维甲酸对MESPU35胚胎干细胞系神经定向分化的影响

目的 了解维甲酸(Retinoic acid,RA)对MESPU35胚胎干细胞系诱导分化的影响。方法小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层，培养MESPU35细胞系，4—/4 法诱导其神经定向分化。结果 相差显微镜观察RA诱导MESPU35细胞系出现神经样细胞拟胚体百分率随分化时相点和RA浓度升高而升高，免疫细胞化学观察分化的NF200和GFAP阳性细胞随分化时相点和RA浓度升高而增加，NF200阳性细胞由无突起变为多极细胞，GFAP阳性细胞突起由短变长，最后联结成网状。流式细胞仪检测分化的GFAP、NF200阳性细胞比例变化与免疫细胞化学结果相符。结论 RA诱导MESPU35细胞系神经定向分化的调节以浓度和时间依赖模式进行，提示其神经定向分化产生的高比例神经细胞可以用于移植治疗。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞样细胞分化

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)离体分离和培养方法,探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、全反式维甲酸(RA)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)在体外诱导BMSCs向神经干细胞(NSCs)分化的作用.方法 采用出生4周SD大鼠的全骨髓细胞进行培养,传至第3代时,分为3组:A组,bFGF EGF RA进行诱导分化;B组,BMP-7进行诱导分化;C组,不加因子继续培养.在倒置显微镜下每日观察、记录BMSCs的诱导分化情况,并应用免疫组化技术对细胞进行兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)单抗鉴定.结果 A组诱导7 d后有部分细胞具备神经元样细胞形态,胞体呈锥形或圆形,有较长单极或多极的突起,有NSE阳性细胞表达.而B组、C组细胞仍为典型的成纤维细胞形态,无NSE阳性细胞.结论 bFGF、EGF和RA可以联合诱导BMSCs向NSCs分化,并可调控神经元分化,而BMP-7在此种诱导条件下未见明显的诱导BMSCs向NSCs分化的作用.     

ICR小鼠神经干细胞的诱导分化及鉴定

目的建立一种小鼠神经干细胞(Neural Stem Cells, NSCs)的快速诱导分化方法并鉴定诱导分化后的细胞类型。方法将消化后的单细胞在经Matrigel铺底的盖玻片上进行接种,使用倒置显微镜观察诱导分化后不同时间点的细胞形态变化,并采用神经上皮干细胞蛋白(neuroepithelial stem cell protein, Nestin)、微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)免疫细胞化学鉴定分化后的细胞类型。结果 (1)Nestin阳性细胞在神经球中数量较多,随着诱导分化时间的延长,Nestin阳性细胞逐渐减少,各组间阳性细胞率和各组间两两比较差异均有统计学意义(F=663.680,P0.05);(2)MAP2阳性细胞仅在神经球中央少量存在,随着诱导分化时间的延长,MAP2阳性细胞逐渐增多。各组间MAP2阳性细胞率的差异有统计学意义,两两比较,2 d组和3 d组间的差异无统计学意义,其他各组间差异均有统计学意义(F=135.049,P0.05);(3)GFAP阳性细胞在神经球中较多,随着诱导分化时间的延长,GFAP阳性细胞逐渐减少。各组间阳性细胞率和各组间两两比较,差异均有统计学意义(F=36.915,P0.05)。结论本研究所采用的诱导方法可诱导NSCs快速向神经元分化。     

神经干细胞在体外诱导向胆碱能神经元定向分化后移植治疗脊髓损伤

目的 研究神经干细胞向胆碱能神经元定向分化后对脊髓横断损伤的修复作用.方法 采用GFP转基因孕鼠(E 12～14d)的海马分离、培养神经干细胞并诱导其向胆碱能神经元方向分化.SD成年大鼠以显微剪横断脊髓制成SCI模型.将SD大鼠18只分为3组:A组注入DMEM/F12培养液;B组注入神经于细胞的细胞液,C组注入在体外定向诱导为胆碱能神经元的细胞液;3组实验动物均于细胞移植后采用B B B评分法定期评估运动功能.于移植后第8周末,取出相应的脊髓阶段,行ChAT免疫组织化学染色,光镜观察.结果 从海马分离的细胞群具有自我更新能力,表达nestin,胎鼠骨骼肌提取液可以诱导这些细胞中的11.8%分化成为胆碱能神经元,与对照组差异明显.B组和C组所有大鼠BBB评分在移植细胞3周以后明显高于A组(P＜0.05),C组所有大鼠BBB评分在移植细胞4周以后明显高于B组(P＜0.05).在移植第8周末,冰冻切片中可见ChAT染色阳性细胞.结论 神经干细胞可以在体外诱导向胆碱能神经元定向分化,定向分化后移植应用在脊髓横断损伤治疗中,可明显改善运动功能.     

维甲酸联合脑源性神经生长因子体外诱导人脐血间充质干细胞向神经样细胞定向分化的实验研究

目的探讨脐血间充质干细胞（MSCs）向神经样细胞定向诱导分化的条件及方法,以明确其神经分化潜能。方法将人脐血MSCs体外培养扩增、保存后,取第5代的MSCs分别用维甲酸（RA,RA组）、维甲酸联合脑源性神经生长因子（BDNF,RA＋BDNF组）诱导方法向神经样细胞诱导,诱导分化期间观察细胞形态变化,同时设对照组,对照组不加任何诱导分化剂,比较3组巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NES）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达差异。结果两种不同诱导方法均能诱导细胞发生典型变化,对照组未发现神经样细胞生长。免疫组化法显示3组诱导后均表达nestin、NSE、GFAP,BDNF＋RA组的表达量多于RA组。Real-time RT-PCR显示诱导组及对照组均有NSE mRNA、GFAP mRNA表达,但RA组、RA＋BDNF组诱导后表达上调（P〈0.05）,且RA＋BDNF组较单纯RA组上调明显（P〈0.05）。结论脐血MSCs经两种神经营养因子诱导均可分化为神经样细胞,并表达神经元特异性标志物,其中添加BDNF后较单纯应用RA诱导效果好。     

维甲酸联合神经生长因子体外诱导人脐血间充质干细胞向神经样细胞定向分化的实验研究

目的:探讨脐血间充质干细胞(MSCs)向神经样细胞定向诱导分化的条件及方法,以明确其神经分化潜能。方法:将人脐血间充质干细胞体外培养扩增、保存后,取第5代的MSCs分别用维甲酸(RA)、维甲酸联合神经生长因子(NGF)诱导方法向神经样细胞诱导,诱导分化期间观察细胞形态变化,并比较表达神经元特异性烯醇化酶(NES)mRNA、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)mRNA的差异。结果:两种不同诱导方法均能诱导细胞发生典型变化,对照组未发现神经样细胞生长。免疫组化法显示三种诱导方法诱导后均表达Nestin、NSE、GFAP,NGF+RA组多于RA组。Real-time RT-PCR显示诱导组及对照组均有NSE mRNA、GFAP mRNA表达,但两种诱导方法诱导后表达上调(P<0.05),添加NGF较单纯RA组上调明显(P<0.05)。结论:脐血MSCs经两种神经营养因子诱导法均可分化为神经样细胞,并表达神经细胞特异性标志物,其中添加NGF后较单纯应用RA诱导效果好。     

神经干细胞定向分化为少突胶质细胞的实验研究

目的:通过体外诱导使神经干细胞定向分化为少突胶质细胞,为从神经干细胞来源得到少突胶质细胞提供实验基础.方法:体外分离培养新生大鼠神经干细胞,加入甲状腺素(T3)和(或)胰岛素诱导分化,免疫细胞化学方法检测诱导末期NSC分化中GalC,GFAP的表达,通过比较增殖情况、分化率、GalC阳性细胞突起长度分析不同诱导因素组合对NSC定向诱导为少突胶质细胞的作用.结果:经甲状腺素和(或)胰岛素诱导后能够分化出少突胶质细胞,不同浓度T3和(或)胰岛素对少突胶质细胞分化的影响不同.结论:甲状腺素和胰岛素能诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化,且促进分化细胞的增殖和成熟,T3(40ng/ml)和胰岛素(25μg/ml)共同使用时这一作用较明显.     

成年小鼠视网膜穆勒细胞向神经干细胞转化的实验研究

【摘要】 目的 探讨Muller细胞在视网膜损伤后能够转化为神经干细胞，并经诱导后可以分化、新生视网膜中多 种类型的神经元，研究该培养细胞是否具有多能向分化能力。方法 取72只雌性成年SD小鼠建立视神经切断模型，采用酶解法对SD小鼠视网膜Muller细胞进行消化传代提纯。取第4代胰酶消化过的视网膜Muller细胞，用含有碱性成纤 维细胞生长因子(FGF-2)、表皮生长因子(EGF)的改良的Eagle培养基(DMEM)-F12培养基培养5d,用含有0. 5μmol/L RA、lμg/L BDNF与0.5%胎牛血清的DMEM培养基进行10d诱导分化，采用免疫荧光染色法对去分化及再分化后的 细胞进行鉴定。结果 免疫荧光染色鉴定3?4代培养的Muller细胞结果显示，特异性标记物谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸转运体(GLAST)抗体表达阳性，呈现红色，荧光染色GS和GLAST抗体表达阳性细胞比例分别为(92. 76± 4.28)%与(95. 28±2. 79)%。对去分化后的Muller细胞球给予免疫荧光染色鉴定，结果显示特异性标记物巢蛋白(Nes- tin)表达阳柱，呈现红色，荧光染色阳性细胞比例为(95. 37± 1.46) %。免疫荧光染色鉴定去分化后的Muller细胞球，结果显示神经胶质细胞特异性标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳柱，呈绿色，荧光染色阳性细胞比例为(10. 28± 3.37)%。细胞抗5溴-2脱氧尿昔(BrdU)的表达阳性，呈现红色，荧光染色阳性细胞比例为(90. 44±4. 23) %。免疫荧 光染色鉴定诱导分化后的Muller细胞球，结果显示神经节细胞的特异性标记物Thyl. 1表达阳性，呈现绿色，主要为轴突 和细胞质，荧光染色阳性细胞比例为(21. 25±4. 62)%。结论 视网膜Muller细胞是一种视网膜干细胞潜在来源细胞， 细胞因子刺激能够使体外培养的视网膜Muller细胞获得干细胞特征。     

蒺藜皂苷诱导SD新生大鼠海马神经干细胞分化的实验研究

目的 探讨蒺藜皂苷对于诱导SD新生大鼠海马神经干细胞(neural stem cells, NSCs)分化的影响作用以及蒺藜皂苷培养液浓度变化对其的影响.方法 采用无血清和单克隆培养方法,将蒺藜皂苷加入离体的海马NSCs的培养液中,应用Nestin、BrdU、NF200、GFAP免疫荧光染色观察NSCs的形态及分化而来的神经元、神经胶质细胞形态,并检测由海马NSCs分化而来的细胞的数量.结果 海马NSCs在无血清培养下,可形成Nestin阳性细胞球.在诱导分化后,免疫荧光染色可见NF阳性细胞、GFAP阳性细胞,而其中20 mg/kg 蒺藜皂苷干预组海马NSCs向神经元的分化比例最高.结论 在蒺藜皂苷的作用下,海马NSCs向神经元分化的数量增多.     

GM1对人胚胎干细胞定向诱导分化神经细胞的作用

目的方法将人胚胎干细胞（SDU hESm 1)悬浮培养形成拟胚体（EB）,EB再贴壁培养诱导分化神经细胞,分别于悬浮培养EB阶段和EB贴壁培养阶段的神经分化培养基中加入浓度为0、0.5、 5、50?μg/mL 的GM 1,观察EB的形成,计数神经标记性抗原Nestin和β Tubulin阳性细胞百分率。结果含GM 1的神经分化培养基诱导生成"透亮EB", 分化出Nestin和β Tubulin阳性细胞明显多于不含GM 1培养基诱导出的神经细胞数量,不含GM 1形成的EB发黑;在悬浮培养形成EB开始加GM 1比EB贴壁培养开始加GM 1产生Nestin和β Tubulin阳性细胞数目更多,但2个加GM 1阶段产生的神经细胞百分率均随GM 1浓度增加而增大。结论首次发现GM 1可以诱导hESC定向分化神经细胞,定向产生神经前体细胞（Nestin阳性）,在hESC定向分化神经细胞的过程中,悬浮培养EB阶段加入GM 1更有利于hESC的定向分化。     

昆明小鼠胚胎干细胞大鼠侧脑室内移植诱导分化的在体研究

目的：探讨脑内微环境诱导胚胎干细胞向神经细胞分化的状况，确定胚胎干细胞脑内移植的最佳分化阶段。方法：将未分化的昆明小鼠胚胎干细胞和经维甲酸初步诱导分化的胚胎干细胞分别进行侧脑室内移植，通过苏木素伊红（HE）染色、尼氏染色和神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫组织化学染色，检测胚胎干细胞移植后的存活和分化情况。结果：未分化的昆明小鼠胚胎干细胞侧脑室内移植后．不能很好地向神经细胞方向分化，有形成畸胎瘤的倾向。而经维甲酸初步诱导分化的胚胎干细胞进行侧脑室移植后4周，移植物中有相当一部分细胞为NSE免疫阳性细胞．部分细胞的胞浆中可见尼氏小体。具有神经细胞的典型特征。结论：经过维甲酸诱导后，胚胎干细胞发生了向神经细胞的分化．在侧脑室微环境中可以存活．并朝着神经细胞方向分化。     

Caspase-3在维A酸致小鼠胚胎神经管畸形中的表达及意义

目的:探讨Caspase-3在维A酸(RA)致小鼠胚胎神经管畸形发生过程中的表达及意义。方法:40只未经产昆明种小鼠随机分为实验组和对照组各4小组,每小组5只。分别在花生油及RA处理18、42、66、90 h后剖腹取胎、剥离头部神经管,Western-bloting法检测Caspase-3的表达变化。结果:Caspase-3在正常胚胎神经管组织中的表达存在时间依赖性。对照组Caspase-3在花生油灌服后18 h表达升高,42 h和66 h时表达最强,之后表达逐渐降低。实验组Caspase-3在RA处理后42 h表达水平显著低于对照组(P0.01),66 h和90 h时表达水平均显著高于对照组(P0.01)。结论:RA改变了昆明种小鼠胚胎神经管中Caspase-3的正常时间表达模式,这种异常的基因表达模式可能参与了RA诱导的神经管畸形发生。     

纤维连接蛋白在小鼠胚胎干细胞诱导为神经前体细胞中的作用

目的 观察采用ITSF和N2无血清培养基诱导小鼠胚胎干细胞为神经前体细胞的作用及纤维连接蛋白对神经诱导的影响。方法 小鼠胚胎干细胞的培养和无血清诱导为神经有体细胞，NBT／BCIP染色，Nestin免疫组化染色。结果 细菌培养皿法或悬滴法培养胚体，ITSF或N2无血清培养基均能将小鼠胚胎干细胞诱导为神经前体细胞。纤维连接蛋白预处理培养皿法表面，对胚体的贴壁情况影响不大，但能使无血清培养后存活的细胞增多。结论 小鼠胚胎干细胞在ITSF和N2培养基均能分化为神经前体细胞，在N2培养基中加入纤维连接有使存活的神经前体细胞数量增多。     

细胞外基质的程序性应用促进胚胎干细胞的神经分化

目的 探讨细胞外基质(ECM)在胚胎干细胞(ESCs)诱导分化中特定时期的作用.方法 将ESCs悬浮培养形成胚胎小体(Embryonic bodies,EBs),用高浓度维甲酸(RA)诱导,再将EBs接种在GL、FN、LPO基质上进行分化,利用免疫荧光方法 比较这些基质对神经分化的影响;进一步检测LPO对神经突起生长的影响.结果 高浓度RA启动并加速了nestin阳性的神经前体细胞的分化;FN对ESCs的神经分化具有剂量依赖性的促进作用,可提高神经元的分化率;LPO基质能够促进神经细胞的突起生长,进一步诱导神经细胞的成熟.结论 不同基质在分化的特定阶段起到了不同作用,在诱导神经前体分化阶段应用FN以及在诱导神经细胞分化阶段应用LPO的联合作用对ESCs向神经细胞分化作用最显著.     

小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展

小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES cell）体外培养可以分化成为外胚层组织，并进一步分化为神经元和神经胶质细胞。这些细胞已用于中枢神经系统疾病的细胞替代治疗和治疗药物的研发。小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的方法主要有拟胚体介导的神经细胞分化、基质细胞诱导的神经细胞分化、默认模式介导的神经细胞分化、单层粘附培养诱导的神经细胞分化和遗传工程介导的神经细胞分化等。本文综述了这些分化方法。     

胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨胚胎干细胞（ＥＳ）向神经细胞定向分化发育的可能性。方法 ＥＳ－Ｄ３在无小鼠白血病抑制因子（ｍＬＩＦ）存在的条件下培养ＥＳ细胞４ｄ,形成ＥＳ集落（即胚胎样小体）,经胰酶消化打散后种植于粘附性培养皿上。结果 上述细胞表达ＭＡＰ－２和ＧＦＡＰ蛋白。ＲＴ－ＰＣＲ分析进一步证明这些细胞能表达γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）γ亚单位和酷氨酸羟化酶以及脑因子－１神经相关基因。结论 ＥＳ细胞在体外能有效地被诱导成具有多种神经元特性的神经样细胞,可为神经移植提供源源不断的材料。     

胚胎小鼠神经干细胞的培养和诱导分化

目的 探索体外培养和诱导分化胚胎小鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法 .方法分离12.5 d ICR小鼠胚胎的大脑皮质,通过Accutase酶消化法和机械消化法,将组织消化成单个细胞,置于完全培养基中培养,3d后神经干细胞增殖成神经球;将传代的神经球消化,通过诱导培养基诱导其分化;采用细胞免疫荧光染色和qRT-PCR技术检测巢蛋白(Nestin)、中间微管相关蛋白2(Map2)和胶质纤维酸性蛋白(Gfap)的表达,鉴定NSCs、分化形成的神经元和星形胶质细胞.结果 NSCs能被Nestin特异性标记,诱导分化后的细胞可被Map2和Gfap抗体特异识别;qRT-PCR结果显示,诱导后Nestin的表达水平降低,而Map2和Gfap的表达水平升高.结论 通过Accutase酶消化法联合机械消化法分离小鼠胚胎脑皮质,进行体外培养,可获得具有自我更新能力和多向分化潜能的NSCs.     

大鼠诱导性多能干细胞向神经前体细胞诱导分化研究

目的探讨大鼠来源的诱导性多能干细胞(iPS细胞)向神经前体细胞(NPC)定向诱导分化的方法。方法在大鼠iPS细胞培养到悬浮类胚体阶段加入维甲酸(RA)诱导分化,对分化获得的细胞,分别通过免疫荧光染色和实时定量PCR方法检测NPC标志物、用BrdU免疫荧光染色检测其增殖能力、并通过大鼠视网膜下腔移植对其存活、整合情况及分化能力进行检测。结果经诱导分化获得的细胞能够在贴壁培养条件下形成Rosette结构、表达NPC标志物并且绝大多数呈BrdU阳性,移植到大鼠视网膜下腔后能分化为神经元和胶质细胞。结论大鼠iPS细胞能够通过悬浮EB加RA诱导的方法分化为NPC,有可能作为细胞移植治疗视网膜退行性疾病的供体细胞。     

Ezh2在全反式维甲酸诱导的P19神经细胞分化过程中的作用

目的 探讨组蛋白甲基转移酶Ezh2在P19神经细胞分化中的作用.方法 通过Western印迹检测全反式维甲酸 (RA)诱导TuJ1蛋白的表达;通过染色质免疫沉淀技术检测Ngn1基因启动子区Ezh2的结合与H3K27三甲基化的变化;通过实时定量RT-PCR检测RA诱导P19细胞分化后 Ezh 2 mRNA表达.结果 在RA诱导P19细胞中,Ezh2与H3K27me3在Ngn1启动子区的结合逐渐升高,并在诱导后第2天达到高峰,然后迅速降低,随后出现神经分化特异标志.结论 Ezh2在RA诱导的P19细胞早期产生一种抑制性的组蛋白修饰标志H3K27me3,通过避免Ngn1的过早表达,确保P19细胞的正常分化.     

维甲酸诱导胚胎神经管畸形与β catenin基因表达的关系

目的观察维甲酸诱导小鼠胚胎神经管畸形中β catenin表达水平变化。方法孕鼠随机分为对照组和实验组。胚胎7.75?d时,实验组1次性胃饲致畸量维甲酸,对照组胃饲等量溶剂,服药后4、18、42、66、90?h分别取胚,常规制作石蜡切片,采用原位杂交和免疫组化技术,检测胚胎神经管组织中β catenin mRNA及蛋白的表达量变化。结果各对照组及实验组的胚胎神经管上皮均有β catenin mRNA及蛋白的不同程度表达。实验组在灌服维甲酸花生油悬液后4、18?h,β catenin mRNA表达水平明显低于对照组(P≤0.05);42?h时两组表达水平无明显差异,66?h后显著高于对照组表达水平(P≤0.05)。实验组在灌服维甲酸花生油悬液后18、42?h,β catenin 蛋白表达水平明显低于对照组(P≤0.05);66?h时两组表达水平无明显差异,90?h后显著高于对照组表达水平(P≤0.05)。结论β catenin基因在胚胎神经管上皮中的异常表达与维甲酸致神经管畸形有相关性。