人IL—12双亚基共表达载体的构建及其表达

构建人ＩＬ－１２的高效表达载体。方法采用ｐＣＤＮＡ３．１从已克隆ｐ４０ｃＤＮＡ基因与国外提供的ｐ３５ｃＤＮＡ基因上获得相应的编码荐因，分别构建表达载体进行转染。此后，又利用ｐＬＸＰＸＳＮ构建ＩＬ－１２双亚基共表达的逆转录病毒载体转导人肝癌细胞株，并经Ｇ４１８筛选。结果有功能活性的ＩＬ－１２的产生需要ｐ３５和ｐ４０基因的等量共转染，为此，人ＩＬ－１２双亚基共表达载体在转肝癌细胞株并经选择后，上清液中     

重组人单链白细胞介素12融合基因（rhscIL—12）的构建和真？…

目的 克隆人ＩＬ－１２（ｈＩＬ－１２）ｐ４０和ｐ３５亚单位ｃＤＮＡ，构建人单链ＩＬ－２（ｒｈｓｃＩＬ－２）融合基因，并在哺乳动物细胞中进行表达。方法从经ＰＤＢｕ刺激的ＥＢＶ转化的人Ｂ淋巴细胞株ＮＣ３７中提取ｍＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ分别获得ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位编码序列的ｃＤＮＡ，运用重组ＰＣＲ技术将两段基因通过一疏水性多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＤＮＡ序列进行体外基因重组，构建ｒｈｓｃＩ     

携带内皮型一氧化氮合酶基因重组腺病毒载体的构建

目的：构建带有内皮型一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）基因的重组腺病毒载体。方法：将ｅＮＯＳ　ｃＤＮＡ克隆于腺病毒穿梭质粒ｐＣＡ１４，得到重组质粒ｐＣＡ１４－ＣＭＶ－ｅＮＯＳ。采用磷酸钙ＤＮＡ沉淀法将质粒ｐＣＡ１４－ＣＭＶ－ｅＮＯＳ与腺病毒拯救质粒ｐＢＨＧ１０共转染２９３细胞，通过同源重组，生成带有ｅＮＯＳ基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（ＡｄＣＭＶｅＮＯＳ）。ｅＮＯＳｃＤＮＡ重组进入腺病毒Ｅ１区并受ＣＭＶ启动子控制。结果：经形态学、病毒ＤＮＡ酶切、ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ等方法的鉴定，证实了载体构建的正确性。结论：带有ｅＮＯＳ基因的重组腺病毒载体的成功构建，为心血管等疾病的基因治疗打下了基础。     

细胞因子对HCV基因疫苗诱生免疫反应的增强作用

目的 探讨细胞因子对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因疫苗诱生免疫应答强度的增强作用。方法 将包含ＨＣＶ－Ｃ蛋白的基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,构建重组质料ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,将此重组质粒单独或与包含鼠ＩＬ－２或ＩＬ－１２基因的表达质粒共免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,ＥＬＩＳＡ法检测ＨＣＶ Ｃ特异性抗体产生情况,以ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ转梁小鼠ＳＰ２／０细胞,表达ＨＣＶ Ｃ抗原为靶细胞,进行     

携带人尿激酶原cDNA的重组腺病毒载体的构建及其在体内的表达

目的 构建表达人尿激酶原的重组腺病毒载体,为临床基因治疗提供实验依据。方法 采用亚克隆获得的ｐＣＡ１４－ｐｒｏ－ＵＫ重组质粒与质粒ｐＪＭ１７共转染培养的２９３细胞,经同源重组,得到含有ｐｒｏ－ＵＫ ｃＤＮＡ的重组腺 主增纯化后,局部转染经球囊损伤后的兔股动脉。７天后,分别收集转染的血因管段,以Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹和免疫组化检测表达。结果 （１）经ＰＣＲ扩增及体外感染Ａ５４９细胞结果表明,获得了具有生     

重组人促红细胞生成素在COS-7细胞内表达的研究

目的：研究不同真核载体对人促红细胞生成素ｃＤＮＡ的表达效率。方法：人促红细胞生成素ｃＤＮＡ分别用真核表达载体ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＩ、ｐＡｄＣＩ进行重组，脂质体法转化ＣＯＳ ７细胞，以ＴＦ １细胞检测ＥＰＯ的表达活性。结果：感染ｐｃＤＮＡ３ ＥＰＯ，ｐｃＤＩ ＥＰＯ，和ｐＡｄＣＩ ＥＰＯ的ＣＯＳ ７细胞培养上清中人促红细胞生成素活性分别为０５×１０２，１５×１０３和２２×１０２。结论：已构建成可表达具生物活性的重组人促红细胞生成素的真核表达克隆，嵌合内含子序列可增强人促红细胞生成素ＣＤＮＡ的表达效率     

定点整合型基因治疗腺病毒载体的构建

目的：构建定点整合型基因治疗腺病毒载体。方法：以逐步亚克隆法将腺病毒伴随病毒的两个末端倒转重复序列与ｎｅｏ基因表达盒克隆至ｐＡｄＥ１ＣＭＶ，其中ＨＣＭＶ启动子控制下的ｎｅｏ基因表达盒位于腺病毒两个末端倒转重复序列之间，将得到的转移载体ｐＡｄＥ１ｅｍｖｉｔｒｅｘｎｅｏ ＤＮＡ和ｐＪＭ１７ ＤＮＡ以脂质体法共转染２９３细胞、Ｇ４１８法连续筛选重组腺病毒，以病毒核酸酶切及感染２９３细胞的ＣＰＥ观察鉴定是     

t－PA cDNA基因在CHO细胞中的稳定表达

建立稳定表达人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）的细胞株。将ｔ－ｐＡｃＤＮＡ连接在真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＨｉｎｄⅢ位点，构建成重组质粒ｐｃＤＮＡ３ｔＰＡ，用磷酸钙介导的贴壁细胞转染法导入哺乳动物中国仓鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞中，Ｇ４１８筛选培养后形成阳性克隆。结果：培养液中重组ｔ－ｐＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔ－ｐＡ，ｒｔ－ｐＡ）活性＞６０００ＩＵ／１０６细胞ｄ－１．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的转录。高表达细胞连续传代１０次后，培液中ｒｔ－ｐＡ活性未见明显变化。结论：转染ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的ＣＨＯ细胞已形成稳定的工程细胞。     

重组人白细胞介素12基因在COS－7细胞的高效表达

将分别含有重组人ＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）两个亚单位ｃＤＮＡ的高效真核细胞表达载体，通过ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ改良方法，共转染至ＣＯＳ－７细胞中。结果高效表达了ｒｈＩＬ－１２蛋白，表达量为６００Ｕ／ｍｌ；并研究其对人ＰＢＭＣ的促增殖作用和增加ＮＫ细胞毒活性的作用，为进一步研究ＩＬ－１２的生物学功能奠定了基础。     

腺病毒介导的反义c-myc选择性诱导肿瘤细胞G1期阻滞和凋亡的研究

目的 构建介导反义ｃ－ｍｙｃ的重组腺病毒,研究其对人肺腺癌细胞的细胞周期,增殖和凋亡的影响。方法 将ｃ－ｍｙｃ基因反向克隆于穿梭质粒载体ｐＡｄＣＭＶ中,通过脂质体与ｐＪＭ１７共转染２９３细胞,经同源重组产生编码反义ｃ－ｍｙｃ的重组腺病毒。体外观察和检测重组腺病毒感染人肺腺癌细胞系ＧＬＣ－８２和ＳＰＣ－Ａ－１以及人胚肺二倍体细胞２ＢＳ后,细胞周期的改变,凋亡的发生和相关基因表达的变化;体内观察对肿瘤     

p53重组腺病毒载体的构建

目的　构建 p5 3重组腺病毒载体以研究 p5 3过度表达与腺病毒感染对细胞生长的影响 .方法　将 p5 3c DNA克隆到转移载体 p Ad CMV/ p5 3重组质粒 ,用该重组质粒及p JM1 7质粒共转染 2 93细胞获得重组腺病毒 ,PCR法筛选含p5 3c DNA的重组病毒 .结果　在挑选的 5个空斑中 ,有 4个含 p5 3c DNA阳性重组腺病毒 .p5 3重组腺病毒可感染 2 93细胞并在 2 93细胞内进行有效的复制 .结论　成功构建了 p5 3重组腺病毒 ,为进一步研究 p5 3重组腺病毒的功能提供了条件     

重组复制缺陷型腺病毒AdIL-10构建及其在HSC中的表达

目的利用AdEasy系统构建重组复制缺陷型腺病毒AdIL-10，并观察其在肝星状细胞(HSC)中的表达。方法从SD大鼠脾脏单核细胞中抽提总RNA，通过RT—PCR获得鼠IL-10 cDNA片段，插人穿梭质粒pAdTrack巨细胞病毒(CMV)启动子下游，构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-IL-10，线性化后与AdEasy-1电穿孔共转化BJ5183，获得重组腺病毒质粒pAdIL-10。pAdIL-10用Lipofectamin包装转染HEK 293细胞，获得重组腺病毒AdIL-10。将AdIL-10体外感染HSC，3d后抽提HSC总RNA，以RT—PCR检测IL-10的表达。结果通过酶切和测序法筛选出pAdIL-10；经293细胞包装，3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达；AdIL-10感染HSC3d后观察到GFP表达，通过RT—PCR可检测到IL-10的表达。结论利用AdEasy系统可制备重组腺病毒AdIL-10；AdIL-10感染HSC后可表达IL-10。     

携带表皮生长因子受体反义cDNA的重组腺病毒的构建

目的构建携带参与细胞周期调控的表皮生长因子受体(EGFR)反义cDNA的重组腺病毒载体。方法将1032 bp EGFR反义cDNA片段正向及反向插入腺病毒载体质粒pA dT rack-CM V上,与骨架质粒在大肠杆菌B J5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带EGFR反义cDNA的重组腺病毒A dE asy-GFP-EGFR-sense/an tisense。结果成功地构建了A dE asy-GFP-EGFR-sense/an tisense的重组腺病毒载体系统,经测定腺病毒载体滴度分别2.2×109efu/mL和2.5×109efu/mL。结论构建的重组腺病毒A dE asy-GFP-EGFR-an t-isense可望有效地将EGFR-an tisense cDNA基因导入喉癌细胞株/组织内,为进一步研究喉癌细胞信号转导干预机制和治疗研究提供实验基础。     

重组人白细胞介素10基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆编码人白细胞介素10（hIL-10）基因的全长cDNA,构建真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中进行表达.方法：应用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10 cDNA,将测序正确的hIL-10 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体.采用磷酸钙法转染CHO细胞,用ELISA法检测hIL-10基因的表达,用单四唑（MTT）检测hIL-10蛋白的活性.结果：RT-PCR产物插入Teasy载体,经序列测定证实hIL-10基因全序列克隆成功.在CHO细胞培养上清中有hIL-10的表达,该产物能抑制淋巴细胞转化.结论：成功构建了真核表达质粒pcDNA3-hIL-10,为进一步研究hIL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病中的作用打下了基础.     

Cyclin B1正、反义全长cDNA腺病毒载体的构建及对HeLa细胞增殖和凋亡的影响

目的 利用pAd/CMV/V5-DEST腺病毒载体系统构建含有人细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)正、反义全长Cdna的重组腺病毒,并研究其对人宫颈癌细胞株HeLa增殖及凋亡的影响.方法 通过RT-PCR获取Cyclin B1全长Cdna,分别以正、反方向插入Pentr11,与pAd/CMV/V5-DEST进行同源重组后获得正确的重组腺病毒质粒,经293A细胞包装扩增获得重组病毒颗粒.重组腺病毒体外感染HeLa细胞,通过细胞计数和流式细胞术观测其对细胞增殖及凋亡的影响.结果 Cyclin B1基因成功克隆到载体上,并经293A细胞包装出病毒颗粒.此重组腺病毒感染HeLa细胞后,反义Cyclin B1能明显抑制细胞的生长并且促进细胞凋亡.结论 成功构建了携带人Cyclin B1正、反义全长Cdna的重组腺病毒载体,此载体可在HeLa细胞中发挥生物学作用.     

携带人分泌型内皮抑素基因重组腺病毒的制备和鉴定

目的制备包含人分泌型内皮抑素基因的重组腺病毒,为下一步探讨其在血管生成依赖性疾病的治疗研究中的应用提供基础。方法以T-Endostatin质粒为模板,通过PCR扩增回收hEndostatin,将hEndostatin连接到pShuttle2中,构建pShuttle2-hEndostatin表达质粒,将此表达质粒连接到缺陷型腺病毒载体,构建Ad-hEndo。其线性化后转染HEK293T细胞,纯化后的重组腺病毒Ad-hEndo在HEK293T细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,并测定其滴度。结果利用PCR反应进行鉴定,扩增得到的hEndostatin经酶切鉴定,DNA测序证实为重组腺病毒,测定病毒滴度为5.2×109PFU/ml。结论本实验成功构建了人分泌型内皮抑素重组腺病毒Ad-hEndo,可直接用于血管生成依赖性疾病基因治疗的实验研究。     

SLC基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid organ chemokine, SLC)基因的重组腺病毒.方法 采用PCR技术从含有SLC基因的质粒上扩增出SLC基因,将PCR产物酶切后连接至pENTR11载体上,再通过pENTR11与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST之间的同源重组作用将SLC基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后经293细胞的包装扩增后得到携带SLC基因的重组腺病毒.结果 成功将SLC基因片段克隆至pAd/CMV/V5- DEST载体上,并经293细胞包装出病毒颗粒;经测定病毒滴度为2.6×108 pfu/mL.结论 构建的重组SLC腺病毒可将SLC基因导入肿瘤细胞或组织内,为进一步研究SLC基因的抗肿瘤作用提供了基础.     

人血管内皮细胞生长因子165重组腺病毒的构建及其在真核细胞中的表达

目的:体外构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的腺病毒表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:从重组质粒pcDNA3/hVEGF165中获得hVEGF165,经酶切及测序鉴定,将hVEGF165基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,重组穿梭质粒经酶切线性化后,与pAEdasyl质粒在大肠杆菌BSJ183中进行同源重组,线性化后转染HEK293细胞进行包装扩增获取重组病毒上清,同时应用RT-PCR及ELISA法检测hVEGF165的表达。结果:目的基因的测序结果与人VEGF165序列(Genbank)相符。转染后经RT-PCR和ELISA检测证实转染重组质粒组hVEGF165 mRNA及蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到hVEGF165的表达。结论:本研究构建了人VEGF165重组腺病毒表达载体pAd-hVEGF165,并能成功地在HEK293细胞中表达。     

人白介素24腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建人白介素24（hIL-24）的腺病毒载体，获得hIL-24重组腺病毒子，为hIL-24进行肿瘤的基因治疗奠定基础。方法以pcDNA3．0-hIL-24重组质料为模板，PCR扩增hIL-24，酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack—CMVR质粒上，PmeI线性化重组质粒pAdTrack—CMV-hIL-24，与腺病毒质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌，获得重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-hIL-24，经Pacl线性化后转染QBI-293A包装细胞。收获腺病毒重组病毒子，RT-PCR和Western—blotting鉴定。结果测序结果显示hIL-24序列正确，RT—PCR和Western-blotting检测到了hIL-24的表达。结论成功构建人白介素24的重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack，CMV—hIL-24。获得了人白介素24重组病毒子Ad-hIL-24。     

人鸟氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶双反义腺病毒载体的构建

目的：构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)第三外显子和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)翻译起始位点双反义RNA腺病毒载体。方法：应用RT-PCR方法扩增出SAMDC mRNA翻译起始位点区205 bp的基因片断。插入PMD-18T载体中．经XbaI、XhoI酶切回收，反向插入穿梭质粒pAdTrack-CMV-ODCr，形成重组质粒pAdTrack-ODC-SAMDCr。经PmeI酶切线性化后，转入Adeasy-1细菌与pAdeasy-1质粒发生同源重组。挑选阳性重组质粒pAdeasy-ODC-SAMDCr，经PacI酶切后，转染293细胞，包装出腺病毒颗粒．经荧光显微镜和PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果：利用RT-PCR方法成功地从大肠癌细胞扩增出205bp的cDNA片断，经测序证实为SAMDC翻译起始位点序列。测序证实，重组质粒pAdTrack-ODC-SAMDCr两个基因插入方向和序列均正确．转入Adeasy-1细菌获得多个阳性重组克隆。pAdeasy-ODC-SAMDCr转染293细胞进行包装扩增．可见明显病毒空斑形成，荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在293细胞中表达．PCR法证实含有目的基因。结论：成功构建并扩增出ODC和SAMDC双反义RNA腺病毒载体．为以后肿瘤的基因治疗和预防研究提供了必要工具。