荧光定量PCR检测土拨鼠肝炎病毒核酸方法的建立

目的建立土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)核酸的荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法,应用于土拨鼠肝炎病毒模型的研究。方法分别根据土拨鼠肝炎病毒核心抗原(WHcAg)和表面抗原(WHsAg)的DNA序列设计13对扩增引物,从中筛选无非特异性扩增及引物二聚体且灵敏度高的引物,用于土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测。建立感染土拨鼠肝炎病毒的土拨鼠血清中WHV核酸的Real-timePCR检测方法。结果根据WHsAg基因的5’端设计的一对引物WHVSF1与WHVSR1,检测灵敏度可达1×101拷贝/μL,病毒拷贝数与Real-time PCR Ct值的标准曲线的R2值为0.997,且电泳未见明显非特异性条带及引物二聚体。结论建立了土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测方法,该方法为进一步研究土拨鼠肝炎病毒模型奠定了基础。     

土拨鼠肝炎病毒转基因小鼠模型的建立

目的:建立土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck hepatitis virus,WHV)转基因小鼠模型,以用于嗜肝病毒感染的发病机制研究。方法:采用微注射技术将1.3-倍WHV基因[野生型和WHV S抗原(WHV surface antigen,WHsAg)缺陷型]注射入C57BL/6xC3H小鼠的胚胎,然后与C57BL/6小鼠回交,建立WHV转基因小鼠。肝内WHV DNA复制和mRNA表达水平分别采用Southern杂交和real-time RT-PCR检测,血清中WHV病毒载量采用real-time PCR检测,HE染色进行肝组织病理学检测,ELISA检测血清中WHV核心抗体,流式细胞仪检测WHV核心抗原(WHV core antigen,WHcAg)特异性细胞毒性T淋巴细胞。结果:成功建立野生型WHV转基因小鼠和WHsAg缺陷型转基因小鼠。WHsAg缺陷型小鼠肝内WHV复制水平显著高于野生型小鼠,野生型WHV转基因小鼠血清WHV载量104¹08copies/mL。而且雄性小鼠肝内和血清WHV复制水平显著高于雌性小鼠。16周龄以上的WHV转基因小鼠约半数血清可检测出高滴度的WHV核心抗体。而且少数转基因小鼠可以检测到WHcAg特异性细胞毒性T淋巴细胞。结论:这种新建的WHV转基因小鼠肝内可检测到病毒复制和mRNA表达,血清有高水平的WHV病毒载量,可以用于嗜肝病毒感染的发病机制、抗病毒治疗等研究。     

DNA疫苗诱导的免疫应答控制土拨鼠肝炎病毒复制

目的:研究DNA疫苗在嗜肝病毒慢性感染的个体诱导产生的细胞和体液免疫应答水平,及其对嗜肝病毒复制的抑制作用,探索打破病毒特异性免疫耐受的新途径。方法:利用土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)转基因小鼠模型,采用WHV核心抗原(WHV core antigen,WHc Ag)的真核表达质粒(p WHc Im和p CGWHc)作为DNA疫苗免疫3次后,分别采用流式细胞仪检测WHc Ag特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxical T cells,CTL),ELISA检测血清抗-WHc抗体水平,realtime PCR检测血清WHV DNA载量。结果:DNA疫苗在转基因小鼠体内诱导高水平的抗-WHc-Ig G2a抗体和WHc Ag特异性的CTL应答,而且DNA疫苗介导的免疫应答显著抑制WHV复制。与对照组相比,DNA疫苗处理使WHV转基因小鼠血清病毒载量下降2~3个Log值,其中p CGWHc免疫组的6只小鼠中3只血清DNA降至检测低限以下。结论:DNA疫苗可以在转基因小鼠体内诱导产生强烈的细胞和体液免疫应答,并控制WHV复制,提示DNA疫苗在打破嗜肝病毒特异性免疫耐受中具有重要作用,有可能开发成为乙型肝炎治疗的新方法。     

重组8型腺相关病毒（rAAV8-1.3HBV）介导HBV急性感染树鼩模型建立

【摘要】 目的 利用重组8型腺相关病毒介导1.3拷贝HBV基因组（1.3HBV,ayw亚型）在树鼩肝脏表达,建立HBV急性感染树鼩模型。 方法 通过大腿内侧静脉注射将携带有1.3 HBV的重组8型腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus 8,rAAV8-1.3HBV）导入树鼩肝脏,通过ELISA检测树鼩血清中HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAb,荧光定量PCR检测树鼩肝脏和血清中HBV DNA,全自动生化分析仪检测血清中ALT水平,并观察感染后肝脏的病变情况。结果 HBV感染主要血清标志物1-2周内均检测阳性;30天后肝组织仍可检测到病毒抗原阳性细胞;55天时肝组织HBV DNA拷贝数仍可达到104 -105 ;树鼩血清中HBV DNA拷贝数持续一个月高于正常组;肝组织炎细胞略增多,血清ALT水平持续升高。 结论 rAAV8所携带的HBV基因组高效专一导入树鼩肝细胞并复制表达,成功建立HBV急性感染树鼩模型,为进一步探索rAAV8树鼩慢性感染模型打下一定的基础。     

解酒护肝饮对酒精性肝病大鼠肝功能损伤的保护作用

目的:观察解酒护肝饮对酒精性肝病大鼠肝脏指数及肝功能的影响,为临床酒精性肝病的预防提供实验依据。方法:将大鼠随机分为6组,正常组、模型组、解酒护肝饮低剂量组、解酒护肝饮高剂量组、葛花解酲汤组和益肝灵组。采用白酒灌胃造模,造模与给药同时进行。6周后测定肝脏指数及血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。结果:模型组肝脏指数较正常组明显降低,血清AST、ALT明显升高;解酒护肝饮低剂量组、解酒护肝饮高剂量组、葛花解酲汤组和益肝灵组的肝脏指数均较模型组明显提高,血清AST、ALT明显降低;各预防治疗组之间的比较提示,以高剂量解酒护肝饮作用最为显著。结论:解酒护肝饮能有效预防大鼠酒精性肝病。     

CpG联合恩替卡韦在体内诱导早期病毒学应答抑制土拨鼠肝炎病毒的复制

目的:研究CpG寡脱氧核苷酸对嗜肝病毒复制和基因表达的抑制作用及其作用机制,探索抗病毒治疗的新方法。方法:利用土拨鼠肝炎模型研究P类CpG的免疫刺激和抗病毒活性。土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)慢性感染的土拨鼠12只分为4组,分别接受CpG皮下注射(4 mg/kg,每周1次,共16周)、恩替卡韦(entecavir,ETV)饲养(0.5 mg·kg-1·d-1,共12周)、CpG联合ETV治疗,或不处理作为对照。在处理后的第1、2、3天,1、2、3、4、8、12、16、20、24和28周,采用定量PCR检测血清WHV载量和PBMC内ISGs mRNA的水平,ELISA检测WHs Ag(WHV surface antigen)水平,生物活性分析血清IFN水平。结果:相比对照组和CpG或ETV单独治疗组,CpG联合ETV治疗显著抑制WHV的复制和表达,出现早期病毒学应答并强烈抑制血清WHs Ag抗原水平。CpG联合ETV治疗组的4只动物中有3只在治疗的13~17周后血清WHs Ag低于检测下限。另外,接受CpG治疗的大部分动物血清中检测到IFN、PBMC中Mx A mRNA显著上调(10~100倍)。结论:P类CpG在慢性WHV感染的土拨鼠体内诱导天然免疫,从而产生强烈的病毒抑制作用。通过优化方法达到长期持续的病毒抑制效果,将促进在HBV感染的个体开展类似的研究,从而开发成为乙型肝炎治疗的新方法。     

茵芍散体内抗DHBV实验研究

目的观察茵芍散体内以抗鸭乙肝病毒(DHBV)的作用。方法用PCR法筛选鸭乙肝病毒(DHBV)阳性血清,经静脉注射感染3日龄麻鸭,建立DHBV实验模型。将DHBV阳性麻鸭40只随机分为茵芍散高、中、低剂量组,拉米夫定组和模型对照组,常规饲养的同时分别给予不同剂量的药物干预。用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测血清DHBV DNA含量,ALT和AST水平,光学显微镜下观察肝组织病理改变。结果茵芍散各剂量组用药后血清DHBV DNA含量显著降低(P0.01),其疗效与剂量和治疗时间密切相关。停药7 d后,茵芍散低剂量组和阳性对照组血清DHBV DNA有反跳现象,而茵芍散中、高剂量组血清DHBV DNA没有反跳现象。结论茵芍散有抑制DHBV DNA及降低血清转氨酶、改善肝脏炎症的作用。     

非酒精性脂肪性肝炎模型的建立

目的建立大鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）模型。方法将♂SD大鼠,随机分为正常组（n=15）和模型组（n=15）。两组动物均给以普通饲料,模型组每天ig高脂、高糖、高蛋白乳剂,剂量递增。实验持续6周后,检测血清ALT、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C及肝脏TC、TG,并行病理组织学检查。结果模型组大鼠血清ALT、AST、TC、HDL-C、LDL-C及肝脏TC、TG均显著增高;病理组织学检查提示模型组大鼠肝细胞呈现弥漫性脂肪变性伴肝小叶炎症坏死。结论利用改良乳剂灌胃的方法,成功复制出大鼠NASH模型。     

慢性病毒性肝炎合并胆汁淤积患者应用不同剂量思美泰治疗的效果比较

目的:探究慢性病毒性肝炎合并胆汁淤积患者应用不同剂量思美泰治疗的效果.方法:选择我院2015年6月-2016年2月慢性病毒性肝炎合并胆汁淤积患者128例随机分组.小剂量组采取低剂量思美泰治疗;大剂量组采取高剂量思美泰治疗.比较两组患者慢性病毒性肝炎合并胆汁淤积治疗效果;治疗前后TBA水平、ALT水平、AST水平;瘙痒症状消失时间、黄疸消失时间.结果:大剂量组患者慢性病毒性肝炎合并胆汁淤积治疗效果比小剂量组高,P<0.05;在治疗前两组TBA水平、ALT水平、AST水平无显著差异,P>0.05.大剂量组治疗前后TBA水平、ALT水平、AST水平比小剂量组好,P<0.05;大剂量组瘙痒症状消失时间、黄疸消失时间比小剂量组低,P<0.05.结论:慢性病毒性肝炎合并胆汁淤积患者应用大剂量思美泰治疗的效果优于小剂量,可更好改善临床症状和肝功能,值得推广应用.     

ADA与ALT、AST、GGT联合检测在肝脏疾病诊断中的意义

目的探讨血清腺苷脱氨酶（ADA）与ALT、AST、GGT联合检测在各类肝脏疾病诊断中的临床价值。方法采用日立7600全自动生化分析仪分别对160例肝病患者和60例正常对照组血清ADA、ALT、AST和GGT进行联合检测。结果各种肝病患者ADA、ALT、AST和GGT与正常对照组相比均明显升高：ADA的阳性检出率在肝癌,肝硬化,急性肝炎和慢性肝炎分别为76.7%,94.7%,83.3%和55.0%。ALT和GGT在各种肝病患者中均有不同程度的升高（P均〈0.01）。AST在肝癌有明显升高（P〈0.05）,在肝硬化,急性肝炎和慢性肝炎中有显著升高（P均〈0.01）,其阳性检出率均在80%以上。急性肝炎时,ALT和AST阳性检出率达到100%。结论血清ADA与ALT、AST、GGT联合检测是协助诊断肝脏疾病的良好指标。     

新生与成年土拨鼠肝组织中部分差异表达的基因比较分析

目的 新生土拨鼠感染土拨鼠肝炎病毒后,大部分发展为慢性肝炎,而成年土拨鼠感染后则多发生急性自限性肝炎[1]。本实验目的就是寻找其肝组织中可能导致这种预后差异的关键基因。 方法 采用全基因组表达谱芯片技术,对比新生与成年小鼠肝组织基因表达差异,选取目的基因,再通过多个物种序列比对,设计简并引物,在土拨鼠肝组织cDNA中扩增对应基因,测序,再次设计引物,进行实时荧光定量PCR。 结果 与新生土拨鼠相比,成年土拨鼠肝细胞中与钙离子重吸收相关基因DNM1（Dynamin 1）、DNM3（Dynamin 3）及Prkcc（Protein kinase C,gamma）表达率明显升高,分别上升2.65?.25倍,1.90?.34倍,2.94?.54倍。 结论 在钙离子重吸收通路中,以上三个在两组动物肝脏中表达差异最明显的基因,在新生组与成年组土拨鼠之间也有明显差异。此类基因造成肝细胞内钙离子浓度的差别,间接影响其中肝炎病毒的复制。这种表达差异很可能是导致两个年龄段动物感染土拨鼠肝炎病毒后转归不同的原因之一。     

乙型肝炎患者血清HBV-DNA表达水平及其临床意义

目的　探讨乙型病毒性肝炎患者血清HBV DNA的表达水平及其与乙肝标志物的相互关系。方法　用定性PCR法和定量PCR同步检测 144例乙肝患者血清HBV DNA ,同时用ELISA法检测血清乙肝标志物。结果　定性PCR与定量PCRHBV DNA总体阳性率相同 ,均为 78 47%(113/ 144 )。乙肝患者血清HBV DNA平均滴度 (每毫升拷贝数 )为 4 3× 10 3 ,其中急性肝炎、慢性肝炎轻度、慢性肝炎中度、慢性肝炎重度、肝炎后肝硬化者血清HBV DNA平均滴度分别为 2 7× 10 3 、6 7× 10 2 、2 5× 10 5、6 .9× 10 5、9 9×10 4 。相互比较 ,差异有显著性 (P <0 0 1)。HBeAg( )、HBeAg(- )患者血清HBV DNA平均滴度分别为 3 1× 10 5、6 7× 10 2 ,差异有显著性 (P <0 0 1)。结论　HBeAg( )患者血清中HBV DNA水平高 ,定量PCR可更准确反映体内HBV增殖水平和传染性强弱     

不同种雏鸭建立鸭乙肝病毒感染模型及抗病毒效果的实验研究

目的：探讨不同种雏鸭建立鸭乙肝病毒感染模型的影响因素,观察应用该模型抗病毒的效果。方法：采集鸭血清,应用PCR方法定性检测鸭血清中病毒DNA;定量PCR方法检测鸭血清中病毒DNA载量变化;用抗病毒药物处理,观察其在鸭DHBV感染模型中的抗病毒效果。结果：不同种鸭DHBV自然感染率不同,樱桃谷鸭为8.75%,湖北麻鸭两个批次分别为17.80%和10.68%;静脉注射和腹腔注射两途径均能致雏鸭感染DHBV,静脉注射感染率80%,腹腔注射感染率65%;鸭感染DHBV后,体内病毒载量维持在106~108拷贝/mL,可持续20天以上;抗病毒药物处理后,在不同DHBV模型中其抗病毒效果变化趋势一致。结论：鸭的种类和人工感染途径可影响DHBV感染率;雏鸭感染DHBV后其体内有持续性的病毒血症;DHBV感染模型是药物抗病毒研究较好模型。     

丁型肝炎抗体诊断试剂的研制

取乙型肝炎患者Delta抗体(抗—HD)阳性血清,经硫酸铵盐析和DE—52柱层析,得到纯化的抗—HD抗体,用辣根过氧化物酶标记。用丁型肝炎病毒(HDV)感染慢性携带土拨鼠肝炎病毒的东方土拨鼠(Woodchuck)后,取其肝组织制成匀浆,离心后经Sepharose 4B柱,免疫亲和层析柱,获得高丰度的HDAg。双抗体夹心法测定其滴度高达1∶10~6。制备成ELISA竞争抑制法检测抗HD试剂盒,其特异性、敏感性、重复性与爱尔兰同种试剂比较结果一致。     

阿德福韦酯对慢性乙肝患者血清Thl／Th2类细胞因子、肝功能及HBV DNA复制的影响

目的研究阿德福韦酯对慢性乙肝患者血清Thlfrh2类细胞因子、肝功能及HBVDNA复制的影响机制。方法100例慢性乙肝患者随机分为观察组（阿德福韦酯＋常规治疗）和对照组（常规治疗）各50例,比较两组的疗效及治疗前后IFN-γ、IL-4、IFN-γ／IL-4及肝功能、HBVDNA复制、应答情况。结果观察组的疗效明显高于对照组,观察组和对照组IFN-γ、IFN-γ／IL-4治疗后均较治疗前明显升高,IL-4较治疗前明显降低,ALT、TBil治疗后均较治疗前明显降低,ALB较治疗前明显升高,且观察组较对照组变化更显著（P〈0．05）。治疗12周、16周、24周、36周、48周时,观察组HBVDNA≤105拷贝,mL、HBVDNA〈104拷贝／mL均明显多于对照组。治疗16周以后,观察组HBVDNA〈103拷贝／mL多于对照组。治疗12周、16周时,观察组和对照组均无完全应答,但观察组部分应答比例明显高于对照组。治疗24周、36周、48周时,观察组完全应答和部分应答比例均明显高于对照组。结论阿德福韦酯治疗慢性乙肝疗效确切,能明显抑制HBV复制,促进A¨复常,且还能通过免疫调节作用抑制病毒复制,值得临床推广和应用。     

病毒性肝炎患者血清庚型肝炎RNA的检测

目的：了解A—C型及非A～非E型病毒性肝炎患者庚型肝炎病毒（HGV）的感染情况。方法：对103名病毒性肝炎患者采用ELISA和RT-PCR检测HGV—RNA，根据不同病原类型和不同临床类型的肝炎患者对庚型病毒的感染情况进行分析。结果：不同病原肝炎患者中，乙型肝炎患者HGV-RNA的阳性率为33．3％，明显高于其他类型的肝炎患者（P〈0．01），在不同临床类型的肝炎患者中，慢性肝炎患者HGV—RNA的阳性率为32．6％，明显高于其他临床类型的肝炎患者（P〈0．01）。结论：HGV是病毒性肝炎的病原之一，在病毒性肝炎患者中感染率较高，并常与其他类型的肝炎病毒合并感染。     

乙型肝炎病毒母婴垂直传播与乙肝抗原及乙肝DNA载量的关系研究

目的研究妊娠合并乙型肝炎病毒感染孕妇母婴垂直传播相关因素。方法选择妊娠合并乙型肝炎病毒感染孕妇100例作为研究对象,对患者病病历资料作回顾性分析。结果 HBsAg单阳性孕妇母婴垂直传播几率1.75%较HBsAg、HBeAg双阳性母婴垂直传播几率46.51%低,差异有统计学意义（P〈0.05）。外周血HBV DNA≥106copies/mL的产孕妇分娩后胎儿HBV DNA阳性率50.0%较HBV DNA≤105copies/mL和105copies/mL。     

乙型肝炎患者血清中分泌型IgA水平与HBV DNA含量的关系

湖北省鹤峰县人民医院检验科,鹤峰 445800目的 研究乙型肝炎患者血清中分泌型IgA(SIgA)水平与乙型肝炎病毒(HBV)DNA含量的关系,为临床提供一个新的评价HBV复制状态及肝细胞损伤的指标。方法 100份经ELISA检测并确诊为乙型肝炎的患者血清用荧光定量PCR检测HBV DNA的拷贝数,用ELISA并经酶标仪定量其SIgA的量。结果 SIgA的含量与HBVDNA的拷贝数的对数呈正相关(r=0.69,P<0.01),在HBsAg( )/HBeAg( )/HBcAb( )组和HBsAg( )/HBeAb( )/HBcAb( )组中SIgA含量差异无显著性意义(P>0.05),而HBV DNA拷贝数前者明显高于后者(P<0.01)。结论 乙型肝炎患者血清SIgA的含量在评价HBV的传染性及肝细胞损伤程度方面比乙型肝炎血清学标志物(HBV-M)更灵敏、准确。     

恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎53例疗效分析

目的：评价恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎（CHB）12个月的疗效和安全性.方法：选择CHB患者53例给予恩替卡韦0.5 mg/d抗病毒治疗12个月,53例患者治疗前乙型肝炎病毒（HBV）DNA载量分为107～109、105～106、104 copies/L进行分层,分别观察服药后1、3、6、12个月时HBV DNA载量,丙氨酸氨基转氨酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转氨酶（AST）变化情况.结果：恩替卡韦对治疗前HBV DNA载量分别为107～109、105～106、104均具有较强的抑制作用;治疗后随着时间推移HBV DNA载量下降越明显,治疗前HBV DNA载量越低服药后HBV DNA载量越快达到正常值,治疗前后差异均有统计学意义（P＜0.05～P＜0.01）.恩替卡韦抑制HBV DNA的同时伴随ALT、AST的下降,治疗前HBV DNA载量越低,治疗后12个月ALT、AST复常率越高,治疗前后差异均有统计学意义（P＜0.05～P＜0.01）.结论：恩替卡韦对CHB患者HBV有很强的抑制作用,在抑制病毒复制的同时能改善肝功能.