微载体黏附培养SD大鼠肝细胞的生物学特性

目的:探讨微载体黏附培养SD大鼠肝细胞的生物学特性. 方法:对胶原酶消化法分离获取的SD大鼠肝细胞行微载体黏附培养,在倒置显微镜及扫描电镜下观察肝细胞形态变化,采用CL-800全自动生化分析仪检测不同时间培养上清中白蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)和尿素的含量. 结果:微载体黏附培养肝细胞的正常形态及白蛋白、尿素合成功能可维持1 wk以上,LDH漏出量、白蛋白及尿素水平1 wk内呈波动性变化,在培养第3日白蛋白及尿素水平最高、LDH漏出量最低. 结论:微载体培养可提供高活性、高密度生长的肝细胞,可望为肝细胞移植、生物型人工肝提供较理想的细胞材料;微载体培养肝细胞在培养第3日功能最佳,可能为应用于肝细胞移植、生物型人工肝的最佳时间.     

大鼠原代肝细胞的形态和功能

目的 :对分离培养的原代大鼠肝细胞进行形态学观察和功能研究 ,探讨其短期培养内的最佳功能状态 ,以便更好地用于肝细胞移植或生物人工肝 .方法 :采用Seglen胶原酶二步灌流法灌注SD雄性大鼠肝脏 ,获取的肝细胞在含有多种辅助因子的Williams’E培养基中进行培养 .台盼蓝排斥法计算细胞产量和细胞活率 ;光镜下直接或HE染色后动态观察细胞形态学改变 ,透射电镜观察其超微结构 ;并收集不同时期培养上清检测其细胞分泌等功能 .结果 :每只大鼠肝平均可获取 1 .2 1× 1 0 8个肝细胞 ,平均活力为 93.6 % .光镜下可见肝细胞呈多角形生长 ,有双核 ,连接成片状或岛状 .电镜下可见内质网、车轮状线粒体、糖原颗粒、细胞连接及胆小管 .肝细胞功能检测显示LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成功能在 1wk内出现波动性变化 ,第 3日LDH漏出量最低 ,白蛋白分泌及尿素合成功能较好 .结论 :离体培养的 3d原代肝细胞具有较好的功能 ,可能为肝细胞移植和生物人工肝应用的最佳时机     

原代培养大鼠肝细胞分离方法的比较研究

目的 探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法。方法 以Ｗｉｓｔａｒ大鼠做为肝细胞供体,分别采用直接分离法与胶原酶消化法分离获取肝细胞并原代培养;以台盼蓝染色法测细胞存活率,在位相关倒置显微镜下观察细胞形态变化,ＭＴＴ法测培养细胞活性,并检测不同时期培养上清液中白蛋白的含量。结果 直接分离法获取的肝细胞活性及功能欠佳,而胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整,贴壁良好、活性高、功能强。结论 经胶原酶消化分     

大鼠原代培养肝细胞的生物学特性研究

目的 :观察培养的原代大鼠肝细胞形态学和功能的动态变化 ,探讨其短期培养内的最佳功能状态。方法 :采用Seglen胶原酶二步灌流法分离肝细胞。光镜、透射电镜和免疫组化方法观察细胞形态学改变 ;并收集不同时期培养上清监测生化指标的改变。结果 :平均每只大鼠肝获取 1.2 1× 10 8个肝细胞 ,平均活力为 93.6 %。光镜下见肝细胞生长良好 ,可存活 3周 ,电镜下可见丰富的细胞器 ,细胞连接及胆小管 ,细胞角蛋白 18强阳性表达。肝细胞功能检测白蛋白分泌及尿素合成功能在第 3,4天时较好。结论 :肝细胞的形态和功能具有一致性 ,原代肝细胞在培养第 3,4天功能较好 ,可能为肝细胞移植和生物人工肝应用的最佳时机。     

三明治构型大鼠原代肝细胞长期培养及生物学特性的研究

目的观察三明治构型大鼠原代肝细胞长期培养的形态学变化,并对其功能进行测定。方法采用改良原位2步法门静脉胶原酶灌注分离单肝细胞,台盼蓝拒染实验观察细胞活力,利用三明治培养构型培养成年大鼠原代肝细胞,倒置显微镜下连续观察肝细胞的形态学变化,定期收集培养细胞上清液,检测培养肝细胞的分泌及合成功能,并与单层胶原培养肝细胞比较。结果平均每个鼠肝可获取2×108~3×108个肝细胞,活率在(93±3)%;体外肝细胞培养第3天,清蛋白分泌功能、尿素合成能力恢复到最佳状态。三明治构型培养的肝细胞清蛋白分泌功能、尿素合成能力在培养的14d内始终维持较高的水平,并形成肝索样结构,伴胆小管网络形成,肝细胞形态维持达28d以上。结论三明治构型肝细胞培养体系更接近于肝细胞体内生长环境,肝细胞可在较长时间内保持良好的形态结构和功能,三明治构型不仅可以应用于肝细胞的基础研究,而且为肝细胞移植和生物人工肝治疗肝衰竭奠定了一定的基础。     

改良原代大鼠肝细胞的体外分离培养和功能研究

目的建立经济有效且功能良好的原代肝细胞体外分离培养系统。方法采用0.02%胶原酶和Percoll分离液分离纯化大鼠肝细胞,光镜和电镜下观察HepatoZYME-SFM培养的肝细胞形态,自动生化仪定期检测培养肝细胞功能,RT-PCR半定量方法检测白蛋白mRNA,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析安定代谢能力。结果分离纯化的大鼠肝细胞总数(2～3)×108cells/整肝,活力和纯度大于95%,生长良好形态正常。培养3d后ALT、AST显著下降,加入NH4Cl后8d内BUN保持相对稳定高水平,白蛋白合成在第3～4天达到高峰,培养的2～5d内肝细胞可有效清除安定。结论通过使用低浓度胶原酶灌流、Percoll分离液纯化以及HepatoZYME-SFM无血清培养基培养,肝细胞可有效保持良好形态结构和一定的生物合成代谢能力。     

28℃条件下短期培养新生广西巴马小型猪肝细胞的初步观察

目的对28℃条件下短期培养猪肝细胞的可行性进行初步评价.方法将刚分离的新生广西巴马小型猪肝细胞采用28℃条件下的短期培养1～3 d后,恢复37℃继续培养,观察升温前后肝细胞的形态及LDH、AST的释放量,检测28℃短期培养后肝细胞的氨清除率和尿素合成量.结果在28℃短期培养的肝细胞,用倒置相差显微镜观察到典型的形态特征,细胞未见明显增殖,恢复37℃继续培养后,肝细胞迅速增殖并维持典型的肝细胞形态;经28℃短期培养后的肝细胞和未经28℃短期培养的肝细胞均保持较强的尿素合成和氨清除能力,但在28℃培养2 d和3 d后的肝细胞尿素合成量较在28℃培养1 d后的肝细胞尿素合成量显著降低(P＜0.01);培养期内LDH、AST漏出量较少.结论28℃短期培养能较好地维持猪肝细胞的形态学特征和功能,有望成为一种有效的保存和运输生物人工肝细胞材料的方法.     

大鼠肝细胞的原代培养

目的探索肝细胞的分离和原代培养条件.方法两步灌流法分离SD大鼠肝细胞,并将其培养在Hepatozyme-SFM培养基中,用MTT试验和尿素合成功能检测了解培养中的肝细胞的生物学活性.结果分离肝细胞的即时存活率为88%±2%,产量为(39±12)×106/g克肝脏;培养于体外的肝细胞维持形态稳定和尿素合成等功能达1周.结论应用两步灌流法可取得较好的肝细胞分离效果,应用Hepatozyme-SFM培养基能使肝细胞体外维持生物学功能达1周.     

三明治培养新生实验小型猪肝细胞的功能与形态

目的 探索双层胶原夹心猪肝细胞的方法，观察培养猪肝细胞的功能与形态特征。方法 将两步法分离的新生中国实验小型猪肝细胞接种于胶原被覆的培养板常规培养，24h后，肝细胞上再加一层胶原形成双层胶原夹心（三明治）培养，观察培养猪肝细胞的白蛋白分泌、形态学特征和乳酸脱氢酶（LDH）漏出量。结果 成功将新生实验小型猪肝细胞固定于双层胶原中，形成三明治状。培养1周内，用SDS／PAGE可检测出猪肝细胞分泌的白蛋白，倒置相差显微镜下观察到典型的形态特征，培养期内LDH漏出量较少。结论 可用双层胶原对新生乳猪肝细胞进行三明治样培养，为肝细胞提供更接近体内的培养环境，有助于维持特殊的肝功能和形态学特征。     

大鼠肝细胞无血清原代培养体系的建立

目的:建立大鼠肝细胞无血清原代培养体系。方法:以Wistar大鼠做肝细胞供者,采用胶原酶肝脏原位灌流消化法分离肝细胞,分别通过有血清和无血清方法进行原代培养;以台盼蓝染色法测细胞活力,倒置显微镜观察肝细胞形态变化,流式细胞仪测定原代培养大鼠肝细胞增殖指数。结果:在大鼠肝脏有血清原代培养体系和无血清原代培养体系两种方法中,大鼠肝细胞存活率均>90%,生长良好,经24 h和48 h培养后,经检测大鼠肝细胞增殖指数无统计学差异(P>0.05)。结论:成功建立大鼠肝细胞无血清原代培养方法,为今后利用此方法进行细胞信号传导等相关研究提供有力的实验手段。     

大鼠肝细胞的分离及原代长期培养

目的 :研究大鼠肝细胞分离的简易方法及长期培养过程中肝细胞形态变化过程。方法 :采用体外胶原酶二步灌注法分离大鼠肝细胞 ,TB染色法计算细胞数及细胞活率。 MTT法观测新生牛血清对大鼠肝细胞增殖的影响。在含 1 0 %新生牛血清及其他附助因子的 Williams′E条件培养基中原代长期培养 ,并进行形态学的动态观察。结果 :平均每只大鼠可获取 2 .2 6× 1 0 8个肝细胞 ,平均活力为 95.6%。新生牛血清浓度与大鼠肝细胞增殖有明显的量效关系 (P<0 .0 1 )。在 Williams′E培养基中可存活 5～ 6周并保持正常形态。结论 :本方法分离的肝细胞有较高的获取率和活力 ,适合体外长期原代培养     

原代肝细胞体外培养用于利福平和异烟肼肝毒性的研究

目的:研究利福平(rifampicin,LFP)和异烟肼(isoniazid,INH)对体外大鼠肝细胞的毒性.方法:以乳酸脱氢酶(LDH)释放量反映肝细胞损伤,以尿素分泌量和大鼠白蛋白合成量反映肝功能.结果与结论:15 mg/mL异烟肼(5 mL)、10 mg/mL利福平(5 mL)以及相同剂量两药合用时LDH释放量分别为对照组的1.3倍、1.5倍和1.6倍,产生的白蛋白量分别为不加药时的25%、28%和28%,尿素产量也有相应下降但程度不如白蛋白显著.说明该剂量的利福平和异烟肼对大鼠肝细胞均有毒性作用,但两药合用并不增加毒性.进一步将此原代肝细胞模型与连续细胞系小鼠成纤维细胞株L929、与文献报道的动物模型比较,探索原代肝细胞模型在肝毒性研究中应用的可行性.     

复制型HBV-Tg小鼠原代肝细胞的培养

目的 建立复制型HBV-Tg原代肝细胞体外培养方法,观察HBV-Tg小鼠原代肝细胞的氧化应激敏感性.方法 改良的两步灌注法分离、纯化、培养HBV-Tg小鼠原代肝细胞,24孔板培养7天,每天换液,收集上清,检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙氨酸转移酶(alanine transami...     

金黄地鼠原代肝细胞的分离纯化与培养

目的 建立一种简单、高效的金黄地鼠肝细胞分离、纯化及培养的方法.方法 实验采用两步胶原酶原位灌流法分离地鼠原代肝细胞,percoll离心法纯化细胞,台盼蓝染色检测成活率,对所分离培养的原代肝细胞进行形态学鉴定,Western Blot检测细胞功能.结果 经过分离纯化的金黄地鼠肝细胞,细胞成活率为（93.7％±2.1）％,细胞形态呈现不规则多边形,细胞多为双核和多核细胞.细胞在腺苷处理后,AMP激活的蛋白激酶（AMPK）磷酸化水平明显升高.结论 成功建立了金黄地鼠肝细胞分离纯化及培养的方法.     

去甲斑蝥素对LPS 诱导的体外培养的肝细胞损伤的保护作用

目的:通过体外观察去甲斑蝥素(NCTD) 对LPS 所致肝细胞损伤和TNF-α 表达的影响,探讨NCTD 的作用及其机制。方法:胶原酶Ⅳ灌流分离培养大鼠肝细胞,将细胞分为对照组、LPS 组、NCTD 组。对照组用无血清DMEM 培养, LPS 组用LPS (40 mg/L) 诱导,NCTD 组用不同浓度NCTD(0.5,1.0,2.5 μg/mL) 与LPS (40 mg/L) 共同作用,各组作用时间均为24 h。MTT 法检测肝细胞的增殖情况、测定培养上清液乳酸脱氢酶(LDH) 含量,ELISA 法检测TNF-α 和IL-6 表达。结果:LPS (40 mg/L) 作用于原代培养大鼠肝细胞24 h 后,与对照组相比,细胞生长抑制率达27%,培养上清液LDH 含量增加20 倍,TNF-α 和IL-6 的表达以及NF-κB DNA 结合活性均明显增加(P<0.05)。给予不同浓度NCTD 后,培养上清液LDH,TNF-α 和IL-6 的含量及NF-κB DNA 结合活性均明显下降,且呈量效关系。结论:NCTD 拮抗LPS 所致的肝细胞损伤,其保护作用的机制可能与其抑制TNF-α 和IL-6 的表达有关。     

高活力原代小鼠肝细胞的分离与纯化

目的建立一种稳定的能获得高活力和高纯度原代小鼠肝细胞的分离和纯化方法。方法对传统的两步原位胶原酶灌注法进行4个方面的优化,主要包括选择逆向灌流、将持续灌注法改为间断灌注后夹闭门静脉法、严格控制胶原酶消化时间和将分离的肝细胞悬液进行低速Percoll单密度离心纯化。分离后的肝细胞进行体外培养。肝细胞活力和得率用台盼蓝染色法检测。结果新鲜分离的小鼠原代肝细胞活力能稳定达到87%±3%,平均活细胞总数为8×105每克小鼠体重,绝大部分细胞在体外培养2h后贴壁生长。结论优化后的肝细胞分离方法更为稳定、有效,分离到的肝细胞具有高活力的优点。     

人胚肝细胞分离培养研究

目的　探讨体外优化培养人胚肝细胞的方法。方法　采用胰蛋白酶和聚乙烯吡咯烷酮(pvp) ,胶原酶,胶原酶和pvp消化法分离人胚肝细胞,并比较3种方法对分离人胚肝细胞的效果。结果　运用这三种方法均能成功地培养出原代肝细胞,并能够传代;但胶原酶和pvp消化法分离细胞效果最好,细胞贴壁生长能力强。三种消化方法其细胞存活率从高到低依次为胶原酶和pvp消化法、胶原酶消化法、胰蛋白酶和pvp消化法。结论　人胚肝细胞的分离首选胶原酶和pvp消化法,使用该法在体外培养的人胚肝细胞生长良好,可用于肝细胞移植和生物人工肝等方面的研究。