人外周血中树突状细胞的诱导及鉴定

目的　从健康人外周血中诱导高纯度树突状细胞 (dendritic cell,DC)。方法　用贴壁法从健康人外周血获取单核细胞 ,对传统的诱导方法加以改进 ,经 GM- CSF(10 0 ng/ ml)和 IL- 4(5 0 0 U/ m l)持续诱导 7天 ,在此期间不再补充新的细胞因子、新鲜培养基和促成熟因子 ,以获取高纯度 DC。结果　经上述方法处理后 ,从健康人外周血中诱导出了大量高纯度 DC,其能高表达 HL A- 、 类分子、共刺激分子和粘附分子 ,显示出成熟 DC的特征。这些 DC能强烈诱导同种异体淋巴细胞的增埴 ,其内吞能力在第 3天达最高 ,之后明显下降。结论　本研究所建立的从外周血获取大量成熟 DC的方法经济、简便 ,为 DC的深入研究和临床应用奠定了基础     

人外周血来源的树突状细胞的体外诱导培养

目的：从健康人外周血中诱导高纯度树突状细胞(DC)。方法：将外周血单个核细胞用贴壁法分离出单核细胞，经多细胞因子联合诱导出DC。结果：培养8～9d后即可获得大量高纯度的成熟DC，经流式细胞仪检测，所得细胞中高表达共刺激分子和粘附分子，表现为成熟DC的特征。结论：利用多细胞因子组合可从外周血诱导大量成熟DC，为DC的临床应用提供依据。     

人外周血树突状细胞体外诱导培养及表型鉴定

目的从健康人外周血中分离单个核细胞（peripheral blood mononuclearcell,PBMC）,经体外诱导培养获取成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）.方法取健康人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离,获得单个核细胞,在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养.置37℃、5%CO2培养箱内静置培养2 h后除去悬浮细胞.培养液中加入rhGM-CSF和rhIL-4继续培养贴壁细胞5 d,然后加入TNF-α促进其分化成熟.倒置显微镜下观察DC形态,流式细胞仪（flowcytometer,FCM）对其进行表型鉴定.结果显微镜下观察DC细胞形态不规则,表面有大量的毛刺状突起;成熟DC细胞表面CD83、CD80分子表达明显增高.结论用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α联合培养可以从健康人外周血诱导培养出成熟的树突状细胞.     

人外周血中树突状细胞的诱导、培养及其表面标记的初步研究

目的：在人外周血中有效地诱导，培养树突状细胞（dendritic cells,DC)并鉴定其表面分子的表达，方法：采用密度梯度离心的方法分离人外周血中的单个核细胞，在6孔板上贴壁2h，然后吸去悬浮细胞，用粒细胞－巨噬细胞集落群体刺激因子（GM－CSF）、白细胞介素－4（IL－4）、肿瘤坏死因子－α（TNF-α）细胞因子组合，刺激树突状细胞（DC）增殖，分化。用标有荧光素的单抗标记培养细胞，在激光共聚共焦显微镜下拍摄标记有荧光素的细胞，在流式细胞仪上分析所培养的细胞。结果：该细胞直径在10－20μm，培养14天后，CD1a^ 48%,CD83^ 97%,CD40^ 33%，人体主要组织相容性复合物（MHC）Ⅱ^ 95%,CD80^ 98%,CD86^ 93%,CD83是DC的成熟标记。结论：该方法是一种可靠的诱导和培养DC的方法，对于乳腺癌患者还可通过动员等措施进一步提高DC的分离率。     

人外周血单核细胞体外诱导树突状细胞及鉴定

目的：建立从人外周血单核细胞体外诱导培养树突状细胞（dendritic cell,DC)的方法。方法：分离人外周血单个核细胞,以细胞因子粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）,白细胞介素－4（IL－4）,肿瘤坏死因子α（TNF－α）诱导培养获得DC,电镜及共聚集显微镜观察其形态,流式细胞术检测细胞表面抗原,体外同种混合淋巴细胞反应检测DC刺激T细胞的增殖活性。结果：从正常外周血分离得到的单核细胞,体外经重且人GM－CSF,IL－4,TNF－α的共同诱导培养,得到大量成熟DC,形态学观察可见典型DC特征,荧光激少在细胞分离器（FACS）检测表明,诱导的DC高表达HLA－DR（96％）,CD83（94．2％）,CDla(94.2%)分子,同时也高表达CD40（97．7％）,CD80（98．2％）分子,同种混合淋巴细胞反应显示,诱导的DC具有很强的激发同种T细胞增殖的能力。结论：人外周血单核细胞体外经细胞因子贯序诱导培养,可以生成大量功能成熟的DC,为进一步开展DC的基础研究和临床应用提供了可能。     

小鼠骨髓来源的树突状细胞体外扩增与鉴定

目的改进目前体外大量扩增树突状细胞(DC)的方法,以获得大量高纯度的树突状细胞,从形态学和免疫表型等方面给予鉴定.方法用20 ng/ml重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)诱导小鼠骨髓细胞体外分化为树突状细胞,用相差显微镜观察形态学变化,进行扫描、电镜观察和FACS检测细胞表面分子.结果培养10 d,可获得大量典型DC,经流式细胞仪检测,DC表达表面分子CD11C、CD80、MHCⅡ.结论本实验方法可以获得大量高纯度的树突状细胞.     

人外周血树突状细胞的分离培养及鉴定

目的从外周血中分离单个核细胞 ,经体外诱导培养获取高纯度的树突状细胞。方法淋巴细胞分离液分离外周血的单个核细胞 ,经贴壁 2h后加入GM CSF、IL 4诱导 7天 ,观察细胞形态 ,用流式细胞仪检测其表面标志 ,采用混合淋巴细胞培养法检测其刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。结果经诱导生成的细胞具有典型的DCs形态特征 ,高表达CD83 、CD86和MHCⅠ、Ⅱ类分子 ,在体外能诱导强烈的同种异体淋巴细胞增殖反应。结论本研究所建立的经济、简便的从外周血获取大量成熟DCs的方法 ,为DCs的进一步研究奠定了基础。     

人外周血树突状细胞的体外分离、培养和表型鉴定

目的：建立从人外周血分离、纯化、培养树突状细胞的方法，研究细胞因子对树突状细胞体外增殖、分化成熟的影响。方法：取正常人外周血，经淋巴细胞分离液梯度分离，取中间白膜层细胞，通过贴壁处理，获得单个核细胞，加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）1μg／ml和重组人白细胞介素-4（rhIL-4）410ng／ml，体外培养7d后，加入肿瘤坏死因子α（TNF-α）促进其分化成熟。第8天收获悬浮细胞，用相差显微镜和电镜观察其形态，经树突状细胞（DC）单克隆抗体染色后用流式细胞仪进行表型测定。结果：从正常人外周血分离获得的单个核细胞经rhGM-CSF、rhlL-4和TNF-α联合作用1周左右获得大量高纯度树突状细胞，树突状细胞特征：悬浮生长；具有树突状或裙褶状突起；高表达HLA-DR、CD1a、CD80、CD83、CD86和低表达CD14。结论：用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α联合作用可以从人外周血诱导培养出大量的树突状细胞，经形态学观察及表型鉴定得以证实。该培养技术为进一步研究树突状细胞肿瘤疫苗的临床应用奠定了物质基础。     

Gamma射线照射对体外培养人树突状细胞表型的影响

目的：了解Gamma射线照射是否影响体外培养的人树突状细胞的表型。方法：利用含有重组的人GM－CSF（800U／ml)和IL－4（500U／ml)的RPMI 1640培养基从人的外周血单个核细胞（PBMC）诱生树突状细胞（DC）。在培养的第6d加入5mg/L的脂多糖（LPS）继续培养24h促使DC完全成熟，于第7d收获DC并分成2部分，一部分未经Gamma射线照射的DC用作对照组，另一部分的DC用30Gy剂量的Gamma射线照射。采用流式细胞仪分析DC的表面分子。结果：Gamma射线照射减少树突状细胞CD86，CD80和HLA－DR，尤其是CD86分子的表达（P＝0.0072)。结论：Gamma射线照射影响DC的表型。     

乳腺癌细胞抗原和自身淋巴结树状细胞对细胞因子诱导的杀伤作用研究

目的：从乳腺癌患者淋巴结中分离和定向诱导培养扩增树状细胞（DC），观察其经自身肿瘤细胞抗原冲击后对自身细胞因子诱导的杀伤细胞（（CIK）杀伤活性的影响。方法：取手术切除肿瘤周围转移的淋巴结，提取单个核细胞，将贴壁生长的细胞用细胞因子基因重组粒巨集落生长因子（rhGM-CSF)、基因重组白介素4(rhIL-4)、基因重组α－肿瘤坏死因子（rhTNF-α)联合诱导培养DC，然后艇自身肿瘤细胞抗原冲击DC并作用CIK，最后检测CIK杀伤3种靶细胞（自身乳腺癌细胞、K562和SGC－7901细胞）的活性。结果：乳腺癌患者转移淋巴结中的贴壁细胞，经细胞因子联合诱导培养，DC含量可达15．3％－37．0％，经自身肿瘤抗原冲击的淋巴结DC活化CIK，杀伤自身肿瘤细胞活性达71．3％，单纯CIK为37．0％，两者比较差异有显著性（P＜0．01），而对K562和SGC－7901细胞杀伤活性无明显差异，结论：肿瘤周围转移淋巴结贴壁细胞在体外能定向诱导扩增出大量DC；DC经自身肿瘤抗原冲击后能明显提高CIK对自身肿瘤细胞的杀伤活性。