VEGF165的载体构建、表达及其生物学活性

目的:构建血管内皮生长因子(VEGF)165原核表达载体,在大肠杆菌中表达,获得重组VEGF165,并通过细胞和鸡胚尿囊膜试验鉴定其生物学活性.方法: 本实验室保存的T-VEGF165质粒,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,将其克隆至原核表达载体pET28a( )中,获得含人VEGF165全序列基因的表达载体pET28a( )-VEGF165,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,对表达产物进行纯化,获得VEGF165蛋白.通过体外促进HUVEC细胞增殖及鸡胚尿囊膜血管增生实验鉴定其生物学活性.结果:成功构建了VEGF165蛋白的原核表达载体,表达纯化了VEGF165蛋白,经过细胞增殖试验及鸡胚尿囊膜血管增生实验,证明该蛋白具有良好的促进血管内皮细胞增殖的生物学活性.结论:成功地获得了人VEGF165重组蛋白,并证实了该蛋白具有促进血管内皮细胞增殖活性.     

猪和小鼠endoglin原核表达载体的构建及重组蛋白的诱导表达和纯化

目的:体外扩增猪和小鼠endoglin胞外段基因序列,构建猪和小鼠endoglin重组原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,并对表达产物进行分离、纯化和鉴定.方法:设计猪和小鼠endoglin胞外段基因序列的引物,利用RT-PCR技术扩增克隆猪和小鼠endoglin胞外段基因序列,通过限制性核酸内切酶酶切,然后用T7酶连接,构建猪和小鼠endoglin胞外段的原核表达质粒pQE-pEDG和pQE-mEDG.筛选的重组质粒经酶切和DNA序列测定等证实正确后,再转染感受态大肠杆菌JM109,用IPTG诱导表达.表达产物经Ni-NTA亲合层析进行分离纯化,最后用SDS-PAGE和免疫印迹法进行鉴定.结果:琼脂糖凝胶电泳发现扩增克隆的猪和小鼠endoglin胞外段基因序列分子量大小和预期值相一致,酶切分析显示,pQE-pEDG和pQE-mEDG和预期值相符,DNA序列测定显示,目的基因片段和阅读框架正确无误.重组蛋白质在大肠杆菌中获得稳定表达,表达的重组蛋白分子量与预期值相一致,纯化的蛋白浓度达90%以上,抗小鼠endoglin抗体可特异性识别pEDG和mEDG.结论:成功构建了猪和小鼠endoglin的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达并纯化,为进一步了解重组endoglin蛋白质作为疫苗是否可以有效诱导产生抗自身endoglin的免疫反应奠定了基础.     

高纯度可溶性嵌合蛋白VEGI+的表达纯化

目的:制备纯化的新型血管生长抑制剂可溶性嵌合蛋白VEGI ,为进一步研究其活性奠定基础.方法:应用PCR方法制备血管内皮细胞生长抑制因子(VEGI)与寡肽CTTHWGFTLC相嵌合的融合基因VEGI ,将PCR产物克隆至pGEM-T载体中,经酶切及测序鉴定后,与原核表达载体pET30a( )重组,构建重组表达载体pET30a-VEGI ,转化大肠杆菌BL21并诱导表达,纯化并鉴定表达产物.结果:成功扩增融合基因VEGI ,构建的重组质粒pET30a-VEGI 酶切鉴定结果与预期一致,诱导后表达产物以包涵体为主.SDS-PAGE电泳及Western印迹结果表明,复性纯化后的嵌合蛋白VEGI 相对分子质量约为23 000,纯度约为90%.结论:成功构建了重组表达载体,并在大肠杆菌诱导表达,亲和层析纯化后获得纯度较高的可溶性嵌合蛋白VEGI .     

霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的 构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）的融合表达载体。并在原核细胞中表达，为霍乱弧菌肠毒素A亚基（CTA）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法 以霍乱弧菌DNA为模板．PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因，与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组，构建重组质粒．转化大肠杆菌BL21（DE3），并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后，以IPTG诱导表达Trx—CTA融合蛋白，用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明，我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因，成功构建了重组质粒pET—ctxA，经SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论 霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

嗜肺军团菌flaA部分基因的克隆及其原核表达

目的克隆表达嗜肺军团菌的鞭毛亚单位蛋白flaA部分基因,并纯化重组蛋白。方法以嗜肺军团菌I型DNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增鞭毛亚单位蛋白flaA部分基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET32a(+),构建原核表达重组质粒pET-flaA。经PCR和限制性核酸内切酶鉴定及测序分析后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳分析,用亲和层析法纯化其表达蛋白。结果扩增出嗜肺军团菌606bp的flaA部分基因,构建的重组质粒pET-flaA表达并纯化出42 kDa融合蛋白质。结论成功构建嗜肺军团菌flaA部分基因的原核表达载体,在原核系统中得到了高效表达。     

人乳头瘤病毒18型E2基因的原核表达载体构建与表达

目的 将人乳头瘤病毒18型(Human papillomavirus 18, HPV18) E2基因插入到原核表达载体pET28a( )T7启动子下游,构建原核表达载体pET28a( )-HPV18E2,原核表达并纯化HPV18E2蛋白,为研究HPV18 E2蛋白相关疫苗奠定实验基础.方法 1)以HPV18型基因组DNA为模板,运用聚合酶链反应扩增E2基因,将其插入到原核表达载体pET28a( )中,构建重组表达质粒pET28a( )-HPV18E2;2) PCR、限制性内切酶切分析以及核酸序列测定重组质粒pET28a( )-HPV18E2的正确性;3)将重组表达质粒pET28a( )-HPV18E2转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达,经镍螯合亲和层析胶体纯化HPV18E2蛋白;4)十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定HPV18E2蛋白的正确表达.结果 1) PCR、限制性内切酶切分析和核酸序列分析鉴定证实了重组表达质粒pET28a( )-HPV18E2的成功构建;2) SDS-PAGE电泳分析, HPV18E2蛋白在大肠杆菌BL21中表达量占菌体总蛋白的21%,纯化后的蛋白纯度大于90%;经Western blot鉴定,显示HPV18E2蛋白与标签蛋白(6xHis)形成相对分子质量约42KD的蛋白,与理论预计值相符.结论 1)成功构建了原核表达载体pET28a( )-HPV18E2;2)原核表达获得了HPV18E2蛋白.     

小鼠原核表达载体pQE30/FGFR-1的构建及表达鉴定

目的构建小鼠FGFR—1胞外段基因重组原核表达载体pQE30／FGFR—1，并在大肠杆菌JM109中表达。方法利用RT—PCR技术．从胚肝中扩增出小鼠的FGFR—1胞外段基因的cDNA，用内切酶消化后插入原核表达质粒pQE30中。经琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定后，体外转化大肠杆菌，用RT—PCR和免疫印迹方法鉴定，同时利用Ni—NTA琼脂柱层析法纯化复性重组蛋白。结果琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定证实PCR扩增的cDNA及构建的重组原核表达质粒pQE30一FGFR—1正确，并在大肠杆菌中正确表达。经纯化后，进行SDS—PAGE电泳显示得到1条分子量约40kDa的蛋白质条带。结论成功构建小鼠原核表达载体pQE30／FGFR—1并在大肠杆菌中有效表达，纯化后获得具有活性的重组蛋白质。     

利用重组人VEGF165制备单克隆抗体的研究

目的：制备抗重组人血管内皮生长因子（VEGF）165单克隆抗体。方法：构建人VEGF165原核表达载体pET-3a/VEGF165,并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化表达产物。用初步纯化的rhVEGF165免疫小鼠制成杂交瘤细胞,小鼠腹腔接肿,收集腹水纯化后制成抗rhVEGF165单克隆抗体。结果：VEGF165诱导的内皮细胞增殖可被本研究制备的单克隆抗体中和,并表现出较好的剂量依赖关系。结论：本研究利用DNA重组技术制备人VEGF165,并利用它进一步制备了抗重组人VEGF165单克隆抗体。     

人VEGF基因杆状病毒表达载体的构建及生物学活性鉴定

目的构建含人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因的杆状病毒表达载体,并对其表达产物的生物学活性进行测定。方法用HindⅢ对pcDNA3.1/VEGF进行酶切,回收575 bp的VEGF片段;pFast a载体用HindⅢ酶切回收,与VEGF片段连接。NcoI酶切鉴定方向,得到正向连接重组载体pFast/VEGF;将其转化DH10BAC感受态细胞,经卡那霉素、四环霉素、庆大霉素及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒载体pBacmid-Fa-VEGF,PCR扩增鉴定得到单一VEGF条带。将该病毒载体转染sf9细胞,用噬斑筛选及SDS-PAGE和Western blot检测VEGF表达,并通过MTT法检测VEGF促内皮细胞生长活性。结果病毒液在稀释到10-7时出现噬斑,Western blot检测出现单一条带,MTT检测促内皮细胞生长率为19.44%。结论成功构建了含VEGF基因的杆状病毒表达载体,且表达产物具有显著的促内皮细胞生长作用。     

利用重组人VEGF165制备单克隆抗体的研究

目的 :制备抗重组人血管内皮生长因子 (VEGF) 16 5单克隆抗体。方法 :构建人 VEGF16 5原核表达载体 p ET- 3a/ VEGF16 5 ,并使其在大肠杆菌中高效表达 ,纯化表达产物。用初步纯化的rh VEGF16 5免疫小鼠制成杂交瘤细胞 ,小鼠腹腔接种 ,收集腹水纯化后制成抗 rh VEGF16 5单克隆抗体。结果 :VEGF16 5诱导的内皮细胞增殖可被本研究制备的单克隆抗体中和 ,并表现出较好的剂量依赖关系。结论 :本研究利用 DNA重组技术制备人 VEGF16 5 ,并利用它进一步制备了抗重组人VEGF16 5单克隆抗体。     

hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的: 构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。 方法: 以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。 结果: 经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L^-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。 结论: 成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。     

刚地弓形虫肌动蛋白profilin的原核表达和纯化

目的：探讨刚地弓形虫肌动蛋白profilin （TgPRF）的原核表达体系和纯化条件,为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究提供依据。方法：以弓形虫RH株速殖子的cDNA为模板,采用一对特定的引物扩增TgPRF基因的编码区。PCR产物双酶切后克隆入pET28a （+）载体中。重组的pET28a （+）-TgPRF质粒转化E.coli DH5α感受态细胞。双酶切鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）表达菌,经IPTG诱导表达4 h,SDS-PAGE法检测TgPRF蛋白的表达,Western blotting法检测重组蛋白His-prolilin的表达。结果：PCR扩增产物长度为492 bp。经双酶切和测序,重组质粒pET28a-TgPRF连接产物构建成功。SDS-PAGE检测,目的蛋白在超声菌液的上清中表达。经Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化,获得纯化的TgPRF蛋白（纯度>90%）。Western blotting检测,重组TgPRF蛋白能被Anti-His抗体识别。结论：成功构建重组质粒pET28a-TgPRF,并实现可溶性原核表达。     

EGFL7原核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建类表皮生长因子域7（EGFL7）原核表达载体,并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白。【方法】以人肝癌细胞系 HepG2总RNA为模板,PCR扩增 EGFL7基因,克隆至原核表达载体pET‐21a（＋）中,转化大肠杆菌 BL21（DE3）,IPTG 诱导表达。 His‐tag 磁珠纯化重组蛋白 EGFL7,SDS‐PAGE 鉴定。【结果】克隆目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒pET21a（＋）‐TRX‐EGFL7经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子量为80kD ,与预期相符。【结论】成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化了EGFL7重组蛋白,为后续研究奠定了基础。     

Nogo-66蛋白氨基酸肽的克隆及在原核细胞的表达

目的: 克隆编码Nogo-66氨基酸多肽基因,构建原核重组表达载体,并诱导其在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。方法: 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增出编码Nogo蛋白环外-66氨基酸多肽基因,将其克隆于T载体PMD18-T,酶切鉴定后再亚克隆于原核表达载体pET-42a(+),酶切及测序证实序列正确后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白-Nogo-66。结果: 克隆了编码Nogo蛋白环外-66氨基酸多肽基因,构建了融合蛋白的重组表达质粒,融合蛋白的表达随着时间延长增加。结论: 获得了编码Nogo蛋白环外-66氨基酸多肽基因及其原核表达产物,对研究Nogo蛋白的生物学功能及其mAb的制备奠定基础。     

GST-SRY融合蛋白原核表达和纯化

目的 构建GST-SRY融合蛋白原核表达载体, 在E.coli中诱导其表达, 并进行纯化.方法 PCR扩增SRY基因, 将SRY基因插入原核表达载体p GEX-6P-1, 经酶切和测序验证后, p GEX-6p-1-SRY转化到原核表达菌株E.coli Rosetta DE3, IPTG诱导表达GST-SRY融合蛋白, 用GST标签纯化树脂对其进行纯化.结果 经双酶切和测序证实p GEX-6P-1-SRY构建正确.重组质粒转化到Rosetta DE3经IPTG诱导后表达了分子质量单位约为49 KD的重组蛋白.结论 p GEX-6P-1-SRY原核表达载体构建成功, SRY蛋白成功诱导表达并纯化, 为今后深入研究SRY蛋白的功能奠定了实验基础.     

鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化

目的:克隆小鼠HMGB1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化获得His-HMGB1的融合蛋白.方法:脂多糖刺激后的RAW264.7细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增出含HMGB1的目的片段,克隆于pMD-19T载体,再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后行SDS-PAGE鉴定目标蛋白表达,用镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化含His-标签肽的目的蛋白.结果:经PCR扩增出大小为648 bp的HMGB1基因片段,成功构建目标蛋白的融合表达载体,经诱导表达及分离纯化,获得了约30 kD的融合蛋白.结论:构建HMGB1的融合表达载体,获得分离纯化融合蛋白His-HMGB1,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

血管内皮生长因子在大肠杆菌中表达?提纯及功能测定

目的:利用细菌表达系统合成大量重组血管内皮生长因子(VEGF)蛋白.方法:将VEGF165 cDNA克隆于表达载体PET-32a( )后转染BL-21株表达重组VEGF蛋白,用分离His蛋白的层析柱提纯重组VEGF蛋白.结果:重组VEGF蛋白经氨基酸序列测定证实.Western blot测定发现His蛋白.功能测定发现重组VEGF蛋白可阻断细胞表面Neuropilin-1的表达.结论:上述表达系统制备大量具有生物活性的重组VEGF蛋白     

血管生成抑素的原核表达及纯化

目的：构建血管生成抑素（angiostatin)的原核表达载体。并转入大肠杆菌BL21中诱导表达并纯化。方法：设计引物扩增angiostatin的cDNA,然后亚克隆入原核表达载体pET32a,并转化入大肠杆菌BL21中诱导表达。结果：通过重组质粒酶切和测序分析等方法,筛选出重组阳性克隆,转化入大肠杆菌BL21中诱导表达,并纯化成功。结论：通过构建的原核表达。获得了纯化的angiostatin蛋白。     

人肿瘤蛋白D52重组融合蛋白的原核表达及特性鉴定

目的:表达人肿瘤蛋白D52(human tumor protein D52,hTPD52)的重组融合蛋白,并对该蛋白的生物学特性进行鉴定?方法:RT-PCR扩增乳腺癌MCF-7细胞中的hTPD52基因并克隆于pMD18-T载体中,测序鉴定序列正确后,分别插入pET-32a?pGEX-4T-2和pET-28a 3种表达载体中?重组质粒经酶切鉴定?序列分析正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),选择最佳表达载体和表达条件进行大量表达,表达产物经His柱亲和纯化和超滤浓缩后,应用Dot blot?Western blot鉴定纯化蛋白的特性?结果:正确扩增出了hTPD52基因,鉴定其为isoform 3型?用pET-32a-hTPD52重组表达载体能够大量表达可溶性的hTPD52-Trx融合蛋白,Dot blot显示表达的融合蛋白能和抗hTPD52的抗体结合,SDS-PAGE和Western blot显示表达的融合蛋白分子质量约为44 ku,去除Trx后仍能够与特异性抗体结合?结论:成功制备hTPD52重组融合蛋白,并证明原核表达的hTPD52保留了原有的抗原结合活性?