组蛋白高乙酰化介导的Egr-1结合促进gdnf基因高转录

目的探讨大鼠C6 胶质瘤细胞中gdnf 基因启动子II 区组蛋白H3K9 高乙酰化引发该基因高转录的机制。方法采用
ChIP-PCR技术检测了大鼠C6星形胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中gdnf基因启动子II区转录因子Egr-1结合位点处H3K9
的乙酰化水平以及Egr-1与该启动子的结合能力;利用Real-time PCR和ChIP-PCR技术,检测了组蛋白乙酰基转移酶抑制剂姜
黄素（Curcumin）和去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）处理对C6 胶质瘤细胞中gdnf 基因启动子II 区Egr-1 结合位点处
H3K9的乙酰化水平、Egr-1与之的结合能力以及该基因转录水平的影响。结果较之正常星形胶质细胞,C6胶质瘤细胞中gdnf
基因启动子II 区Egr-1 结合位点处H3K9 的乙酰化水平显著升高,并且Egr-1 与之的结合能力也显著升高（P<0.01）。当
Curcumin显著降低了Egr-1结合位点处H3K9乙酰化水平时,Egr-1与启动子II区的结合量以及gdnf基因mRNA的表达量都显
著下调（P<0.05）;而当TSA显著升高了Egr-1 结合位点处H3K9 乙酰化水平时,Egr-1 与启动子II 区的结合量以及gdnf 基因
mRNA的表达量都显著升高（P<0.05）。结论在大鼠C6胶质瘤细胞中gdnf基因启动子II区H3K9高乙酰化介导的Egr-1结合
量升高可能是其高转录的原因。
     

曲谷抑霉素A调控人干扰素调节因子3基因初步研究

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor, HDACi）曲谷抑霉素A（trichostain A, TSA）对人干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3, IRF3）基因表达的影响,初步分析TSA调控IRF3基因的乙酰化机制。方法：双荧光素酶活性分析法检测TSA和组蛋白乙酰化酶（histone acetylase, HAT）野生型p300对IRF3基因启动子活性的影响;实时荧光定量PCR检测TSA对IRF-3基因mRNA水平的影响;Western blot检测TSA对IRF3蛋白水平的影响。结果：不同浓度TSA干预后IRF3基因启动子活性均增加,TSA浓度为1 μmol/L时,PS1、PS6相对荧光素酶活性分别增加75%、155%;过表达野生型p300后PS1相对荧光素酶活性增加267%;TSA（1、10 μmol/L）干预细胞6 h后,IRF3基因mRNA水平增加23%、39%,干预24 h后,mRNA水平增加17%、64%;TSA（0.1、1、5 μmol/L）干预细胞24 h后,蛋白表达量分别增加15%、72%、191%。结论：TSA上调IRF3基因mRNA和蛋白表达,TSA和组蛋白乙酰化酶p300均可正向调控IRF3基因启动子活性,TSA可能通过IRF3通路发挥治疗免疫性疾病和抗肿瘤作用。     

组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)与肿瘤

引言 组蛋白是真核生物核染色体的重要构成成分,组蛋白的乙酰化和去乙酰化是基因表达过程中重要的调控方式,是转录过程中的关键修饰.研究表明组蛋白乙酰化和去乙酰化与肿瘤的发生和发展有密切的关系.组蛋白脱乙酰化酶(HDAC6)通过去除组蛋白的乙酰基和其他转录调控参与肿瘤发生和进展.组蛋白乙酰化状态取决于组蛋白乙酰基转移酶(HATs)与组蛋白去乙酰化酶(HDACs)之间的活性竞争.HDAC异常结合到特定的启动子区从而抑制正常功能基因的转录可能是恶性肿瘤发生的机制之一.     

5-氮-2'-脱氧胞苷及TSA对人结肠癌细胞株HT29 ING1b基因表达的影响

目的 探讨DNA5'CpG岛去甲基化和组蛋白去乙酰化对HT29人结肠癌细胞株ING1b基因启动子区域甲基化、组蛋白乙酰化及其mRNA表达的影响.方法 应用特异性DNA甲基转移酶(DNMTs)抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-dc,以下简称Aza)及组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)作用人结肠癌细胞株HT29后,用甲基化特异性PCR(MSP)检测该ING1b基因核心启动子区域CpG岛甲基化情况,用染色质免疫沉淀(ChIP)检测其乙酰化组蛋白绑定的DNA情况,并用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ING1bmRNA表达.结果 HT29人结肠癌细胞株ING1b基因核心启动子区域存在CpG岛半甲基化,且乙酰化水平低,mRNA表达水平低.经Aza及TSA干预后,ING1b基因核心启动子区域CpG岛转为非甲基化,其乙酰化水平增加,ING1b mRNA表达亦比对照组高.结论 HT29人结肠癌细胞株ING1b基因5端核心启动子甲基化及乙酰化可能是导致该基因表达沉默的主要原因,Aza逆转HT29人结肠癌细胞株ING1b基因异常甲基化,TSA能较好地提高其组蛋白乙酰化水平,并有效地激活因半甲基化所致ING1b基因沉默的再转录,诱导该基因表达,从而抑制肿瘤细胞生长.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A对细胞周期素D1调控的影响?

目的：观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A( TSA)对细胞周期素D1表达的影响,探讨TSA抑制细胞周期素D1表达的分子机制。方法以不同浓度(20、100、400 nmol/L)的TSA处理A549细胞24 h,以RT-PCR、Western blot等方法检测细胞周期素D1 mRNA和蛋白的表达水平;以染色质免疫沉淀技术分析400 nmol/L的TSA处理A549细胞24 h后,细胞周期素 D1基因核心启动子组蛋白3第9位赖氨酸乙酰化( Ac -H3k9)水平。结果随着TSA处理浓度的增加细胞周期素D1 mRNA和蛋白表达水平下降。在400 nmol/L TSA作用下,细胞周期素D1启动子区组蛋白乙酰化程度下降。结论 TSA 造成细胞周期素D1表达下调可能与细胞周期素D1启动子乙酰化程度下降有关。     

5-氮-2'-脱氧胞苷及曲古抑菌素A对HT29人结肠癌细胞株ING1b基因启动子区域甲基化、组蛋白乙酰化及ING1bmRNA表达的影响

目的　探讨DNA5'CpG岛去甲基化和组蛋白去乙酰化对HT29人结肠癌细胞株ING1b基因启动子区域甲基化、组蛋白乙酰化及其mRNA表达的影响。方法　应用特异性DNA甲基转移酶（DNMTs）抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷（5-Aza-2'-dc,以下简称Aza）及组蛋白去乙酰化酶（HDACs）抑制剂曲古抑菌素A（TSA）作用人结肠癌细胞株HT29后,用甲基化特异性PCR(MSP)检测该ING1b基因核心启动子区域CpG岛甲基化情况,用染色质免疫沉淀(ChIP)检测其乙酰化组蛋白绑定的DNA情况,并用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ING1bmRNA表达。结果　HT29人结肠癌细胞株ING1b基因核心启动子区域存在CpG岛半甲基化,且乙酰化水平低,mRNA表达水平低。经Aza及TSA干预后,ING1b基因核心启动子区域CpG岛转为非甲基化,其乙酰化水平增加,ING1bmRNA表达亦比对照组高。结论　HT29人结肠癌细胞株ING1b基因5端核心启动子甲基化及乙酰化可能是导致该基因表达沉默的主要原因,Aza逆转HT29人结肠癌细胞株ING1b基因异常甲基化,TSA能较好地提高其组蛋白乙酰化水平,并有效地激活因半甲基化所致ING1b基因沉默的再转录,诱导该基因表达,从而抑制肿瘤细胞生长。     

内源性肾上腺糖皮质激素对血管炎症反应的抑制作用

目的：探讨内源性肾上腺糖皮质激素时脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导大鼠血管炎症因子IL-6、IL-β、IL-10表达、促炎转录因子NF-kB活性以及HDAC活性的影响及其机制.方法：分别给予大鼠RU486（肾上腺糖皮质激素拮抗刺）、TSA（HDAC抑制剂）和摘除双侧肾上腺处理后,腹腔注射LPS,取其主动脉提取组织总蛋白,ELISA法检测IL-1β、IL-6、IL-10含量及NF-κB、HDAC活性.结果：与正常对照组相比,LPS诱导大鼠主动脉IL-1β、IL-6、IL-10含量以及NF-κB活性升高（P＜0.05）;分别给予RU486、TSA以及摘除双侧肾上腺处理再腹腔注射LPS,与单纯给予LPS相比,IL-1β、IL-6、IL-10含量以及NF-κB活性均显著升高（P＜0.05）.给予RU486或摘除双侧肾上腺处理对大鼠主动脉组织中HDAC的活性未见明显影响;而给予TSA处理,大鼠主动脉中HDAC的活性受到抑制（P＜0.05）.结论：内源性肾上腺糖皮质激素同样具有抗炎作用,尤其是对血管炎症反应的抑制作用,而核组蛋白去乙酰化酶HDAC可能对致炎因子的表达具有负调控作用,可以从转录水平抑制血管炎症因子的合成.     

组蛋白修饰对COPD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞趋化因子表达的影响

目的探讨COPD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)炎症因子表达是否与组蛋白修饰有关。方法熏烟法建立大鼠COPD模型。取大鼠肺组织进行病理观察,提取AECⅡ进行碱性磷酸酶染色鉴定和电镜鉴定;实时定量PCR检测AECⅡ三种趋化因子:单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-8及巨噬细胞炎性蛋白2α(MIP-2α)的mRNA表达;Westernblot检测组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)蛋白表达;染色质免疫共沉淀(ChIP)检测趋化因子启动子区组蛋白H3、H4乙酰化和H4K9甲基化修饰情况。结果 COPD组IL-8、MCP-1、MIP-2αmRNA表达较正常对照组分别增加4.48倍、3.14倍、2.83倍;COPD组AECⅡ细胞HDAC2蛋白表达较正常对照组降低(0.25±0.15比0.66±0.15,P0.05),且HDAC2的下降程度与IL-8、MCP-1、MIP-2αmRNA表达增高程度呈负相关(r值分别为-0.960、-0.914、-0.928,P均0.05)。COPD组趋化因子基因启动子区H3、H4乙酰化水平较正常对照组均升高,H4K9甲基化水平则降低(P均0.05)。结论 COPD模型大鼠AECⅡ的IL-8、MCP-1、MIP-2α三种趋化因子基因表达增加,HDAC2介导的组蛋白修饰在COPD炎症反应中发挥重要作用。     

组蛋白乙酰化激活人脑胶质瘤中胶质细胞源性神经营养因子转录的机制研究

  目的  研究组蛋白乙酰化对人脑胶质瘤中胶质细胞源性神经营养因子基因(GDNF)的表达调控和具体机制。  方法  取正常人脑组织、低级别胶质瘤脑组织(LG-glioma)、高级别胶质瘤脑组织(HG-glioma)各6例。用组蛋白乙酰化酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制处理人脑神经胶质瘤U251细胞。实时荧光定量PCR检测脑组织及细胞中的GDNF mRNA水平,染色质免疫共沉淀(ChIP)-PCR检测GDNF启动子区转录因子cAMP应答元件结合蛋白(CREB)结合位点的H3K9乙酰化水平,以及转录因子CREB与GDNF启动子区的结合能力,同时检测组蛋白乙酰化酶和脱乙酰化酶抑制剂对转录因子CREB结合能力和GDNF表达的影响。  结果  与正常脑组织和低级别脑胶质瘤组织比较,高级别胶质瘤组织的GDNF mRNA水平高(P < 0.01),GDNF启动子区的H3K9乙酰化水平增加(P < 0.01),且GDNF启动子上CREB结合区的乙酰化水平高于非CREB结合区的乙酰化水平(P < 0.01)。高级别胶质瘤组织中CREB与GDNF启动子区的结合能力高于正常脑组织和低级别脑胶质瘤组织(P < 0.05)。组蛋白乙酰化酶抑制剂处理U251细胞后,GDNF启动子上CREB结合区的乙酰化水平下降,CREB与GDNF启动子结合活性下调,并下调GDNF mRNA和蛋白水平,而组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有相反作用(P < 0.01)。  结论  组蛋白乙酰化通过促进转录因子CREB与GDNF基因启动子区的结合,从而促进胶质瘤中GDNF的高转录。     

MCF-7/Adr细胞mdr-1基因启动子甲基化和组蛋白乙酰化状态与多药耐药的关系

目的：分析MCF-7/Adr及MCF-7细胞mdr-1基因启动子甲基化和组蛋白乙酰化状态,初步探讨乳腺癌多药耐药的表观遗传机制。 方法：用甲基化敏感PCR技术检测两个细胞系mdr-1基因启动子甲基化状态。实时定量PCR技术检测DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs) mRNA及组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases,HDACs) mRNA的表达。光密度值法检测组蛋白H3和H4乙酰化水平。 结果：MCF-7细胞mdr-1基因启动子呈现高甲基化,MCF-7/Adr细胞mdr-1基因启动子呈现低甲基化。与MCF-7细胞比较,MCF-7/Adr细胞DNMT1,DNMT3a及DNMT3b mRNA表达显著下降(P＜0.05)。MCF-7/Adr细胞组蛋白H3和H4乙酰化水平较MCF-7细胞明显升高(P＜0.01)。与MCF-7细胞比较,MCF-7/Adr细胞HDAC1,HDAC2,HDAC7及SIRT1 mRNA的表达显著下降(P＜0.01)。 结论：mdr-1基因启动子低甲基化、组蛋白H3和H4高乙酰化、DNMTs mRNA及HDACs mRNA低表达可能是介导MCF-7/Adr细胞MDR形成的重要表观遗传学因素。     

Curcumin-induced histone acetylation in malignant hematologic cells

This study investigated the inhibitory effects of curcumin on proliferation of hematological malignant cells in vitro and the anti-tumor mechanism at histone acetylation/histone deacetylation levels. The effects of curcumin and histone deacetylase inhibitor trichostatin A （TSA） on the growth of Raji cells were tested by MTT assay. The expression of acetylated histone-3 （H3） in Raji, HL60 and K562 cells, and peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） treated with curcumin or TSA was detected by immunohistochemistry and FACS. The results showed curcumin inhibited pro- liferation of Raji cells significantly in a time- and dose-dependent fashion, while exhibited low toxicity in PBMCs. Curcumin induced up-regulation of the expression of acetylated H3 dose-dependently in all malignant cell lines tested. In conclusion, curcumin inhibited proliferation of Raji cells selectively, enhanced the level of acetylated H3 in Raji, HL60, and K562 cells, which acted as a histone deacetylase inhibitor like TSA. Furthermore, up-regulation of H3 acetylation may play an important role in regulating the proliferation of Raji cells.     

组蛋白去乙酰化下调对肾细胞癌BNIP3基因表达的影响

目的探讨肾细胞癌中线粒体促凋亡蛋白BNIP3表达下调机制。方法运用CCK-8法及流式细胞技术检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A（TSA）对肾癌细胞株786-O、ACHN、A498增殖、凋亡的影响;运用实时荧光定量PCR（Q-PCR）和蛋白质免疫印记（Western blot）技术检测TSA对肾癌细胞BNIP3表达的影响;运用染色质免疫沉淀（ChIP）技术检测TSA对肾癌细胞BNIP3基因启动子区组蛋白H3乙酰化状态的影响。结果经TSA处理后,3种肾癌细胞增殖均受到显著抑制（PBNIP3 mRNA（PBNIP3基因启动子区组蛋白H3呈去乙酰化状态,TSA恢复了其乙酰化状态;A498的BNIP3基因启动子区组蛋白H3呈乙酰化状态。结论BNIP3基因启动子区组蛋白去乙酰化是其在肾癌中表达下调的主要机制,并可能参与了肾癌的发生发展。     

曲古菌素A对人肺癌细胞的诱导分化及其机制的实验研究

目的通过应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A（TSA）调节人肺腺癌细胞A549中组蛋白去乙酰化酶3的表达,观察肺腺癌细胞A549生长抑制、细胞周期阻滞以及对抑癌基因表达的变化。方法培养人肺腺癌细胞A549,应用MTT比色法观察TSA对A549细胞的生长抑制作用,流式细胞术分析细胞周期,以RT—PCR、Western印迹分别检测A549细胞中组蛋白去乙酰化酶3、P^21WAFL/CIPt和蛋白的表达水平。结果TSA处理后A549细胞的生长受到抑制（24h时对照组和各处理组细胞抑制率分别为6．2％±1．1％、18．5％±2．3％、28．9％±3．6％、39．4％±3．7％、45．6％±2．7％,P〈0．05;48h时分别为8．1％±2．3％、26．9％±4．2％、35．6％±3．8％、56．5％±6．1％、69．8％±5．3％,P〈0．05;72h时分别为10．5％±1．3％、28．4％±3．2％、50．5％±5．8％、70．5％±6．9％、78．6％±4．5％,P〈o．05）,细胞阻滞于G1期（对照组和各处理组细胞G1期分布：56．5％±8．1％、70．5％±6．7％、78,6％±4．6％、82．4％±3．7％、85．6％±7．5％,P〈0．05）,P^21WAFL/CIPt基因表达水平增强（对照组和各处理组RT—PCR吸光度分别为o．09、0．17、0．20、0．27、0．35,P〈0．05）。同时TSA处理A549细胞中组蛋白去乙酰化酶3的基因表达水平明显降低。结论TSA可能通过抑制组蛋白去乙酰化酶3,提高组蛋白的乙酰化水平诱导P^21WAFL/CIPt基因表达。     

曲古抑菌素A抑制小鼠CD4+T细胞活化的机制

目的研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对小鼠脾脏CD4+T细胞相关分子的基因转录和表达以及对活化信号转导途径的影响,探讨TSA影响CD4+T细胞活化的作用机制。方法采用2、20、200 nmol/L倍比浓度TSA作用于C57BL小鼠脾脏中分离出的CD4+T细胞24 h,观察对CD3,CD28以及IL-2基因转录和表达的影响;观察TSA对采用抗CD3,CD28单抗激活CD4+T细胞表达蛋白酶ZAP70和PI3K的影响。结果 TSA能抑制CD4+T细胞CD28基因转录和分子表达,且与作用浓度相关;能抑制抗体激活的小鼠CD4+T细胞表达PI3K蛋白,而对CD3分子活化信号下游的ZAP70蛋白的表达无明显影响;TSA还能抑制CD4+T细胞IL-2的基因转录和显著减少激活的CD4+T细胞表达IL-2(P<0.01)。结论 TSA通过抑制CD28基因转录和分子表达,影响激活CD4+T细胞活化过程中共刺激信号向细胞内的传导,减少IL-2的分泌,从而降低CD4+T细胞的免疫活性。     

神经细胞中乙酰化对NOS1基因启动子活性的调节

 目的 探讨乙酰化对人神经母细胞瘤SK-N-SH 细胞中NOS1基因启动子活性的调节作用。方法 构建系列截短的NOS1 5′侧翼序列萤光素酶报告基因载体,应用萤光素酶报告基因检测系统分析SK-N-SH 细胞中NOS1启动子活性,并比较组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A (TSA)刺激前后启动子活性的变化。结果 构建并鉴定了系列截短的NOS1 启动子萤光素酶报告基因载体;在NOS1基因启动子区鉴定了两个正调控区域和两个负调控区域,同时TSA可上调不同长度启动子的转录活性。结论 乙酰化参与调节神经细胞中NOS1基因启动子活性。     

人结肠癌细胞中组蛋白乙酰化对细胞周期调节基因表达的影响

目的 研究组蛋白乙酰化对Colo-320和SW1116人结肠癌细胞系p21^WAF1和p16^INKRA基因表达的影响。方法 培养人结肠癌细胞系SW1116和Colo-320,分别以去甲基化制剂5-氮脱氧胞苷(5-aza-dC)和／或组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂曲古抑菌素(TSA)及丁酸钠(NaBu)干预细胞。运用流式细胞术检测细胞周期变化;以定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法研究控制细胞周期的基因p21^WAF1和p16^INKRA的表达;染色质免疫沉淀技术分析基因相关染色质乙酰化组蛋白的水平。结果 TSA或NaBu使人结肠癌细胞阻滞于G1期,而5-aza-dC并不能改变细胞周期。正常情况下,SW1116和Colo-320细胞中均有较弱的p16^INKRA表达;两种结肠癌细胞系p21^WAF1表达缺如。5-aza-dC干预后,p16^INKRA表达增强,相反p21^WAF1仍无明显表达。当该两个细胞系经TSA或NaBu处理后,p21^WAF1转录水平明显上调,并诱导p21^WAF1基因相关染色质乙酰化组蛋白H3和H4的积聚。结论 两种人结肠癌细胞系中,HDAC抑制剂通过选择性增加p21^WAF1基因相关染色质乙酰化水平,上调p21^WAF1基因的转录,并相应地导致结肠癌细胞生长停滞;而p16^INKRA基因表达主要受甲基化调节。