Notch-1对大鼠嗅球成鞘细胞神经生长因子表达的影响

目的 观察Notch-1对嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)神经生长因子(nerve growth factor,NGF)表达的影响.方法 原代培养大鼠OECs,用有活性的Notch质粒(NotchICV),无活性的Notch质粒(NotchVK)以及空质粒分别转染OECs,将实验对象分成NotchICV转染组,NotchVK转染组和空白质粒组,应用免疫荧光双标、Western blot及RT-PCR技术,检测各组OECs中NGF及其mRNA的表达变化.结果 转染Notch-1后,OECs中NGF的表达明显增高.免疫荧光双标结果显示,NotchICV转染组OECs 中NGF的表达较NotchVK转染组和空白质粒组均明显增高(P<0.05);RT-PCR结果显示,NotchICV转染组OECs中NGF mRNA的表达(0.496 1±0.026 9)均高于NotchVK转染组(0.244 5±0.013 4)及空白质粒组(0.245 9±0.016 0)(P<0.01);Western blot结果显示,NotchICV转染组OECs中NGF的表达(0.887 5±0.016 6)均高于NotchVK转染组(0.686 2±0.059 2)和空白质粒组(0.682 1±0.067 0)(P<0.01).结论 Notch-1转染OECs后,其NGF的表达上调,提示Notch-1能增强OECs中NGF的合成.     

腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞成骨特性研究

目的 通过腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞(human marrow mesenchymal stem cells, hMSCs),观察被修饰细胞CTLA-4Ig蛋白表达情况,以及基因修饰对hMSCs诱导成骨特性的影响.方法 采用荧光显微镜观察腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染hMSCs的绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测确定转染率,观察对比转染前后细胞形态和细胞周期,用免疫细胞化学方法检测转染hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达,转染hMSCs成骨诱导培养3周后进行成骨特异性标记检测.结果 分离培养的hMSCs CD105表达阳性, CD34表达阴性.重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hMSCs的转染率为81.14%, CTLA-4Ig基因转染hMSCs(CTLA-4Ig-hMSCs)的形态无明显变化,生长良好.免疫细胞化学结果显示,CTLA-4Ig-hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达阳性,诱导培养3周的CTLA-4Ig-hMSCs,碱性磷酸酶染色呈强阳性,免疫细胞化学检测骨钙素表达阳性,钙的四环素荧光标记法显示细胞间有钙的沉积.结论 腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hMSCs能够分泌CTLA-4Ig蛋白,并保持了成骨分化潜能,可用于异基因hMSCs作为骨组织工程种子细胞的应用研究.     

牛坐骨神经内源性抑制物对体外培养DRG细胞分化的影响

目的　在新生牛坐骨神经提取对背根神经节 (dorsalrootganglia,DRG)细胞存活和突起生长有抑制活性的物质 .方法　原代培养 DRG细胞 ,实验组分别以不同浓度加入前一实验证实对 PC12细胞有抑制活性 ,Mr5 0 0 0～ 10 0 0 0之间的新生牛坐骨神经提取液 ,对照组中加入培养液 . 48h后进行MTT细胞活性测定、总蛋白含量测定以及观察细胞突起生长情况 .结果　实验组加入提取液蛋白浓度为 2 0 m g· L- 1 ,40mg· L- 1时 ,DRG细胞的活性、总蛋白含量以及突起的生长无明显变化 ;当提取液的浓度为 80 mg· L- 1 ,16 0 mg· L- 1时 ,DRG细胞胞体皱缩 ,突起生长缓慢、停滞 ,细胞活性和总蛋白含量明显减低 .对照组的 DRG细胞生长良好 .结论　新生牛坐骨神经内存在一种对体外培养的 DRG细胞存活及突起生长有抑制作用的物质 .     

自噬基因Beclin1对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 观察自噬基因Beclin 1在人卵巢癌细胞株SKOV3中过表达对肿瘤细胞在体内、体外生长活性的影响.方法 脂质体法将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染人卵巢癌细胞株SKOV3,MTT法分析外源性Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,流式细胞仪检测转染后肿瘤细胞的凋亡及自噬情况.将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后,接种到裸鼠皮下,观察体内致瘤活性及生长情况;免疫组化检测瘤组织Beclin1蛋白的表达.结果 Beclin 1在SKOV3中的过表达后抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.68%;pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3的凋亡率为(21.26±3.89)%,高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞MDC平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组.重组质粒pcDNA3.1/Beclin1使SKOV3细胞在裸鼠体内成瘤时间延长,瘤体体积及质量明显小于空质粒组和空白对照组,抑瘤率为50.27%.结论 自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可抑制SKOV3在体内、体外的增殖,针对自噬基因Beclin1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性.     

沉默HERC4表达可抑制宫颈癌细胞的增殖、凋亡和迁移

目的 探讨HERC4对宫颈癌细胞生物学功能的影响及其分子机制.方法 设计特异HERC4siRNA干扰序列,Lipofectamine2000法转染Hela细胞,Western blotting检测转染特异siRNA后Hela细胞HERC4蛋白的表达水平;CCK-8法检测转染后Hela细胞的增殖能力;Annexin V-FITC/PI双染法检测转染后Hela细胞凋亡率的变化;划痕实验检测转染后Hela细胞迁移能力.Western blotting检测转染后Hela细胞CyclinD1、Bcl-2表达变化.结果 转染特异siRNA后Hela细胞HERC4蛋白表达量明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组相比,干扰组Hela细胞生长速度明显减慢,细胞凋亡率增加,迁移能力明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01).转染后Cyclin D1和Bcl-2在蛋白水平的表达显著下调(P＜0.01).结论 siRNA可有效降低宫颈癌Hela细胞中HERC4的表达,并通过抑制Cyclin D1表达抑制宫颈癌Hela细胞的增殖和迁移能力,抑制Bcl-2表达增加细胞凋亡能力.     

YB-1表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响

目的:观察Y-盒结合蛋白-1(YB-1)对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响.方法:通过脂质体介导的方法将YB-1 shRNA重组载体转染入人类乳腺癌MCF-7细胞,经G418筛选及克隆化培养后获得稳定转染株.运用RT-PCR和蛋白质印迹方法检测MCF-7细胞中YB-1 mRNA和YB-1蛋白的表达水平,运用划痕实验和Transwell小室法检测细胞运动、迁移和侵袭能力的变化,同时运用RT-PCR和蛋白质印迹方法检测细胞中MMP-2的表达水平,并用明胶酶谱法检测MMP-2蛋白的活性.结果:稳定转染YB-1 shRNA的细胞中YB-1的表达明显低于转染随机片段的细胞和未转染组细胞,且细胞的运动、迁移和侵袭能力以及MMP-2的表达及活性也较后两组细胞明显下降.转染随机片段的细胞和未转染组细胞间无明显差异.结论:YB-1 shRNA可以沉默乳腺癌MCF-7细胞中YB-1的表达,并降低细胞的迁移和侵袭能力以及MMP-2的表达及活性.     

RNA干扰PTTG基因对泌乳素型垂体瘤细胞凋亡的机制研究

目的 研究RNA干扰垂体瘤转化基因(PTTG)对泌乳素型垂体瘤细胞(HPA)凋亡的影响并探讨其作用机制.方法 设计并合成靶定PTTG的特异性siRNA片段,转入体外培养HPA细胞,48h后验证siRNA的干扰效应;Annexin V/PI染色法观察PTTG基因沉默对细胞凋亡的影响;RT-PCR和Western blot检测caspase-3在mRNA和蛋白水平表达;caspase活性检测试剂盒检测caspase活性.结果 设计合成的PTTGsiKNA转染后,能够有效抑制体外培养HPA细胞内PTTG表达实现其基因沉默效应;经浓度梯度CDDP诱导24h,转染和未转染细胞均产生细胞凋亡,caspase-3表达增强,并呈现出浓度依赖性;RNA干扰组细胞凋亡率低于未转染组,转染组caspase-3活化受抑,其caspase-3基因表达、蛋白活性均低于未转染组(P<0.05).结论 PTTG在人泌乳素型垂体瘤中过表达,能通过激活caspase-3促进HPA细胞凋亡,可作为该肿瘤临床诊断和基因治疗的新靶点.     

VEGF-C-siRNA对人肺癌细胞A549生物学行为的影响

目的 初步探讨靶向VEGF-C基因的siRNA转染肺癌细胞A549后对其生物学行为的影响.方法 构建靶向VEGF-C的siRNA表达质粒并转染A549细胞,免疫印迹法检测蛋白的表达水平,Transwell小室检测细胞体外侵袭能力,MTT法检测细胞增殖活性.结果 成功构建靶向VEGF-C的siRNA表达质粒.VEGF-C-siRNA转染后的细胞侵袭能力较对照组减弱,生长抑制率明显高于阴性对照组(P＜0.01),且表现出时间依赖性.结论 靶向VEGF-C的siRNA转染后可以显著降低A549细胞侵袭能力,抑制肿瘤细胞增殖.     

BRCA1对MCF-7细胞hTERT基因表达的抑制作用研究

目的将BRCA1真核表达质粒转染人乳腺癌MCF-7细胞中,观察外源性BRCA1基因转染MCF-7细胞后对hTERT蛋白表达的抑制作用及对细胞增殖的影响.方法应用脂质体法将BRCA1真核表达质粒转染至乳腺癌MCF-7细胞中,Western blot检测转染细胞中hTERT蛋白表达的变化.MTF比色试验观察BRCA1真核表达质粒转染后MCF-7细胞增殖活性的变化.结果外源性BRCA1真核表达质粒组MCF-7细胞较未转染组MCF-7细胞hTERT蛋白表达明显减弱.BRCA1基因转染后的MCF-7细胞的增殖活性明显降低.结论外源性BRCA1基因的表达可以抑制人乳腺癌MCF-7细胞中hTERT基因的表达,并抑制MCF-7细胞的增殖能力.BRCA1基因的表达异常可能在乳腺肿瘤发生发展机制中具有重要的作用.     

ARLTS1基因重组质粒对卵巢癌细胞株SKOV3生长和凋亡的影响

目的 探讨Ras超家族成员ARLTS1基因对卵巢癌细胞株SKOV3生长及凋亡的影响.方法 构建真核表达质粒pCMV-Tag 3B-ARLTSI,并转染卵巢癌SKOV3细胞株,采用RT-PCR技术和Western blot方法检测ARLTS1基因转染组、空载体pCMV-Tag 3B转染组和未转染组中ARLTS1 mRNA及蛋白表达水平,用MTT及流式细胞仪检测各组细胞生长、周期及凋亡率等生物学行为的变化,Western blot检测细胞easpase-3和bcl-2蛋白表达水平的变化.结果 真核表达质粒pCMV-Tag 3B-ARLTSI转染SKOV3细胞后,经PCR和Western blot证实转染成功.ARLTSI转染SKOV3细胞后,细胞生长明显受抑(P<0.05).流式细胞术检测发现ARLTS1基因转染组与空载体转染组及未转染组细胞相比,S期细胞比例明显增多(P=0.035和0.011,细胞凋亡率(36.7%)显著高于另两组细胞(P均<0.001).ARLTS1基因转染组细胞中caspase-3和bel-2蛋白表达水平分别下降34.9%和47.7%,与未转染组细胞相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 ARLTS1基因转染后能抑制人卵巢癌细胞SKOV3的生长,调控SKOV3细胞周期,可能通过caspase途径促进肿瘤细胞凋亡·     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

睾丸支持细胞与骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

目的 观察睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养时SCs对MSCs扩增的影响. 方法 取雄性SD大鼠睾丸,分离出SCs,取SD大鼠,分离出骨髓MSCs,将两种细胞用"三明治"式的方法共培养7 d. 结果 共培养组的MSCs前四天生长较对照组快,第5天无明显差异,第6和第7天细胞数量迅速减少. 结论 在体外共培养的早期,SCs可以显著促进MSCs的生长,但在后期则反而抑制MSCs的生长,具体原因有待进一步研究.     

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的 从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法 分离新生豚鼠海马组织，用含碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白（Nestin）的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果 从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin；荧光染料的标记效率可达93．4％，细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论 从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .