慢性乙型肝炎病人外周血树突状细胞的功能研究

目的 比较慢性乙型肝炎病人外周血及正常人外周血两种来源的树突状细胞(dendritic cell，DC)表型及功能上的差异。方法 从慢性乙型肝炎病人及正常人外周血分离单个核细胞，在含有粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)白细胞介素4(IL-4)肿瘤坏死因子α(NFFα)的无血清培养基AVI-M中培养。流式细胞仪检测其表型，并采用MLR方法检测树突状细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果 慢性乙型肝炎病人外周血单核细胞经诱导可获得成熟的树突状细胞，但CD80表达较正常人低，刺激同种异体T细胞增殖能力低于正常人。结论 慢性乙型肝炎病人的外周血来源的树突状细胞的功能较正常人低。     

慢性乙型肝炎病人树突状细胞体外培养的实验研究

目的　从慢性乙型肝炎 (CHB)病人外周血单个核细胞 (PBMC)体外诱导培养树突状细胞 (DCs) ,探讨DCs在CHB特异性免疫耐受中的作用 ,为治疗运用提供实验物质基础。方法　 10例CHB病人外周血 15ml,分离PBMC后在体外培养条件下 ,加入粒单核巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)和白介素 4 (IL 4 ) ,诱导DCs增殖分化。透射电镜分析DCs细胞形态学 ,流式细胞仪检测其表型分子的表达。结果　①经本实验体系从CHBPBMC可诱导DCs生成量为每 15ml(1.2～ 4 .7)× 10 6,透射电镜证实呈典型的DCs细胞形态学 ;②DCs表型分子呈极低表达 ,分别为CD83(8.0 2± 3.99) %、CD80 (8.77± 2 .0 6 ) %和MHC DR(14 .0 5± 2 .6 6 ) %。结论　CHB病人PBMC经GM CSF和IL 4混合细胞因子培养体系能诱导一定量DCs产生 ,表现为典型的树突状细胞形态 ,但表型分子表达低下 ,处于非成熟状态。     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞免疫功能的研究

目的　研究慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞 (DC)表面分子HLA -DR、CD1a、CD80 、CD86表达水平及其与DC免疫功能的相关性。方法　临床确诊的慢性乙型肝炎轻度患者 1 0例 ,从其外周血中分离单个核细胞 ,体外培养扩增DC ,流式细胞仪检测DC表型HLA -DR、CD1a、CD80 、CD86。以健康成人 1 0例作为对照。结果　慢性乙型肝炎患者DC表面HLA -DR、CD1a、CD80 、CD86分别为 :48.63± 6.34,2 7.73±7.1 9,2 1 .0 5± 8.33,1 8.5 8± 5 .5 1 ,明显低于对照组 :83.1 1± 6.46,5 2 .80± 1 1 .70 ,36.1 1± 7.5 5 ,40 .83± 5 .48,两者相比差异显著 (P <0 .0 0 1 )。结论　慢性乙型肝炎患者外周血DC表面HLA -DR、CD1a、CD80 、CD86表达水平下降 ,并与DC免疫功能低下密切相关     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞功能状态与乙型肝炎病毒载量的关系

目的探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血树突状细胞功能状态与乙型肝炎病毒（HBV）载量的关系。方法采集23例CHB患者和8例健康人的抗凝外周静脉血，分离外周血单个核细胞（PBMCs），在重组人白细胞介素4和重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的作用下培养使DCs增殖、成熟，以间接免疫荧光流式细胞技术分别检测DCs表面CD8O、CD86、HLA-DR及ICAM-1的表达；以ELISA法检测DCs培养上清液中IL-12的水平；将培养成熟的DCs与HBsAg共同孵育，用丝裂霉素C处理后再与自体PBMCs共同培养，在培养结束前12h加入OH-TDR，收集细胞，以β液闪计数仪测定cpm值；同期用定量聚合酶链反应技术测定CHB患者外周血HBV载量。结果23例患者DCs表面CD86、HLA-DR和ICAM-I的表达水平，DCs的抗原提呈能力及其分泌IL-12的水平均显著低于健康对照组：CD80、CD86、HLA-DR及ICAM-1的表达与HBV载量呈显著负相关关系（分别为P〈0.01，P〈0.01．P〈0.001和P〈0.001）；DCs的抗原提呈能力及其分泌IL-12的水平也与HBV载量呈显著负相关关系（分别为P〈0.001和P〈0.01）。结论CHB患者外周血DCs的成熟和功能存在障碍，DCs的功能状态与血液中HBV的载量密切相关，并可能对HBV的清除产生重要的影响。     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的分离培养及功能研究

目的　研究慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞 (DC)免疫诱导T淋巴细胞增殖的能力及其与DC免疫功能的相关性。方法　慢性乙型肝炎患者 1 0例 ,从外周血中分离单个核细胞 ,在含rhGM -CSF、rhIL - 4、TNF -α的完全培养基中诱导培养为DC ,并与同种异体T细胞作用 ,用液体闪烁仪观察DC对T细胞增殖的作用。另选取健康成人 1 0例作为正常对照。结果　慢性乙型肝炎患者组DC其诱导同种异体T淋巴细胞增殖的能力每分钟液闪计数 (cpm为 1 0 635± 876) ,明显低于正常对照组 (cpm为 42 91 8±7889,P <0 .0 1 )。结论　慢性乙型肝炎患者外周血DC免疫功能低下     

慢性乙型肝炎外周血树突状细胞的功能障碍机制的初步探讨

目的:探讨慢性乙型肝炎者树突状细胞(DCs)的功能状态及机制。方法:以直接荧光法进行表型分析、CCK8法测定DCs对同种异体淋巴细胞的刺激作用、AnnexinV/FITC法测定细胞凋亡率进行分析。结果:慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞经诱导分化形成的DCs,与正常人相比,表达协同刺激分子CD80、CD86水平均较低;刺激同种异体淋巴细胞增殖能力也低于正常人;DCs凋亡率明显增高。结论:慢性乙型肝炎患者外周血的DCs免疫功能处于抑制状态,而HBV感染导致的DCs凋亡增多可能是引起DCs功能障碍的原因之一。     

干扰素治疗慢性乙型肝炎对改善外周血树突状细胞功能的作用

目的探讨干扰素治疗对改善慢性乙型肝炎病人外周血树突状细胞(DCs)功能的作用。方法分别采集23例慢性乙型肝炎病人干扰素治疗前和治疗满4mo时的抗凝外周静脉血，分离外周血单个核细胞(PBMCs)，在重组人白细胞介素4和重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的作用下培养7d使DCs增殖、成熟。以间接免疫荧光流式细胞技术检测DCs的表型；以ELISA法检测DCs单独培养上清液中IL—12的水平；用DCs与HBsAg共同孵育，丝裂霉素C处理后，再与自体PBMCs共同培养，加入^3H—TDR，收集细胞测定cpm值；同样以HBsAg刺激的DCs经丝裂霉素C处理后，再与自体PBMCs共同培养，用ELISA法检测上清液中IFN—γ和IL-5的水平。实验中以8例正常健康人作为对照。结果干扰素治疗4mo时慢性乙型肝炎病人DCs的增殖水平较治疗前显著提高，在相同培养条件下，细胞总量平均增加了2．8倍；DCs表面CD80表达水平在治疗前、后未见显著变化，而CD86，HLA—DR和ICAM—1的表达在治疗前均显著低于对照组，治疗后的表达均较治疗前显著增加；治疗前DCs分泌IL—12的水平及DCs的抗原提呈作用均显著低于对照组，治疗后均显著增加，与对照组之间未见显著性差异；治疗前DCs刺激PBMCs分泌IL-5的水平显著低于对照组，治疗后较治疗前显著增加；而IFN—γ的分泌水平在干扰素治疗后略有下降，但与对照组相比未见显著性差异。结论慢性乙肝病人存在外周血DCs功能的缺陷，干扰素治疗能显著改善DCs的功能状态，促进DCs的增殖和成熟，增强DCs的抗原提呈作用，上调机体的体液和细胞免疫应答。     

体外负载HBeAg对乙型肝炎免疫耐受期患者树突状细胞功能的影响

目的探讨HBeAg对体外活化乙型肝炎免疫耐受期患者树突状细胞（DC）功能的影响。方法将24例患者分为HBV-1组（免疫耐受期）、HBV-2组（低或非HBV复制期）,并设正常对照组,自各组外周血单核细胞中诱导培养DC,经HBeAg体外负载后,分别检测各组负载前后的DC表型、DC在同种异体混合淋巴细胞反应中的刺激能力和细胞因子的分泌。结果（1）与其他两组比较,HBV-1组患者DC表面分子表达率降低、刺激同种异体T淋巴细胞增殖和分泌IL-12的能力较弱;（2）经HBeAg刺激后的DC表面分子表达率升高,3组间CD86、人类白细胞抗原-DR表达率无明显差异,HBV-1组患者DC的CD80表达率较其他两组降低（P〈005）;（3）混合淋巴细胞反应实验显示,HBeAg负载的DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力增强,在DC：T比例为1：5、1：10、1：20时,各组之间的刺激指数无明显差异;（4）HBeAg负载后的DC分泌IL-12水平较负载前明显增高,3组间细胞因子水平无明显差异。结论免疫耐受期乙肝患者存在DC成熟障碍和功能缺陷,HBeAg体外负载可提高DC功能,从而可能对增强免疫耐受期患者的HBeAg特异性免疫应答具有重要作用。     

表面抗原调节慢性乙肝患者树突状细胞免疫功能的研究

目的研究表面抗原（HBsAg）对慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血树突状细胞（DC）免疫功能的调节作用。方法采用体外细胞培养的方法培养30例CHB患者外周血DC,分为HBsAg组和无HBsAg组,培养7d后用流式细胞术检测各组DC的CD83及CD86的表达,MTT法检测DC对混合淋巴细胞的刺激作用,ELISA方法检测培养上清中IL-12及IL-6的含量。结果 HBsAg组CD83、CD86的表达量分别为（19±4）%和（49±9）%,无HBsAg组则分别为（12±4）%和（18±6）%（P均〈0.01）。HBsAg组和无HBsAg组的DC对混合淋巴细胞的刺激指数分别为（20±10）%和（7±4）%（P〈0.01）。HBsAg组的DC培养上清中IL-12、IL-6的含量分别为（111±68）ng/ml和（646±426）ng/ml,无HBsAg组分别为（38±12）ng/ml和（1843±235）ng/ml,差异均有统计学意义（P均〈0.01）。结论 HBsAg可增强CHB患者外周血DC提呈抗原、激活T淋巴细胞的功能,对DC分泌细胞因子的功能有调节作用。     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞PD-L1表达的相关研究

目的：探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血树突状细胞（DCs）的PD—L1表达水平，及其对DCs刺激T细胞增殖的影响。方法：采集22例慢性HBeAg阳性CHB患者、8例急性恢复期乙型肝炎（AHB）患者和10例健康人（NC）的外周血，分离单个核细胞（PBMC）并诱导DCs的增殖和活化。相对荧光定量PCR测定DCs的PD—L1、PD—L2分子mRNA水平，流式细胞术测定DCs表面PD—L1和PD—L2的表达率。同时，测定外周血DCs刺激同种异体反应性T细胞增殖的能力，及抗PD—L1单抗对CHB组DCs刺激功能的影响。结果：体外成功诱导了外周血DCs的增殖和成熟。与NC组相比较，CHB组和AHB组患者外周血DCs内PD—L1的mRNA水平均显著增高（P均〈0．05），但CHB组和AHB组间差异无统计学意义。CHB组患者外周血DCs表面PD—L1表达率较AHB组、NC组均有明显增高（P均〈0．01）。而外周血DCs的PD—L2 mRNA水平及PD—L2在DCs表面的表达率在各实验组之间无明显差异（P均〉0．05）。CHB组外周血DCs刺激T细胞增殖的功能较AHB组和NC组明显降低（P均〈0．01），抗PDL1抗体能显著增强CHB患者DCs刺激T细胞反应的能力。CHB患者外周血DCs表面PD—L1表达率与血清HBV病毒载量成正相关（r=0．34，P=0．007）。结论：外周血DCs表面PDL1表达水平在慢性HBeAg阳性乙肝患者明显升高，抗PD—L1抗体可有效增强CHB患者外周血DCs刺激T细胞增殖反应的能力，表明PD—L1的高表达可能与T细胞免疫反应低下和HBV病毒高复制密切相关。     

干扰素α治疗对慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞抗原提呈作用的影响

目的　探讨干扰素α治疗对慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞 (DC)抗原提呈作用的影响。方法　分别采集 2 3例慢性乙型肝炎患者干扰素α治疗前和治疗满 4个月时的抗凝外周静脉血 ,分离外周血单个核细胞 (PBMC) ,在重组人白细胞介素 4和重组人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子的作用下培养 7d使DC增殖、成熟 ,随后与HBsAg共同孵育 3h ,丝裂霉素C处理后再分别与自体PBMC共同培养 72h ,培养结束前 1 2h加入 7 4× 1 0 4Bq3 H TDR ,收集细胞测定cpm值。实验中以 8名正常健康人作为对照。结果　干扰素α治疗 4个月时慢性乙型肝炎患者DC的增殖水平明显高于治疗前 ,在相同培养条件下 ,细胞总量平均增加了 2 .8倍 ;治疗前DC的抗原提呈作用显著低于健康对照组和治疗后组 (均为P <0 .0 0 1 ) ,治疗 4个月时DC的抗原提呈作用与健康对照组之间差异无显著意义 (P >0 .0 5 ) ;进一步分析发现 ,与无应答组比较 ,完全应答组不论是治疗前还是治疗后 ,DC的抗原提呈作用均显著增强 (P <0 .0 1和P <0 .0 0 1 ) ,而部分应答组与无应答组之间差异无显著意义(P >0 .0 5 )。结论　慢性乙型肝炎患者外周血DC的抗原提呈能力低下 ,干扰素α治疗可显著提高DC的抗原提呈作用 ,并且DC的抗原提呈能力似乎与患者对干扰素α的应答密切相关     

慢性乙型肝炎合并肝癌患者树突状细胞负载乙型肝炎病毒抗原后表型和功能的研究

目的研究慢性乙肝合并肝细胞癌(HCC)患者外周血髓样树突状细胞(mDC)负载乙型肝炎病毒(HBV)抗原后表型和功能的变化。方法用成分血分离机采集21例肝细胞癌患者和4名健康人的外周血单核细胞(PBMC),用无血清AIMV培养基加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和白细胞介素(IL)4等因子诱导mDC分化、发育和成熟,同时加入HBcAg或HBsAg致敏mDC,通过流式细胞仪分析mDC表面分子的表达,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测mDC培养上清中IL12、IL10的含量,通过自体混合淋巴细胞反应(AMLR)比较抗原致敏后mDC刺激淋巴细胞增殖的能力。结果在肝细胞癌患者中,(1)经HBcAg致敏的mDC表面分子CD80、CD86、CD40、HLADR的表达率(55%±26%、80%±13%、70%±13%、73%±24%)明显高于无抗原致敏组mDC(29%±25%、35%±18%、44%±26%、45%±23%,P<005);经HBsAg致敏的mDC仅HLADR的表达率(63%±15%)高于无抗原致敏组(45%±23%,P<005),其他表面分子差异无统计学意义。(2)在AMLR中经HBV抗原致敏的mDC刺激淋巴细胞增殖的能力明显高于无抗原致敏组(P<005),而且HBcAg的致敏效果优于HBsAg的致敏效果(P<005)。(3)经HBcAg致敏的mDC分泌IL10和IL12的量(236pg/ml±95pg/ml,733pg/ml±212pg/ml)明显高于经HBsAg致敏的mDC(35pg/ml±9pg/ml,135pg/ml±63p     

猪苓多糖对慢性乙型肝炎患者单核细胞源树突状细胞的影响初探

目的 探讨猪苓多糖（PPS）对慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血单核细胞源树突状细胞（MoDC）的影响。方法 从CHB患者外周血中分离出单核细胞（Mo）,然后将Mo与GM-CSF、IL-4体外培养9天,并于培养第6天加入PPS共同培养,在倒置显微镜下观察DC的形态,用MTT法测定DC刺激同种异体T细胞增殖的能力,用ELISA检测DC培养上清中IL-12p40＋p70的含量,并与对照组比较。结果 PPS可刺激DC分泌IL-12p40＋p70,增强DC刺激同种异体T细胞增殖的能力。结论 PPS可以增强CHB患者外周血MoDC的免疫功能,提示其可能通过调节DC的功能参与免疫应答。     

抗HBV-DC治疗e抗原阴性慢性HBV感染者的初步临床研究

目的:观察HBsAg致敏患者自体外周血单个核细胞(PBMC)来源的树突状细胞(DC)(简称抗HBV-DC)治疗e抗原阴性慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者的临床效果。方法:4例轻度慢性乙型肝炎(CHB)患者、5例慢性HBV携带者及17例非活动性HBsAg携带者接受临床试验。检测治疗前后HBV标志物定量、HBV-DNA定量及肝功能,两次检测平均间隔40d。结果:治愈5例,好转21例,有效率为100%,治愈率19.23%。治疗前后HBsAg分别为(129.58±112.68)ng/ml和(42.67±51.41)ng/ml(t=5.57,P<0.001),平均下降68%,5例HBsAg转阴。7例治疗前HBV-DNA定量高于正常,为(2.17±5.27)×106copies/ml,治疗后6例下降,其中,5例降为正常,1例升高0.49log;原1例HBV-DNA定量正常者升高到1.30×103copies/ml。治疗前后ALT分别为(30.04±19.99)U/L和(40.50±45.10)U/L,有升高趋势(t=1.75,P=0.09),HBsAb、HBeAb、HBcAb及TBIL无显著变化。结论:抗HBV-DC静脉回输可显著降低并清除HBsAg,抑制e抗原阴性慢性HBV感染者的病毒复制,减少病毒载量,清除病毒,彻底治愈慢性HBV感染者。CHB患者、慢性HBV携带者和非活动性HBsAg携带者均可对抗HBV-DC的治疗发生良好的应答反应,是一种安全、高效地治疗e抗原阴性慢性HBV感染者的方法,显示出良好的临床应用前景。延长疗程和增加治疗次数可望进一步提高治愈率。     

抗HBV-DC治疗慢性HBV携带者的初步临床研究

目的:观察HBsAg致敏患者自体外周血单个核细胞(PBMC)来源的树突状细胞(DC)疫苗(简称抗HBV-DC)治疗慢性HBV携带者的临床效果。方法:15例HBeAg阳性和5例HBeAg阴性的慢性HBV携带者接受临床试验。取外周静脉血25ml,用密度梯度离心及贴壁法获得单核细胞,以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)诱导扩增出DC,并予HBsAg致敏DC。第7天收获DC静脉回输,1次/周,共4次。治疗前后检测HBV标志物定量、HBV-DNA定量及肝功能。结果:治愈1例,好转18例,无效1例,总有效率为95%(19/20),治愈率5%(1/20)。结论:抗HBV-DC静脉回输可有效地抑制慢性HBV携带者的病毒复制,降低并清除病毒抗原,促进HBeAg/HBeAb的血清学转换,是一种安全、有效的治疗慢性HBV携带的方法。