食管癌细胞株中肿瘤干细胞样细胞的分离培养及生物学鉴定

目的:用无血清培养基方法从人食管癌细胞株KYSE-150?TE-1中分离富含肿瘤干细胞的细胞球并鉴定其生物学特性?方法:运用无血清培养基培养KYSE-150?TE-1细胞,观察细胞球的生成及在有血清培养基中的分化情况,利用MTT法以及Transwell小室法研究食管癌细胞球的增殖情况和侵袭能力,流式细胞仪检测分子标志CD44?CD271的表达?结果:KYSE-150?TE-1细胞在无血清培养基培养条件下可以获得可稳定传代的细胞球,细胞球细胞的增殖能力和侵袭能力均高于其亲本细胞;无血清培养基培养下KYSE-150细胞球中CD44+?CD271+?CD44+CD271+细胞分别为(64.92 ± 11.04)%?(28.27 ± 6.79)%?(24.07 ± 5.39)%,均显著高于亲本细胞[(37.04 ± 6.30)%?(3.69 ± 0.49)%?(1.64 ± 0.11)%,P均< 0.05]?TE-1细胞球中CD44+?CD271+?CD44+CD271+细胞占(6.41 ± 0.87)%?(2.58 ± 0.17)%?(0.27 ± 0.53)%,均显著高于亲本细胞[(1.87 ± 0.18)%?(0.44 ± 0.10)%?(0.09 ± 0.02)%,P均< 0.05]?结论:应用无血清培养基可以从KYSE-150?TE-1细胞系中分离出具有干细胞特性的食管癌细胞球,CD44?CD271分子可能是食管癌干细胞的标志?     

人肺癌细胞系A549中肿瘤干细胞样细胞的分离及鉴定

目的从人肺癌细胞系A549中分离并鉴定肺癌干细胞。方法将A549细胞置于无血清条件培养基中培养,形成细胞球,采用平皿克隆形成实验、MTT细胞增殖实验、RT-PCR、Western blot、免疫荧光技术,检测并比较A549细胞和A549细胞球的增殖能力及干细胞相关标记的表达水平,鉴定细胞球的肿瘤干细胞特性。结果利用无血清条件培养基从A549细胞中分离出肿瘤干细胞样细胞;相比A549细胞,细胞球呈悬浮生长,增殖能力和克隆形成数目(104±7)高于贴壁细胞[(37±3)(P<0.05)],且干细胞相关标记Sox2(2.68±0.39)和Oct4(1.23±0.12)表达水平明显提高[贴壁细胞Sox2(0.05±0.02)、Oct4(0.10±0.02),P<0.05]。结论运用无血清条件培养基可以从A549细胞系中有效富集肺癌干细胞样细胞。     

人结直肠癌干细胞微球体培养及鉴定

目的 探索结直肠癌细胞系干细胞微球体培养方法,并对Colo205细胞微球体是否具有肿瘤干细胞特性进行鉴定.方法 结直肠癌Lovo、Colo205及SW480细胞在含生长因子无血清培养基(SFM)中悬浮培养.流式细胞术、裸鼠成瘤实验、Transwell小室实验分别检测Colo205细胞及其微球体表面标记分子CD133、CD44表达,体内成瘤能力和体外侵袭能力.微球体细胞在含血清培养基中贴壁培养后流式检测CD44分子表达变化.RT-PCR分析Colo205细胞及其微球体CD44、Musashi-1及Oct4 mRNA的表达.结果 3种细胞系均能在特殊配制的SFM中形成可以稳定传代的微球体,SFM新鲜配制、用细胞分离剂Accutase替代胰酶传代以及保持细胞的悬浮状态均有利于微球体的形成和增殖.Colo205微球体中CD44+细胞比例显著增多,贴壁分化后逐渐减少至与Colo205细胞无明显差异.与Colo205细胞相比,微球体具有更强的侵袭能力和体内成瘤能力,并高表达干细胞标记分子Musashi-1及Oct4 mRNA.结论 利用特制SFM悬浮培养可得到结直肠癌细胞系微球体,这种微球体富集了肿瘤干细胞.     

人卵巢癌细胞系A2780中肿瘤干细胞的分离及鉴定

目的从人卵巢癌细胞系A2780中分离并鉴定卵巢癌干细胞。方法将A2780细胞置于含人重组表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、人重组碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、牛血清白蛋白和人胰岛素的无血清培养基中培养,采用连续传代诱导培养肿瘤干细胞,对每代分离出来的肿瘤干细胞进行流式检测,并对第4代肿瘤干细胞进行免疫荧光检测和逆向分化实验。结果从A2780细胞中成功分离出肿瘤干细胞,在上述无血清培养基中呈悬浮生长,具有很强的自我更新能力,流式检测显示随着传代诱导,CD133阳性率依次升高,免疫荧光进一步证实了CD133是卵巢癌干细胞的表面标记物,诱导分化实验说明其可逆向分化成为A2780肿瘤细胞。结论体外培养的卵巢癌细胞株A2780中存在卵巢癌干细胞,并能将其分离培养和诱导分化。     

人卵巢肿瘤细胞系3AO中肿瘤干细胞的分离鉴定

目的利用CD133抗体偶联的免疫磁珠分选法从人卵巢肿瘤3AO细胞系中分离CD133+细胞,并且通过检测其抗凋亡能力和耐药性进一步鉴定其特征。方法通过免疫磁珠分选方法分离人卵巢肿瘤细胞系中CD133+肿瘤干细胞,流式细胞仪检测肿瘤干细胞自我更新能力和抗凋亡能力,裸鼠移植实验反映成瘤性,MTT法检测其耐药性。结果通过免疫磁珠手段可成功分离得到CD133+卵巢肿瘤肿瘤干细胞,细胞增殖活力好,自我更新能力强,随着培养时间的延长可产生大量的CD133-细胞。裸鼠移植成瘤实验表明CD133+细胞成瘤率是10/10,成瘤平均时间是(58±6)d;而CD133-成瘤率是4/10,平均成瘤时间是(145±8)d,CD133+细胞成瘤能力明显强于CD133-细胞。MTT检测结果表明CD133+细胞的IC50值为CD133-细胞的2.5倍左右,提示对顺铂药物不敏感。对使用顺铂的细胞进行吖啶橙染色后发现,大量CD133-细胞呈现细胞凋亡状态,而CD133+细胞形态基本正常。进一步的AnnexinⅤ-FITC和PI双染结果表明,药物处理后的CD133+细胞比CD133-细胞具有更强的抗凋亡能力。结论免疫磁珠分选得到的CD133+细胞具有自我更新、增殖和分化为CD133-细胞等肿瘤干细胞的特征。CD133+细胞比CD133-细胞具有较强的成瘤能力、耐药性及抗凋亡能力。     

成人胰腺干细胞分离、培养及鉴定

目的：从成人胰腺组织中分离并鉴定胰腺干细胞。方法：利用含bFGF的有血清培养基分离、培养出具有高度增殖能力的细胞群，采用RT－PCR技术检测其Nestin mRNA及Insulin mRNA表达情况。同时诱导定向分化，观察其分化后的状态。结果：从成人胰腺组织中分离出的条索状细胞具有高度增殖能力，其Nestin mRNA表达阳性，而胰岛素Insulin mRNA表达阴性，分化后的细胞形成胰岛细胞团样结构。结论：本研究得到的细胞具有高度增殖能力和分化成胰岛细胞的潜能，是来源于胰腺的胰腺干细胞。     

肺癌干细胞研究进展

肺癌是当前危害人类生命和健康最严重的恶性肿瘤.据报道,经手术、放化疗等治疗后5年存活率不足15%.随着环境污染的日益加重,1950年代后发病率迅速上升,目前在男性恶性肿瘤中占第一位,女性的发病率也在不断增长,占恶性肿瘤的第二位.肿瘤干细胞（tumorstem cell,TSC）是当前研究的热点,人们希望从肺癌干细胞的角度找到根治肺癌的途径,近年来对肺癌干细胞的研究已经取得了很大进展,笔者就肺癌干细胞的分离、鉴定方法等最新研究进展综述如下.     

无动物源成分培养基用于人脐带间充质干细胞培养的研究

目的建立一种无动物源成份无血清的间充质干细胞培养基XF/SF-MSCM,并探讨其支持人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)体外增殖、维持分化潜能的效果。方法组织块贴壁法分离获得原代人脐带间充质干细胞,P1代起分别使用自制的XF/SF-MSCM培养基与含10%胎牛血清的传统培养基(SC-MSCM)对脐带间充质干细胞进行连续培养传代至P6代,观察比较两组P6代细胞的形态及增殖能力,以流式细胞术检测连续传代后细胞的免疫学表型,比较其成骨、成脂肪的分化潜能。结果分离获得的原代P0脐带间充质干细胞,分别在XF/SFMSCM与SC-MSCM两种培养基中连续培养传代,细胞增殖能力及形态无显著差别。两组P6代细胞的生长曲线相似,但XF/SF-MSCM组间充质干细胞贴壁的紧密程度稍低;流式细胞检测结果显示,XF/SF-MSCM组细胞保持了间充质干细胞的免疫学表型,高表达CD29、CD44、CD90,不表达CD31、CD34、CD45并维持了良好的成骨和脂肪细胞的分化能力。结论本室制备的无动物源成份无血清培养基XF/SF-MSCM可支持脐带间充质干细胞的体外扩增,维持其免疫学表型及分化潜能,提供数量充足的高质量间充质干细胞,满足临床治疗及生物医学研究的需要。     

小细胞肺癌细胞系H446中肿瘤干细胞的分选与鉴定

 目的 明确能否以表面黏附分子CD133为干细胞标志物,使用免疫磁珠分选（magnetic cell separation,MACS）法分离小细胞肺癌细胞系H446细胞中的肿瘤干细胞。方法 以CD133为特异性分子标志物,使用MACS方法分选H446细胞,比较CD133阳性（CD133+）细胞与CD133阴性（CD133-）细胞在集落形成、自我更新、增殖分化、侵袭性、耐药性和成瘤性方面的不同。结果 CD133+细胞和CD133-细胞在集落形成能力、自我更新能力、增殖能力、分化能力、侵袭能力和耐药性方面基本相同。集落形成和成瘤性实验结果显示：CD133+或CD133-细胞中40%以上的细胞都能够形成含有100个细胞以上的大集落,增殖成为与未分选细胞相同的细胞群,并能在裸鼠身上成瘤。结论 表面黏附分子CD133不能作为分选小细胞肺癌H446细胞系中肿瘤干细胞的分子标志物,分选后的CD133+与CD133-细胞中含有相同的肿瘤干细胞。     

人肺癌H1299肿瘤干细胞样细胞的分离培养及鉴定

目的 从人肺癌H1299细胞系中分离培养肺癌干细胞样细胞,并进一步鉴定其干细胞特性.方法 在低黏附条件下无血清诱导培养H1299细胞,富集H1299肿瘤细胞球,利用免疫荧光、流式细胞仪、PCR及Western blot检测干性标志物CD133和ABCG2的表达,并观察克隆形成和体内致瘤能力的改变.结果 肺癌H1299细胞经无血清诱导培养可形成悬浮的细胞球.与普通贴壁H1299细胞相比,细胞球具有更强的增殖能力和致瘤性,且高表达干性基因CD133和ABCG2,差异有统计学意义(P＜0.0S).结论 运用无血清悬浮细胞球培养方法富集的肺癌H1299细胞系肿瘤球高表达CD133和ABCG2,具有干细胞特性.     

化疗后乳腺癌组织中干细胞微球体的分离、培养及鉴定

目的：对从接受新辅助化疗的乳腺癌患者的乳腺癌组织中分离出的化疗微球体（CMSs）进行培养和鉴定,为获取乳腺癌干细胞的新方法的建立提供理论依据。方法：①将获得的CMSs接种在添加生长因子的DMEM/F12培养基中,观察CMSs的生长情况;②通过单克隆形成实验检测化疗微球体细胞(CMSDCs)的克隆形成和自我更新能力;③CMSDCs贴壁培养在含5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中,观察其分化能力;④免疫细胞化学检测CMSDCs及其分化细胞CK14、CK18和CK19的表达;⑤流式细胞术（FCM）检测CMSDCs及其分化细胞中ALDH1+细胞的含量;⑥ 构建NOD/SCID小鼠移植瘤模型,观察CMSDCs的致瘤能力。结果：CMSs在无血清培养基中继续呈球状生长,3 d后球体表面出现坏死的细胞层;CMSDCs可以连续传代形成新的CMSs,新生球体折光性强,表面无坏死层;在添加血清的培养基中的CMSDCs可以分化产生梭形的单层细胞;CMSDCs表达乳腺干细胞标记物CK19,不表达分化标记物CK14和CK18;CMSDCs和分化细胞中ALDH1+细胞的比例分别为为17.41%～23.57%和0.50%～1.28%;103个CMSDCs即可在NOD/SCID小鼠体内形成与原发肿瘤性质相同的移植瘤。结论：CMSs富含乳腺癌干细胞,与悬浮培养所获得的乳腺癌干细胞微球体类似,提示从化疗后的乳腺癌组织中分离癌干细胞微球体可能成为乳腺癌干细胞获取的新途径。     

人乳腺癌细胞微球体生物学特性研究

目的：研究人乳腺癌细胞微球体（MSs）的生物学特性,建立乳腺癌干细胞实验模型。方法无血清悬浮培养人乳腺癌MCF‐7细胞（MCF‐7组）,并获取MSs（MSs组）。利用细胞划痕实验、transwell实验及动物成瘤实验检测MSs在细胞迁移、侵袭性生长及体外成瘤等方面的生物学特性。结果细胞划痕实验提示：MSs组划痕带可在48 h后愈合,而MCF‐7组划痕带在48 h后未能愈合;transwell实验提示MSs组中可见到（76．24±0．35）个细胞通过生物膜,而MCF‐7细胞组中为（17．38±0．18）个（P＜0．05）;动物成瘤实验提示：MSs在成瘤速度及移植瘤体积方面均强于MCF‐7细胞。结论 MSs具有极强的迁移、侵袭性生长及动物体内成瘤的能力,可作为实验模型应用于乳腺癌干细胞相关研究中。     

人结肠癌细胞株CW-2干细胞富集方法的比较

目的比较3种细胞分选方法对人结肠癌细胞株CW-2干细胞的富集效率,探讨获得肿瘤干细胞的有效方法。方法采用单纯无血清悬浮培养、无血清悬浮培养+奥沙利铂、无血清悬浮培养+奥沙利铂+流式细胞术(多重联合)分别富集人结肠癌细胞株CW-2干细胞;应用流式细胞术、NOD-SCID小鼠致瘤实验和Transwell侵袭实验比较3种方法的富集效率;分别测量不同时间点(4、7、9、14、21、28d)各组小鼠成瘤情况;免疫组化检测移植瘤中CD44和EPCAM的表达情况。结果无血清悬浮培养细胞、无血清悬浮培养+奥沙利铂处理细胞和多重联合分选细胞中具有结肠癌干细胞特性的CD44+EPCAM+细胞,细胞比例分别为57.39%、73.85%、89.57%;多重联合分选细胞接种NOD-SCID小鼠后成瘤时间早、瘤体增长速度快,各时间点体积分别为(209.25±31.54)、(500.00±72.90)、(852.75±157.51)、(2280.00±440.91)、(4897.00±1154.15)、(11070.00±3559.86)mm3,与无血清悬浮培养细胞、无血清悬浮培养+奥沙利铂处理细胞的成瘤能力比较差异有统计学意义(P0.05);单纯无血清悬浮培养细胞、无血清悬浮培养+奥沙利铂处理细胞和多重联合分选后细胞接种72h后穿过人工基底膜的细胞数分别为(98±7)/视野、(135±7)/视野、(188±6)/视野,3组之间差异有统计学意义(P0.05);各组移植瘤中均表达CD44和EPCAM。3种分选方法所获得细胞中干细胞含量由高到低为:多重联合分选后细胞、无血清悬浮培养+奥沙利铂处理细胞、单纯无血清悬浮培养细胞。结论多重联合法富集肿瘤干细胞的效果明显强于单纯无血清悬浮培养和无血清悬浮培养+化疗药物法,是获得肿瘤干细胞较好的方法。     

Isolation and identification of cancer stem cells from human osteosarcom by serum-free three-dimensional culture combined with anticancer drugs

The cancer stem cells(CSCs)from human osteosarcoma by serum-free three-dimensional culture combined with anticancer drugs were isolated and identified.The primary cells derived from human osteosarcoma were digested by trypsin to prepare a single-cell suspension,and mixed homogeneously into 1.2% alginate gel.Single-cell alginate gel was cultured with serum-free DMEM/F12 medium.Epirubicin(0.8μg/mL)was added to the medium to enrich CSCs.After cultured conventionally for 7 to 10 days,most of cells suspended in ...     

食管肿瘤干细胞的分选及鉴定的实验研究

目的 进行人食管肿瘤干细胞(CSCs)的分选及鉴定.方法 通过获取人食管癌标本进行肿瘤细胞的培养,应用流式细胞仪检测p75NTR在人食管肿瘤细胞(ECCs)中的表达,应用磁珠分选法(MACS)进行p75NTR阳性细胞与阴性细胞的分选,研究p75NTR阳性细胞的增殖、分化、软琼脂集落形成能力,并进行裸鼠接种以观察其致瘤能力.结果 在8个食管肿瘤细胞系(株)中,除SHEC-1、SHEC-5未检测到p75NTR阳性细胞外,其余6个细胞系(株)中检测到p75NTR阳性细胞为0.32%～3.35%.MACS分选后的p75NTR阳性细胞的增殖能力明显强于阴性细胞[群体倍增时间分别为(17±3)h、(37±7)h,P<0.01];p75NTR阳性细胞具有分化产生其他表型细胞的能力;p75NTR阳性细胞在软琼脂中的集落形成能力(45.9%±8.9%)显著高于阴性细胞(3.7%±2.1%),P<0.01;行裸鼠接种时,p75NTR阳性细胞表现出较强的致瘤性,SHEC-7细胞只需2×103个即可致瘤,其致瘤能力是未分选细胞的50倍.结论 人ECCs中p75NTR阳性细胞具有自我更新、分化、增殖能力,并具有较强的致瘤能力,p75NTR阳性细胞具有CSCs的特性.     

利用分子信标检测microRNA并成像肺癌干细胞的实验研究

目的 利用miR-155分子信标(MB)检测CD133+CD326+肺癌干细胞(LCSCs)中高表达的miR-155并成像肺癌干细胞.方法 采用对A549细胞逆向诱导及紫杉醇富集的方法,通过流式细胞仪从A549细胞中分选出CD133+ CD326+细胞,并对其干性进行鉴定.以壳聚糖纳米(CS)作为载体转染miR-155MB,激光共聚焦显微镜检测miR-155 MB对LCSCs中miR-155的识别功能并成像,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进一步验证.结果 分选的CD133+ CD326+细胞在干细胞培养基中成球生长,干性相关基因CD133、CD326、OCT-4、Nanog表达为A549细胞的3.27、3.39、6.01、3.42倍(P＜0.05),在细胞数为1×104数量下仍具备成瘤能力.CS转染miR-155 MB后在A549及LCSCs中均可看到较强的红色荧光,以LCSCs中荧光信号最强(P＜0.05),且荧光信号强弱趋势与qRT-PCR检测的miR-155的表达趋势较一致.结论 利用miR-155 MB能够检测LCSCs中高表达的miR-155并使其成像,为监测并发现肺癌干细胞提供新思路.     

LY294002抑制小细胞肺癌干细胞样细胞自我更新

目的:研究Akt活性抑制剂LY294002抑制源自人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌球形成细胞即肺癌干细胞样细胞(LCSLCs)自我更新作用。方法:体外培养NCI-H446细胞系细胞。以干细胞条件培养基用超低粘附6孔细胞培养板悬浮培养富集和扩增LCSLCs。裸鼠皮下成瘤实验鉴别LCSLCs高致瘤特性。Western blot分析LCSLCs中Akt蛋白磷酸化水平。肿瘤球形成试验检测LY294002对LCSLCs自我更新的影响。结果:干细胞条件培养基悬浮培养6d,NCI-H446细胞系细胞呈三维非粘附性球体生长。LCSLCs具有高致瘤特性。与NCI-H446细胞系细胞比较,LCSLCs信号分子Akt组成性活化。LY294002有效降低LCSLCs中Akt磷酸化水平,并以剂量依赖方式抑制LCSLCs肺癌球形成(P<0.05)。结论:靶向干预小细胞肺癌LCSLCs信号分子Akt组成性活化可能成为抑制肺癌干细胞特性治疗小细胞肺癌的新策略。