骨细胞表达至2月.结论通过有效的含目的基因重组载体转染种子细胞,延缓体外培养细胞的老化及促进细胞的增殖与基质分泌,获得组织工程所需要的大量种子细胞,为组织工程构建奠定了基础.     

腺病毒介导慢病毒载体的细胞转染

目的 尝试利用腺病毒介导慢病毒载体的细胞感染以提高转染效率。方法 以多聚赖氨酸粘合腺病毒和慢病毒载体形成复合体后感染Hela细胞，测定慢病毒载体目的基因表达的变化并用激光共聚焦扫描显微镜观察慢病毒载体的细胞摄人情况，进一步了解抗腺病毒衣壳球部的抗体能否干扰这种变化以证明腺病毒是否参与此介导作用。结果携带大肠埃希菌半乳糖苷酶(pgalactosidase，pgal)基因的慢病毒载体Lenti^-VSVG对Hela细胞的感染率非常低，通过多聚赖氨酸与腺病毒(AdenoPL)形成复合体后感染率显著上升并呈剂量依赖性。激光共聚焦扫描显微镜显示Lenti^-VSVG被细胞摄取的数量在和腺病毒粘合后显著增加。抗腺病毒衣壳球部抗体能抑制直至阻断Lenti^-VSVG／AdenoPI。复合体两者各自携带基因(分别是β-gal和荧光素酶／绿色荧光蛋白融合蛋白)的表达。结论 通过多聚赖氨酸的物理连接，腺病毒能介导慢病毒载体的细胞摄入从而提高转染效率。     

腺病毒介导基因转染活体眼组织的研究

目的 :了解活体内不同途径应用腺病毒转染外源基因在眼组织的分布情况 .方法 :将含有 β 半乳糖苷酶 (beta galactosidase,β gal)报告基因的腺病毒 ,在 1× 10 9～ 1× 10 11nfu·L-1的滴度下 ,分别采用玻璃体腔内注射、前房注射、表面点药及球旁注射到大鼠眼内 ,3d ,1,2 ,3和 4wk后用 β gal染色法观察 β gal基因在眼组织内的分布情况 .结果 :各病毒滴度组均可有效地转染外源基因 ,且未观察到细胞病理改变 .玻璃体腔内注射的大鼠眼球组织包括角膜、虹膜、睫状体、视网膜均有β gal基因表达 ,前房注射组角膜、虹膜、睫状体有表达 ,表面点药组仅有角膜上皮细胞表达 ,球旁注射组眼外肌有表达 .注射 3d后开始出现 β gal基因阳性表达 ,持续达 4wk以上 .结论 :腺病毒能有效、稳定地转染外源基因到活体眼组织的角膜、虹膜、睫状体、视网膜     

腺相关病毒介导的心肌基因转染在心脏移植中的应用

目的：探讨在不同转导方法下,将外源性基因转入供体心脏的可行性。方法：将携带报告基因半乳糖苷酶基酶（LacZ）的病毒载体经三种办法转导供体心脏方法：直接心肌注射法,经冠状动脉单次灌注法,组织胺预处理＋经冠状动脉单次灌注法。心脏移植21d后,供体心脏进行组织学检查,分析报告基因转染和表达。结果：经冠状动脉单次灌注法,组织胺预处理＋经冠状动脉单次灌注法处理的两组移植心脏中未发现有报告基因的表达,直接心肌注射法组的移植物中发现有高效表达的报告基因。结论：在非生理状态下,经冠状动脉单次灌注病毒载体不能有效转染外源性基因,直接心肌注射法在心脏移植中是可行的。     

TGF-β1基因转染在软骨组织工程中应用的研究进展

关节软骨的损伤在骨科临床上十分常见。关节软骨主要由软骨细胞和软骨细胞外基质组成,由于关节软骨无血液供应和神经支配,软骨细胞代谢活性低,而且自我修复能力较弱,导致了关节软骨损伤的修复成为临床骨科的一大难题[1]。近年     

腺病毒介导神经营养素-3基因转染施万细胞

[目的]构建神经营养素 3(NT 3)基因转染的施万细胞.[方法] NT 3基因重组腺病毒(AdvNT 3)扩增、纯化和测定后,转染体外培养的施万细胞(SCs).用免疫细胞化学和 ELISA方法分别检测 NT 3基因转染 SCs的 NT 3表达及培养液中 NT 3的含量. [结果]实验中获得的 AdvNT 3中外源基因序列与大鼠 NT 3的 DNA序列完全一致,与未基因转染 SCs相比,NT 3基因转染 SCs的 NT 3阳性增强,培养液中 NT 3含量增高.[结论]通过腺病毒介导可以获得 NT 3过量表达的基因转染 SCs.     

外源性Rb基因转染对头颈肿瘤的抑制作用

目的 探讨外源性Rb基因对头颈肿瘤的抑制作用。方法 运用携带Rb基因的复制缺陷型腺病毒转染口腔鳞癌细胞株012，观察其体内和体外的抑癌效果。结果 腺病毒表达载体可有效地将外源性Rb基因转染012细胞并使其表达。体内、体外抑瘤实验表明：导入Ad-Rb基因的肿瘤细胞，其细胞生长曲线明显受抑制，Ad-Rb基因治疗组裸鼠肿瘤生长最为缓慢，与DL312和PBS对照组比较有显著性差异（P＜0．05）。结论 腺病毒介导的外源性Rb基因可有效地转染入口腔鳞癌细胞株，并抑制其生长。     

人野生型p53基因与逆转录病毒载体的构建及转染

应用逆转录病毒为载体构建了含人野生型ｐ５３基因的重组质粒，并成功地转染ψｃｒｉｐ包装细胞。本实验应用ＰＬＸＳＮ为载体，１．８ｋｂ野生型ｐ５３基因作为插入片段，通过Ｔ＿４ＤＮＡ连接酶进行连接。用〔α—￣（３２）Ｐ〕ｄＣＴＰ标记野生型ｐ５３基因片段（１．８ｋｂ）为探针进行原位杂交。筛选出重组体，将其命名为ＰＬＸＳＮ－５３，然后用该重组体对ψｃｒｉｐ包装细胞进行转染。收集转染后的细胞，准备下一步感染ｐ５３突变细胞株研究之用。该质粒的构建和细胞转染实验为进一步研究野生型ｐ５３基因的抑癌作用及其表达与调控原理奠定了基础。     

293包装细胞产生重组逆转录病毒的基因转染研究

目的 :如何提高重组逆转录病毒的滴度和基因转染率 ,是目前需要研究的问题。方法 :目的基因连接到病毒载体形成重组子 ;病毒载体质粒转入包装细胞 2 93 ,产生无复制能力的病毒颗粒 ;用病毒感染NIH3T3细胞 ,测定病毒的滴度 ;将携带有目的基因的病毒颗粒转染靶细胞 ,绿色荧光蛋白 (GFP)为转染阳性细胞的标记物 ,FACS分离阳性细胞 ;Westernblot检测目的基因表达。结果 :用包装细胞 2 93产生的病毒颗粒 ,其滴度高达 3× 10 9;用携带目的基因的病毒转染悬浮细胞UT7,转染率为 60 % ,转染贴壁细胞MDA -MB -4 3 5 ,转染率为 99% ,转染原代培养的造血干细胞 ,转染率为 3 1% ;UT7细胞和MDA -MB -4 3 5细胞分别表达目的基因的产物 ,5个月以后 ,仍能提出滴度的病毒 ,并能有效地转染靶细胞 ,转入的目的基因能持续和稳定地表达 ,仍能提出基因产物     

以逆转录病毒为载体进行肝脏基因转染的研究进展

自 1992年对家族性高胆固醇血症病人进行第 1例肝脏疾病基因治疗以来 ,对肝脏疾病基因治疗的研究已经成为目前国内外研究的热点之一。肝脏是体内多种物质的主要代谢场所 ,并能合成多种血浆蛋白质 ,且具有强大的再生能力 ,因而肝脏是基因治疗理想的靶器官。许多肝脏疾病 ,特别是由于单基因缺陷所致的代谢性疾病 ,为肝脏基因治疗的理想疾病 ,如α1 胰蛋白酶缺陷症、遗传性酪氨酸血症、Ｃｒｉｇｌｅｒ Ｎａｊｊａｒ综合征等 ,为肝脏疾病的基因治疗提供了广阔的应用前景。1　基因转染的载体载体是治疗性遗传物质的携带者或运输工具 ,理想的治疗…     

逆转录病毒载体介导胰岛素原基因突变体与葡萄糖激酶基因共转染的应用价值

目的研究逆转录病毒载体介导基因共转染的效率,探讨其在基因共转染领域的应用价值.方法以携葡萄糖激酶(glucokinase, gk)基因的逆转录病毒及携人胰岛素原基因突变体(mutant proinsulin gene,mpin)的逆转录病毒共同感染HepG2细胞,经G418筛选,放免法、SDS-PAGE、Western-blot挑选联合表达GK及成熟胰岛素的HepG2细胞,RT-PCR鉴定.结果 G418筛选3周获阳性细胞克隆,采用放射免疫法、SDS-PAGE、Western-blot从20个细胞克隆中挑选出联合表达GK及成熟胰岛素的HepG2细胞4株,选取1株命名为细胞克隆"β";RT-PCR证实细胞"β" 中已有两个目的基因的转录.结论在需要目的基因长期表达的基因共转染领域,逆转录病毒载体仍有一定的应用价值,但如何提高其介导的基因共转染效率有待进一步探究.     

逆转录病毒载体介导Fn-TPO基因修饰人骨髓间充质干细胞

目的 应用逆转录病毒载体介导纤维连接蛋白-血小板生成素(Fn-TPO)基因修饰人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察Fn-TPO基因修饰对于骨髓MSCs的影响.方法 构建携带Fn-TPO基因的重组逆转录病毒载体,并以其对骨髓MSCs进行体外基因修饰;台盼蓝拒染法计数活细胞数检测基因修饰后骨髓MSCs的体外增殖能力,RT-PCR检测Fn-TPO基因在骨髓MSCs中的表达情况,MTT法检测基因修饰后骨髓MSCs黏附造血细胞的能力,ELISA检测基因修饰后骨髓MSCs分泌至细胞培养液中的TPO浓度.结果 成功构建携Fn-TPO基因的重组逆转录病毒载体且以该逆转录病毒载体对骨髓MSCs进行体外基因修饰;Fn-TPO基因在骨髓MSCs内能够正常转录;基因修饰后的骨髓MSCs体外增殖能力无明显改变(P＞0.05);黏附造血细胞能力增强(P=0.01),分泌TPO的能力增强且不随培养时间延长而显著减弱(P＜0.01),但受细胞生长状态影响.结论 成功应用携带Fn-TPO基因的逆转录病毒载体对人骨髓MSCs进行基因修饰,使基因修饰后骨髓MSCs黏附造血细胞分泌TPO能力增强.     

葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体及包装细胞系的构建及鉴定

目的构建葡萄糖激酶(glucokinase,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为将GK基因应用于糖尿病的基因治疗打下基础.方法质粒pCMV4-GKZ1经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体PLX-GK,采用酶切及测序对重组体进行鉴定.而后脂质体转染PLX-GK至包装细胞PA317,检测培养上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞系并对其行PCR及免疫组化鉴定.结果构建了GK基因逆转录病毒表达载体PLX-GK,经酶切及序列分析证实目的基因插入位点和读码框架正确、无突变;建立了稳定产毒细胞系PA317/GK,其培养上清平均病毒滴度为6.8×105cfu/ml,最高为1.8×106cfu/ml,PCR及免疫组化证实GK基因整合入PA317/GK细胞基因组并有GK的表达.结论成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的稳定产毒细胞系.     

腺病毒介导的HSV-tk/GCV系统对肺癌细胞的杀伤作用

目的：用含HSV-tk重组腺病毒载体转染Lewis肺癌细胞,探讨其对肺癌细胞的杀伤作用。 方法：利用同源重组技术构建含HSV-tk基因的重组腺病毒载体(AdCMVtk),将含LacZ基因的腺病毒载体(AdCMVLacZ)转染Lewis肺癌细胞,X-gal染色后,测定腺病毒对该细胞的转染率,并观察AdCMVtk/GCV系统对Lewis肺癌细胞存活率的影响。 结果：随着AdCMVLacZ的病毒量（MOI）增加,对Lewis细胞转染率也增加,当MOI为500时,转染率可达100%。AdCMVtk/GCV系统可明显杀伤Lewis细胞, 且随着AdCMVtk的MOI增加,或GCV浓度的增加,细胞存活率减少,但单独使用AdCMVtk或GCV时,对Lewis细胞无杀伤作用。AdCMVtk/GCV系统对该细胞的杀伤作用具有明显的旁观者效应,20%Lewis细胞被AdCMVtk转染可引起74%细胞死亡。 结论：AdCMVtk/GCV系统杀伤肿瘤细胞既有效又安全。     

组织工程在医学中的应用

组织工程学是一门新学科,它以工程学和生命科学为原理,研制生物结构,为解决组织和器官缺损所致的功能障碍或丧失的治疗问题提供广阔的前景。近几十年来的研究取得很大成功,并且应用于临床。本文根据各组织器官胚层发育的来源,综述组织工程学在医学中的应用进展。     

逆转录病毒载体介导HPV16E7对人关节软骨细胞的转化及其生长特性

目的 研究HPV16E7（human papillomavirus 16 E7)基因片段对人关节软骨细胞的转化作用以及转化细胞的生长特性。方法 利用含HPV16E7基因的逆转录病毒载体pLXSN转染人关节软骨细胞，检测HPV16E7基因的整合与表达，并用生长曲线，血清依赖试验，电镜及流式细胞仪细胞周期时相观察，了解转化细胞与正常软骨细胞的生长特性。结果 挑选出能够在体外长期培养的经HPV16E7转化的细胞克隆，已传代50代，PCR及RT－PCR证实HPV16E7已与宿主细胞基因组成功整合及转录，转化细胞的生长速率要高于正常软骨,二者都对血清有较大程度的依赖，转化细胞的核质比大，核仁明显，S期细胞数显著高于正常软骨细胞。结论 经HPV16E7基因转化的人关节软骨细胞增殖能力强，可连续传代达50代。     

人组织激肽释放酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定人组织激肽释放酶基(h-TKK)基因真核表达质粒。方法 设计含pnI和BamH Ⅰ酶切住点的人组织激肤释放酶基因引物，采用PCR法从原核pBluescripe Ⅱ KSKK( )中扩增KKcDNA片段，亚克隆至padtrack-CMV真核表达裁体，转化感受态大肠杆菌DHl0B，酶切鉴定阳性重组子，并进行序列测定。结果经 PCR能扩增出738bp的片段，与预期片段大小相符，构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段，测序结果与预期序列完全一致。结论 成功构建了人组织激肽释放酶基因真核表达重组体pAdtrack-CMV KK。     

壳聚糖在组织工程中的应用

壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后的产物,具有良好的生物相容性和生物可降解性,并且具有低毒、无免疫原性等特点。作为自然界唯一的天然阳离子多糖并且拥有良好的生物学性质,使得壳聚糖在药学、医学、组织工程等领域的研究备受关注。近年来,壳聚糖及其衍生物材料作为天然高分子组织工程支架越来越受到重视。本文综述了壳聚糖及其衍生物在不同器官（骨、软骨、皮肤、肝等）组织工程中的研究现状。     

支原体污染对重组逆转录病毒的产生和感染靶细胞的影响

目的探讨细胞支原体污染对重组逆转录病毒的产生和靶细胞感染效率的影响。方泼利用倒置荧光显微镜或流式细胞仪检测绿色荧光蛋白（GFP）表达，确定细胞转染效率及病毒感染效率。PCR方法扩增支原体特异性核酸片段以检测培养细胞293T、NIH3T3及32D有无支原体污染。结果支原体抗生素Plasmocin有效清除了培养细胞内及上清中所污染的支原体；通过对细胞支原体的清除明显提高了逆转录病毒重组表达质粒在包装细胞中的转染效率及病毒感染靶细胞的效率。结论细胞受支原体污染后不仅影响了逆转录病毒重组表达质粒在包装细胞中的转染，而且严重影响了重组逆转录病毒对靶细胞的感染效率；Plasmocin是清除细胞支原体污染的理想抗生素。