MAPs技术合成抗原肽在戊型肝炎诊断中抗原性初探

目的　将多聚抗原肽 (MAPs)技术用于免疫测定 ,为诊断戊型肝炎寻找更好的诊断试剂盒。方法　根据戊型肝炎病毒 (HEV)开放阅读框架 2 (ORF2 )中含有的抗原表位 ,从戊型肝炎病毒中国株蛋白的氨基酸序列中选取S 30段抗原肽 ,用固相合成法分别进行化学合成普通线形抗原肽和MAPs肽段 ,并用ELISA分别检测其抗原性。结果　与国外试剂盒相比较 ,两者的符合率有差异。但MAPs肽段的符合率高于普通线形抗原肽 ,在检测灵敏度、特异性上MAPs肽段明显优于普通线形抗原肽。结论　以单一的戊型肝炎的抗原表位肽检测戊型肝炎存在漏检。在MAPs技术的基础上 ,合成多肽抗原的灵敏度得到明显提高。     

急性散发性肝炎病人中戊型肝炎病毒Ⅰ型Ⅳ型感染部分核苷酸序列的分析

目的：探讨戊型肝炎Ⅰ型与Ⅳ型病毒感染在急性散发性肝炎病人中的感染情况。方法：应用逆转录聚合酶链反应（PCR）检测急性肝炎病人血清HEV RNA，并对阳性产物进行核苷酸序列分析。结果：RT－PCR检测31例急性散发性戊型肝炎病人血清HEV RNA阳性，序列分析证明：21例与缅甸株（B）、中国株（Ch1.1）的核苷酸序列同源性为94－98.9%，属于同一基因型，其余10例变异较大，其核苷酸序列与株、中国株、墨西哥株、美国株的同源性分别为75.3-79.3%,76.4-81.48%,72.5-77.5%,74.8-77.6%，与中国株HEV Ⅳ型的同源性为95－98％。基因进化树分析表明，此10株HEV与其它3型比较，变异较大，HEV Ⅳ型为同一基因型。结论：急性散发性戊型肝炎病毒在北京地区感染存在不同的病毒基因型别，主要为HEV Ⅰ型感染（67.47%），HEV Ⅳ型感染也存在一定比例（32.25%）。     

兔戊型肝炎病毒ORF2编码蛋白的抗原表位分析

目的:研究新发现的兔戊型肝炎病毒(HEV)与所有已知基因型HEV抗原表位的异同,为阐明动物HEV的人畜共患特征及戊型肝炎的诊断提供依据。方法:制备兔HEV ORF2重组蛋白R166(aa452-617),并免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体(McAb);采用间接ELISA法及免疫印迹法,检测McAbs与已知基因型HEV ORF2重组蛋白p166Bur(1型)、p166Mex(2型)、p166US(3型)和p166Chn(4型)的交叉反应性。用获得的杂交瘤细胞制备腹水,利用基于PCR的HEV体外中和试验,检测它们对基因1、4型人HEV和兔HEV的中和活性。结果:获得3株稳定分泌抗-R166的McAbs的杂交瘤细胞株,即1C1、6F9和10D2。其中1C1和6F9分泌的McAbs与已知1、2、3、4基因型p166均结合;10D2分泌的McAb只与R166特异结合,而不与1、2、3、4基因型p166结合。3株McAbs腹水均不能中和基因1、4型人HEV和兔HEV,提示3株McAbs针对非中和性抗原表位。结论:兔HEV与已知1、2、3、4基因型HEV既含有共同的抗原表位,也含有不同的抗原表位,具有不同的抗原特征。     

戊型肝炎病毒 ORF2截短蛋白 p154在毕赤酵母中的分泌性表达及其抗原性

目的：利用毕赤酵母系统表达戊型肝炎病毒（HEV）ORF2编码蛋白第452～605氨基酸多肽（p154）,探讨毕赤酵母表达系统用于研发戊型肝炎基因工程疫苗的可能性。方法：采集戊型肝炎患者粪便,进行RT-PCR检测和测序鉴定,并依此为模板扩增ORF2 p154基因,克隆到表达载体pPICZαA上,电转化入毕赤酵母宿主菌GS115,经筛选鉴定后将携带目的基因的重组克隆菌进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析。结果：利用基因重组技术构建了含HEV p154片段的pPICZαA重组质粒,并在毕赤酵母菌株GS115中实现了分泌性表达,表达的目的蛋白p154分子质量约为22 kDa,上清中p154表达量可达到200μg· ml -1。 p154可与HEV感染兔恢复期血清及HEV单克隆抗体6F9进行反应,表明酵母表达的p154具有良好的抗原性。结论：HEV ORF2 p154在毕赤酵母表达系统中得到了成功表达,为进一步研发真核表达的戊型肝炎基因工程疫苗奠定了实验基础。     

Partial nucleotide sequencing of hepatitis E viruses detected in sera of patient s with hepatitis E from 14 cities in China

目的：调查从中国病人血清中分离的戊型肝炎美丽（HEV）基因型。方法：应用聚合酶链反应法（PCR）和直接测序法对从中国14个城市检测到的45株HEV开放读码框架2（ORF2）的部分基因序列（nt6461-6860及nt5994-6294）进行分析。结果：45株HEV中,41株（91％）与缅甸株属同一个基因型,与中国代表株HEV核苷酸序列的同源性均在98％以上。仅4株与3个HEV原型株差异较大,与缅甸株/中国株同源性为77％-80％,与墨西哥株的同源性为74％-76％,与新发现的美国株/猪（US/Swine）HEV的同源性为74％-77％;基因进化树分析表明,该4株HEV可能为一新基因型的2个不同亚型,它们与原型墨西哥株、缅甸株和美国株/猪HEV明显不同。结论：中国戊型肝炎患中,多数国原型株HEV,仅少数感染新基因型HEV。     

西班牙本土急性戊型肝炎散发病例报道

背景/目的:工业化国家戊型肝炎病毒(HEV)感染比较少见,同时由于缺乏有效的检测手段,诊断也比较困难。方法:利用HEVIgG抗体研究11例急性戊型肝炎患者体内急性HEV感染标志物的存在。结果:3例被确认为急性戊型肝炎患者,8例为疑似患者,2例存在既往HEV感染,1例未能确诊。3例患者的血清中分离出3种不同的HEV株,其中2株属于基因型3,1株属于基因型1。基因型3为当地城市污水中存在的主要基因型,基因型1被认为由国外输入。结论:本研究证实:①在西班牙存在急性戊型肝炎的本土原发散发病例;②HEV病毒学和血清学标志物具有短时性的特点。西班牙本…     

戊型肝炎的病原学及流行病学研究

本文对我国戊型肝炎的流行病学、病原学、动物实验感染、临床、组织病理学及预防进行了研究。戊型肝炎主要侵犯青壮年;儿童和老人发病较少;男性多于女性;主要经污染的水和食物传播。从戊型肝炎病人和实验感染HEV猕猴粪便中检测到HEV并获得HEV cDNA克隆。中国和缅甸株HEV核甙酸和氨基酸的同源性分别为94.3％和99.6％。对562例戊型肝炎病人的临床特点和7例黄疸型成型肝炎病人的肝活检组织病理学改变进行了分析。随机双盲对照试验证明,血清免疫球蛋白对控制戊型肝炎无效。     

戊型肝炎病毒与血液安全研究进展

戊型肝炎是戊型肝炎病毒(HEV)引起的一种传染病。戊型肝炎主要是HEV经粪—口传播引起的病毒性肝炎,然而近年来陆续报道了一些通过输血传播的病例。欧洲国家中,普通人群和献血者中HFEV的血清学流行率表明低估了HEV经输血传播的危险性。文章针对HEV的发现、基因型及其分布、HEV感染在献血者中的流行情况、HEV的血源性传播、HEV对机体的影响和HEV感染的预防等几方面进行阐述。     

特殊人群中戊型肝炎的慢性化趋势及其致病机制

戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)感染是引起急性肝炎的重要原因之一.HEV感染所引起的戊型肝炎(戊肝)多发生在卫生条件较差的发展中国家.根据核苷酸同源性分析,HEV至少存在5个基因型,分别为1、2、3、4和5型,其中5型为禽HEV[1-2].目前研究显示,禽HEV与人HEV关系较远,对人影响不大...     

新疆地区公共场所从业人员戊型肝炎病毒感染血清学调查分析

目的：调查新疆地区公共场所从业人员戊型肝炎病毒（HEV）感染的状况及感染的影响因素,为当地戊型肝炎防控提供依据。方法：对新疆地区不同公共场所从业人群,采用随机抽样的方式采集血清样品1720份,应用双抗原夹心酶联免疫法检测血清样本中抗HEV-IgG抗体,分析不同性别、年龄和职业人群间戊型肝炎感染率的差异。结果：受试对象1720人中有440例抗HEV-IgG抗体阳性,阳性率为25.58%,其中男性阳性率为27.99%,女性阳性率为23.35%,且随着年龄的增长,抗体阳性率逐渐增高,不同年龄段人群抗HEV-IgG抗体阳性率比较差异有统计学意义（χ²=118.262,P=0.000）;不同类别从业人员戊型肝炎感染率比较差异有统计学意义（χ²=98.262,P=0.000）,抗HEV-IgG抗体阳性率由高到低依次为家畜屠宰工人81.53%,家畜及肉品销售人员79.37%,餐饮服务人员30.00%,超市服务人员11.21%,其他人群9.03%。结论：新疆地区公共场所从业人员戊型肝炎感染率相对较高,职业、年龄和性别是影响戊型肝炎感染率的主要因素。     

甲/戊型肝炎重组抗原的表达、纯化及与传统甲肝疫苗免疫原性的比较

目的比较基因工程重组抗原与传统疫苗的免疫原性;探讨同一载体表达不同抗原的能力和抗原间的相互作用。方法将编码甲型肝炎病毒Vp1aa24-171和戊型肝炎病毒ORF2aa431-615的重组表达质粒pBV220-EAAg342及pBV220-AEAg342转化入大肠杆菌BL-21,筛选出高效表达的菌种进行目的蛋白的表达。用DEAE-sepharose FF和CM-sepharoseFF离子层析交换柱纯化表达重组蛋白,采用SDS-PAGE、Western blotting方法进行分析鉴定。用纯化的重组蛋白及传统甲肝疫苗灭活疫苗与减毒活疫苗免疫小鼠,比较特异性抗体的产生水平。结果表达的重组蛋白相对分子质量约为36000,表达量约占菌体总量的25%;且重组嵌合抗原EAAg342可以形成直径10～20nm的类病毒(virus-like particles,VLP)颗粒。Western blotting证实2种重组蛋白均能分别与甲型肝炎和戊型肝炎患者阳性血清发生特异性反应。免疫小鼠后可诱导产生高滴度的抗戊肝特异性抗体;而抗甲肝特异性抗体水平与传统甲肝疫苗相比较低。结论使用原核系统表达的甲/戊肝重组抗原能够高效表达,2种不同的融合蛋白均分别具有良好的抗原性和免疫原性,具有开发双价疫苗及同时诊断甲型戊型肝炎试剂盒的前景。     

Evaluation of two anti-hepatitis E virus IgM kits

Objective To evaluate two commercial anti-hepatitis E virus （HEV） IgM kits used for differential diagnosis of acute enteric viral hepatitis. Methods The kit for IgM capture assay, was produced with a recombinant HEV structural protein protecting primates against experimental infection by different HEV genotypes, while the other kit for indirect ELISA was produced with recombinant structural proteins from different HEV geootypes. The serum specimens were taken from 241 cases with a confirmed or presumptive diagnosis of hepatitis A and 74 cases with a confirmed or presumptive diagnosis of hepatitis E. Results The sensitivity and specificity of the IgM capture assay kit were 97% and 100%, respectively, and the corresponding values for the other kit were 70% and 78%, respectively. Conclusion The IgM capture assay kit has higher sensitivity and specificity in diagnosing acute enteric viral hepatitis E.     

中国云南少数民族地区慢性乙型肝炎患者病毒基因在大肠杆菌中的表达及其抗原性

目的 研究不同民族慢性乙型肝炎（CHB）患者HBV前S2／S（preS2／S）和C（core,C）基因在大肠杆菌Escherichia coli（E.coli）中表达的稳定性和水平,并对其抗原性进行鉴定,为创制新型疫苗提供抗原材料。方法从中国云南少数民族地区50例慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV基因组DNA,将聚合酶链反应（PCR）扩增-克隆-测序的HBV preS2／S和C基因插入到表达载体pkPR上,构建重组pkPR-S2S和pkPR-C表达质粒,并在大肠杆菌TOP10中表达。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定表达产物非融合蛋白,并对其抗原性用Western印迹和ELISA方法进行检测。结果SDS-PAGE检测到全部慢性乙型肝炎患者pkPR-S2S和pkPR-C重组质粒在大肠杆菌TOP10中存在稳定性和高水平的表达,表达的非融合蛋白相对分子质量分别为31000和21000,非融合蛋白浓度约占16％,纯度达96％。Western印迹和ELISA分析,非融合蛋白能分别与HBVpreS2／S抗原单抗、C抗原单抗及慢性乙型肝炎患者血清发生反应,而与对照的甲型肝炎（HAV）患者血清、丙型肝炎（HCV）患者血清及正常血清之间无交叉反应。结论中国云南少数民族地区慢性乙型肝炎患者HBV preS2／S和C基因在大肠杆菌TOP10中有稳定性和高水平的表达,表达的非融合蛋白具有抗原性。这些发现为创制新型疫苗具有潜在应用价值。     

通用性引物RT-nPCR扩增不同基因型戊型肝炎病毒基因组的探讨

目的：筛选戊型肝炎病毒(HEV)通用性引物，用于不同基因型HEV基因组的逆转录一巢式聚合酶链扩增(RT-nPCR)。方法：在HEV序列保守区设计和合成A、B、C、D4组引物，用于扩增已知基因型的HEV参考株和HEVIgM阳性的临床标本．探讨扩增区域最小自由能与RT-nPCR扩增效率的关系。结果：4组引物均可扩增出不同基因型HEV基因片段．但得到的PCR滴度有差异，D组引物所得滴度最高，B组最低；54份临床标本的PCR阳性率也以D组最高、B组最低。D组引物扩增区段的RNA模板最小自由能的绝对值最低，B组的最高，与PCR扩增效率相关。结论：在HEV基因组第6296～6603核苷酸之间设计的D组通用性引物可扩增不同基因型HEV以及临床标本，扩增效率高，有较高的应用价值。     

戊型肝炎病毒抗原基因片段及其组合表达质粒的构建

目的：选择及组合戊肝病毒（ＨＥＶ）抗原基因片段,进行表达与免疫学特性研究。方法：根据已公布的ＨＥＶ序列,选择三段优势抗原表位,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增基因片段,产物以单独或经甘氨酸连接肽串联组合的方式克隆到载体ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ｃ中,经ＤＮＡ序列分析后,将构建的重组质粒转入大肠杆菌中进行表达,并以Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析初步考察其免疫学特性。结果：构建的六个重组质粒在大肠杆菌中获得了不同程度的表达,表达的目的蛋白具有与戊型肝炎患者阳性血清特异性结合的能力。结论：ＨＥＶ抗原片段及其组合在大肠杆菌中得到了高效表达,并为优良诊断试剂及基因工程疫苗的研究提供了基础。     

抗HEV ORF2单链可变区抗体的筛选和鉴定

目的：筛选和鉴定抗戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）开放读码框架２（ＯＲＦ２）的人源化噬菌体单链可变区抗体。方法：以大肠杆菌表达的重组ＨＥＶ ＯＲＦ２多肽做为固相包被抗原,从半合成的人源化噬菌体抗体库中经过４轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、ＤＮＡ序列分析鉴定,获得抗原结合活性较强的抗－ＨＥＶ ＯＲＦ２单链可变区抗体,并以间接酶标法用该抗体对戊型肝炎患者石蜡包埋肝组织中的ＨＥＶ ＯＲＦ２抗原进行免疫组织化学鉴定。结果：筛选到的抗－ＨＥＶ ＯＲＦ２的单链可变区抗体基因。酶切和序列分析表明,该抗体基因由７９５ｂｐ组成：ＥＬＩＳＡ和免疫组织化学结果显示,抗－ＨＥＶ ＯＲＦ２人源化噬菌体单链可变区抗体能与重组ＨＥＶ ＯＲＦ２抗原特异性结合,并能够特异性识别戊型肝炎患者肝组织中的ＨＥＶ抗原。结论：此法     

一株新型散发型戊型肝炎病毒部分核苷酸序列测定与分析

目的 :了解长春地区戊型肝炎病毒 ( HEV)株的变异程度。方法 :用逆转录 -套式 -聚合酶链反应方法从患者血清中获取病毒 ,用双脱氧终止法进行核苷酸序列分析。结果 :China Changchun-2 2 0 MC与日本株、猪的 HEV分离株 ( AF0 82 843)、美国株 - 1 ( AF0 60 669)、墨西哥株 ( M745 0 6)、第四基因型 ( AJ2 72 1 0 8)、缅甸株 ( M732 1 8)、中国株 ( M941 77、D1 1 0 93、D1 1 0 92 )、尼泊尔株 ( AF0 5 1 830 )、巴基斯坦株 ( M80 5 81、AF1 85 82 2 )核苷酸同源性为 72 %～ 88% ,氨基酸同源性为 93%～ 97%。结论 :China Changchun- 2 2 0 MC株与其它 HEV株相比有较高的基因异质性 ,可能是一新型的 HEV株     

戊型肝炎病毒合成肽决定簇检测抗HEV的研究

利用３段分别代表ＨＥＶ３个基因区的合成多肽，研制成ＥＬＩＳＡ抗ＨＥＶ检测试剂。此试剂对ＩｇＧ及ＩｇＧ检测出阳性率在急性ＮＡＮＢＮＸ肝炎患者中分别为５４．１％（５３／９８）和３３．７％（３３／９８），在其他疾病患者正常献血员中则分别为２．７％－６．３％和０％－２．６％。与Ｇｅｎｅｌａｂｓ重组抗原生产的检测试剂比较，两者有很好的一致性，其阳性符合率为９０．０％，阴性符合率为９８．５％，总符合率为９７．     

戊型肝炎IgG抗体检测方法的建立

为建立一种简便、快速诊断戊型肝炎病毒血清抗体的检测方法,以基因工程HEVORF2区重组蛋白抗原和人工会成HEVORF3区合成多肽抗原混合作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记的单克隆抗人IgG抗体为第二抗体,建立了间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中HEVIgG抗体技术。检测中国药品生物制品检定所《检测抗HEV抗体国家参考品》全套血清盘：特异性参比品30份,全部为阴性;阳性参比品10份,全部为阳性;精密性参比品,CV（n＝10）＜15％。17例非甲、乙、丙肝炎患者,黄殖出现后4个月内,HEVIgG抗体检出率为100％。普通人群HEVIgG抗体检出率为1％～2％。表明该方法检测HEVIgG抗体,特异性强、敏感性高、操作简便快速,适用于临床对戊型肝炎的诊断和流行病学调查。     

戊型肝炎病毒ORF3基因在杆状病毒系统中的表达与免疫学性质

目的 利用杆状病毒系统表达戊型肝炎病毒（HEV）ORF3,为进一步研究免疫学性质与功能提供基础。方法 通过RT－PCR方法获得HEV ORF3基因的目的基础片段,插入中间转染载体质粒pVL1393,构建重组质粒,再与杆状病毒线性DNA（BaculoGold^TM）共转染Sf9昆虫细胞,通过同源重组得到重组杆状病毒,以此重组杆状病毒感染昆虫细胞后,对表达的重组蛋白进行免疫学检测并免疫小鼠。结果 表达的重组蛋白约占昆虫细胞总蛋白的2％,可被戊型肝炎患者与实验猴阳性抗血清有效识别,并能诱导小鼠产生对HEV特异性免疫应答。结论 重组杆状病毒可高效表达HEV ORF3基因片段,表达产物具有HEV特异的免疫原性。