血管内皮生长因子干扰RNA对人鼻咽癌CNE一2Z细胞VEGF表达调控的实验研究

目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）的特异性小片段干扰RNA（siRNA）对低分化人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达的抑制作用，为鼻咽癌的治疗提供新的途径。方法：体外培养人鼻咽癌细胞CNE-2Z，并分成正常氧状态培养组（20％）和低氧（1％）培养组。采用脂质体（LF2000）将VEGF siRNA转染两组细胞，并采用RT—PCR、ELISA检测鼻咽癌细胞在正常氧状态和低氧状态下VEGF mRNA和蛋白质表达的差异。结果：与未转染组和转染空载体组相比，在正常氧和低氧状态下，VEGFsiRNA均能明显抑制VEGFmRNA的表达（P〈0．01）；正常氧状态下VEGFsiRNA的抑制效率比低氧状态高。正常氧状态下：未转染组、转染空载体组、转染VEGFsiRNA组CNE-2Z细胞培养上清液中VEGF165的含量分别为：423．92、419．68和328．86pg／mL；低氧状态下VEGF165的含量分别为：813．62、799．89和500．96pg／mL，转染VEGF siRNA组VEGF的表达下调。结论：VEGF siRNA能有效地、特异地抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF mRNA和蛋白质的表达，因而有望成为治疗鼻咽癌的一种有效方法。     

PKC信号传导通路对缺氧人视网膜色素上皮细胞表达VEGF的作用

目的 :探讨蛋白激酶C(PKC)信号传导通路对缺氧状态下培养的视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞表达VEGF的作用 .方法 :在缺氧状态下分别培养人RPE细胞 6 ,1 2和 2 4h ;将不同浓度的PKC激动剂佛波醇 1 2 豆蔻酰 1 3乙酸 (phorbol 1 2 myristate 1 3 acetate,PMA)及PKC抑制剂Chelerythrine分别加入人RPE细胞培养液 ,在缺氧状态下培养 2 4h .用免疫组化方法检测各组RPE细胞中VEGF的表达 ,经计算机图像处理 ,定量分析 .结果 :在缺氧状态下 ,RPE细胞对VEGF的表达较非缺氧组RPE细胞显著增加 (P <0 .0 1 ) ;较对照组 ,PMA可增强缺氧状态下RPE细胞VEGF的表达 (P <0 .0 1 ) ,Chelerythrine则减弱VEGF的表达 (P <0 .0 1 ) .结论 :缺氧诱导VEGF在RPE细胞中的表达 ,其信号传导途径部分是通过PKC通路实现的     

鼻窦低氧环境对鼻息肉内成纤维细胞分泌VEGF的作用研究

目的 通过缺氧刺激鼻息肉内成纤维细胞来观察VEGF的表达。方法 选取慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者16例。测量慢性鼻窦炎患者鼻窦内氧分压,并以患者鼻息肉为材料,提取成纤维细胞,并在低氧环境刺激下培养。酶联免疫吸附法（ELISA）检测血管内皮生长因子（VEGF）的表达。结果 慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者鼻窦平均氧分压47.74（36.72,56.84）mmHg。6例存在上颌窦内积液患者的鼻腔分泌物中VEGF蛋白的含量明显高于鼻腔分泌物和血浆（P<0.05,P<0.005）。息肉内提取的纤维原细胞在低氧环境下培养10、20 h产生的VEGF比普通氧分压环境下明显增多,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 慢性鼻窦炎患者鼻窦内存在低氧的病理环境,低氧促进了鼻息肉成纤维细胞中VEGF的产生。     

鼻息肉上皮细胞中Fas、FasL和Bcl-2的表达及其意义

其其发病学意义。方法:用免疫组化染色法检测鼻息肉组(29例)和下鼻甲组(11例)上皮细胞Fas、FasL、Bcl-2基因蛋白的表达。结果:鼻息肉组上皮细胞Fas、FasL和Bcl-2阳性细胞指数(PIFas、PIFasL、PIBcl-2)均大于下鼻甲组(P<0.01),PIBcl-2/PIFas也大于下鼻甲组(P<0.01),但鼻息肉组PIFasL/PIFas与下鼻甲组比无统计学意义;鼻息肉组PIFasL/PIFas和PIBcl-2/PIFas均大于1(理论值,P<0.05)。结论:Bcl-2介导的抑制细胞凋亡机制和FasL介导的细胞免疫逃逸机制可能对Fas/FasL系统介导的细胞凋亡产生部分抑制作用,有可能是鼻息肉上皮细胞增殖和细胞凋亡平衡失调的根本原因。     

微型切削器获取鼻息肉组织在呼吸上皮细胞培养中的意义

目的 介绍一种用微型切削器收集鼻息肉组织并进行鼻息肉上皮细胞培养的方法.方法 A组自制鼻息肉组织收集瓶,通过微型切削器于手术时收集切除的鼻息肉组织,采用气-液界面(ALI)的原代细胞培养技术,对鼻息肉上皮细胞进行培养.并与B组手术时常规钳取鼻息肉组织进行上皮细胞培养的方法的对照.结果 A组细胞培养后第5天观察见沉入底部滤膜上的上皮细胞贴壁并形成单层,形态良好,边缘清晰,折光性能强,呈鹅卵石状,纤毛细胞纤毛摆动活跃,随着培养时间的延长,至第14天时,细胞生长良好,纤毛细胞数有所增加.两组间各观察阶段细胞形态基本一致,各时点上皮细胞电阻及电位值也无明显差异(均P＞0．05).结论 在鼻息肉上皮细胞培养实验中,利用微型切削器收集鼻息肉组织,可以扩大鼻息肉标本的来源,是一种可行而且有效的方法,值得应用.     

血管内皮生长因子干扰RNA对人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达调控的实验研究

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)的特异性小片段干扰RNA(siRNA)对低分化人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达的抑制作用,为鼻咽癌的治疗提供新的途径。方法体外培养人鼻咽癌细胞CNE-2Z,并分成正常氧状态培养组(20%)和低氧(1%)培养组。采用脂质体(LF2000)将VEGFsiRNA转染两组细胞,并采用RT-PCR、ELISA检测鼻咽癌细胞在正常氧状态和低氧状态下VEGFmRNA和蛋白质表达的差异。结果与未转染组和转染空载体组相比,在正常氧和低氧状态下,VEGFsiRNA均能明显抑制VEGFmRNA的表达(P<0.01);正常氧状态下VEGFsiRNA的抑制效率比低氧状态高。正常氧状态下:未转染组、转染空载体组、转染VEGFsiRNA组CNE-2Z细胞培养上清液中VEGF165的含量分别为:423.92、419.68和328.86pg/mL;低氧状态下VEGF165的含量分别为:813.62、799.89和500.96pg/mL,转染VEGFsiRNA组VEGF的表达下调。结论VEGFsiRNA能有效地、特异地抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGFmRNA和蛋白质的表达,因而有望成为治疗鼻咽癌的一种有效方法。     

血管内皮生长因子在鼻内翻性乳头状瘤和鼻息肉中的表达及其意义

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)在鼻内翻性乳头状瘤(NIP)及鼻息肉(NP)中的表达及其意义。方法采用免疫组化SP免疫组化法检测34例NIP、25例NP组织及12例鼻中隔偏曲矫正后需切除的下鼻甲组织中VEGF的表达。结果VEGF染色阳性率在鼻内翻性乳头状瘤、鼻息肉、下鼻甲粘膜中分别为79.4%、56.0%和16.67%,VEGF在NIP和NP的上皮细胞和血管内皮细胞的表达,均显著高于下鼻甲组织,VEGF在NIP的表达显著高于NP,两两相比有显著性差异(P<0.05)。结论VEGF对NIP、NP血管生成有促进作用,可能参与了NIP、NP的发生、发展过程。VEGF在NIP中的过度表达可能是NIP区别于鼻息肉的重要组织学特征之一。     

myocardin在低氧诱导肺血管内皮向平滑肌样细胞转分化中的作用

目的探讨低氧条件下肺动脉内皮细胞(PAEC)向平滑肌样细胞的转分化及myocardin在其转分化过程中的作用。方法经免疫磁珠法(用血小板内皮细胞黏附分子1做免疫分选标记)纯化分离的原代肺动脉内皮细胞,用:RNA干扰(RNAi)技术构建psimyocardin RNA表达载体抑制myocardin基因的表达。细胞分为常氧组(含21％O2,5％CO2和74％N2)、低氧组(含1％O2,5％CO2, 94％N2)、常氧+myocardin抑制组和低氧+myocardin抑制组,分别培养1 d、4 d和7 d。用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测myocardin mRNA的表达;免疫荧光检测平滑肌特异性标志物α-平滑肌(α-SM)肌动蛋白的表达,结合形态学鉴定平滑肌样细胞的转分化。结果(1)免疫荧光检测PAEC中α-SM-肌动蛋白阳性率在低氧4 d组(0．96‰±0．08‰)明显低于7 d组(2．07‰±0．06‰,P< 0．01),阳性细胞呈梭形或多角形,而常氧组和低氧1 d组均未见α-SM-肌动蛋白的阳性表达;(2)RT- PCR显示myocardin mRNA的表达在低氧4 d组(0．14±0．01)明显低于低氧7 d组(0．23±0．03, P<0．01),常氧组和低氧1 d组均未检测出其表达。(3)RNAi沉默myocardin基因表达后,其mRNA水平明显低于对应的低氧4 d组(0．03±0．02)和低氧7 d组(0．05±0．01,P<0．01);平滑肌样细胞的转分化率也明显降低(0．19‰±0．07‰,0．21‰±0．04‰,P<0．01)。以上每组重复3次。结论PAEC中存在少数细胞具有转分化为平滑肌样细胞的潜能,低氧可明显促进其转分化,myocardin在此转分化过程中起重要作用。     

Fas及Bcl-2在鼻息肉组织中的表达及意义

目的:探讨Fas和Bcl-2在鼻息肉组织中的表达及与鼻息肉发病的关系。方法:应用S-P免疫组化法检测36例鼻息肉组织及19例下鼻甲组织中Fas和Bcl-2的表达情况。结果:(1)Fas在鼻息肉上皮及腺上皮的表达弱于对照组(P<0.05);(2)Bcl-2在鼻息肉上皮及腺上皮的表达强于对照组(P<0.05);(3)鼻息肉上皮细胞中Fas、Bcl-2蛋白的表达无相关性(P>0.05)。结论:(1)Fas和Bcl-2在鼻息肉发生发展中起重要作用;(2)在NP上皮细胞中,Fas和Bcl-2无相关性,因此这两种凋亡基因在NP的形成过程中各起独立作用,协调抑制NP上皮细胞的凋亡。     

丙酸氟替卡松对体外培养鼻黏膜上皮细胞和体内鼻息肉组织中水通道蛋白5表达的影响

目的:通过丙酸氟替卡松(FP)对体外原代培养的鼻黏膜上皮细胞和体内鼻息肉组织中水通道蛋白5(AQP5)表达的影响,初步探讨AQP5在鼻息肉发病中的可能机制.方法:将人鼻黏膜上皮细胞进行体外原代细胞培养14天,传代后FP组细胞加入丙酸氟替卡松浓度为0.2%的完全培养液,非FP组细胞加入不含丙酸氟替卡松的培养液继续培养,7天后爬片固定,采用免疫组化技术检测细胞中AQP5的表达.并测定阳性细胞的光密度值和灰度值.将12例慢性鼻窦炎鼻息肉患者(均为初发型),3个月内无局部及全身激素使用史,取其鼻息肉组织,术前应用FP喷雾剂喷鼻7天,治疗7天后术中再次取其鼻息肉组织,术后病理均证实为鼻息肉组织,采用免疫组化技术检测鼻息肉组织中AQP5的表达和分布.并测定阳性细胞的光密度值和灰度值.结果:在体外培养的上皮细胞FP组的AQP5表达的灰度值明显降低(P<0.05),光度值则升高(P<0.05),在体内鼻息肉组织中,患者使用FP后鼻息肉体积明显缩小,,用药后AQP5在腺体细胞和淋巴细胞中表达的灰度值明显升高(P<0.05),光密度值则明显低于使用前(P<0.05).结论:在FP作用下培养的鼻黏膜上皮细胞中的AQP5表达增加,可能解释在体情况下有利于组织间液的排除,减轻中鼻甲和下鼻甲的水肿,而在鼻息肉组织中,应用FP后,鼻息肉体积缩小,水肿减轻,可能与AQP5在腺体和淋巴细胞中表达减少有关,说明AQP5在鼻息肉的形成和发展过程中起到一定的作用.     

血管内皮生长因子在鼻息肉组织中的表达和意义

目的探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在鼻息肉组织中的表达及其在鼻息肉发病中的意义。方法将鼻息肉患者分为A、B组,A组为Ⅱ型1、2期患者,B组为Ⅱ型3期及Ⅲ型患者。另有20例鼻中隔偏曲患者的正常下鼻甲组织作对照组。采用免疫组化SP法检测三组VEGF的表达。结果正常鼻黏膜中VEGF的染色呈弱阳性,而在A、B组鼻息肉组织中VEGF的阳性率明显高于对照组,B组中阳性率和阳性细胞数均高于A组;VEGF在鼻息肉组织中主要定位于基底膜周围的炎性细胞和上皮细胞以及腺体、血管周围和血管壁内皮细胞。结论VEGF通过在鼻息肉组织中过度表达促进息肉组织内的血管增殖和炎性细胞聚积,促进鼻息肉的发生发展。     

血管内皮细胞生长因子与高原肺水肿发病的关系

目的 探讨血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）表达变化在高原肺水肿发病、高原习服－适应中的意义。方法 培养大鼠肺动脉血管内皮细胞,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法和酶联免疫吸附（ＥＬＩＳＡ）方法分别观察低氧（体积分数为１％的Ｏ２）细胞及培养液中ＶＥＧＦ表达变化;将大鼠分为５组,分别模拟不同海拔高度、不同时间进行间断低氧习服,每天４ｈ,间断低氧习服后的大鼠再进行急性低氧（８０００ｍ,４ｈ）。用免疫组织化学及ＲＮＡ狭缝杂交方法测定急性低氧和低氧习服不同时间、不同海拔高度大鼠肺组织ＶＥＧＦ变化,并对肺组织切片进行初步病理分析;采用ＥＬＬＳＡ方法测定大鼠、高原移居者及高原肺水肿患者治疗前后血浆中ＶＥＧＦ水平。结果 低氧时大鼠肺动脉血管内皮细胞ＶＥＧＦ表达水平明显升高（Ｐ〉０．０１）;低氧大鼠（包括急性低氧组及间断低氧习服组）血头及肺组     

低氧对肾小管上皮细胞表达VEGF的影响

目的探讨低氧条件下对培养肾小管上皮细胞(HKCs)表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法在3%氧浓度下培养肾小管上皮细胞,用细胞生长曲线及四甲基偶氮唑盐(MTT)比色试验研究细胞活力;用原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡情况;分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法检测HKCs在正常和低氧条件下,VEGF mRNA及其蛋白质的表达.结果MTT比色试验较细胞生长曲线更敏感地检测出低氧对细胞代谢的影响,用TUNEL法可检测细胞凋亡率随低氧时间延长而增加,低氧条件下HKCs表达VEGF并无明显增高.结论低氧条件下,检测不到HKCs的VEGF表达增加,可能与低氧诱导HKCs凋亡和代谢率降低有关.     

鼻息肉中嗜酸性粒细胞与上皮细胞增殖的相关性研究

目的：探讨嗜酸性粒细胞在鼻息肉发病机理中的意义。方法：用增殖细胞核抗原（PCNA）免疫组化方法对鼻息肉组织76例和正常鼻腔粘膜组织32例进行定量测定,同时对鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞定量计数。结果：（1）鼻息肉上皮组织中PCNA阳性细胞表达数明显高于正常鼻腔粘膜（P＜0．001）,（2）嗜酸性粒细胞浸润程度与鼻息肉上皮细胞增殖相关（P＜0．05）。结论：上皮细胞增殖活跃在鼻息肉发病机理中占重要地位,而嗜酸性粒细胞的多少与其上皮细胞增殖相关,说明嗜酸性粒细胞与鼻息肉发病过程有直接相关性。     

上颌窦后鼻孔息肉与普通鼻息肉的组织学差异

目的对比上颌窦后鼻孔息肉(ACP)与普通鼻息肉(NP)的组织学构造,以了解其相关的病因和病理机制.方法对40例ACP及76例NP患者的息肉组织学进行比较,观察其中炎性细胞、嗜酸性粒细胞及粘膜下腺体的分布情况.结果ACP组炎性细胞浸润明显高于NP组,而嗜酸细胞的浸润在ACP组明显少于NP组,同时粘膜下腺体的出现在ACP组明显少于NP组.结论NP的发生与变态反应有关,而ACP则与感染密切相关.     

低氧应激对人肝癌细胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9表达的影响

目的 探讨低氧应激对人肝癌细胞(HepG-2细胞)甲胎蛋白(AFP)、血管内皮生长因子(VEGF)、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1、基质金属蛋白酶(MMP)-9表达的影响.方法 低氧(5% O2、5% CO2、90% N2)和常氧培养HepG-2细胞.逆转录-多聚酶链式反应技术测定HepG-2细胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA的表达.酶联免疫吸附法测定HepG-2细胞培养上清VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白含量,放射免疫测定法测定HepG-2细胞培养上清AFP蛋白含量.结果 低氧组AFP、VEGF、MMP-9mRNA和蛋白表达量显著高于常氧组;TIMP-1 mRNA和蛋白表达量显著低于常氧组(P＜0.01).结论 低氧应激上调人HepG-2细胞AFP、VEGF、MMP-9基因表达,下调TIMP -1基因表达.     

腺病毒载体介导的VEGF基因转染对C17．2神经干细胞凋亡的影响

OBJECTIVE: To study the effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) gene transfer on hypoxia-induced apoptosis of neural stem cells in vitro. METHODS: C17.2 neural stem cells cultured in vitro were infected by recombinant adenovirus containing VEGF gene and cultured under hypoxic condition. VEGF expression in these cells was detected by Western blotting, and the apoptotic index was calculated from results of triphosphate-biotin nick end-labeling (TUNEL) assay. Flow cytometry was employed to examine the changes in the cell apoptotic rate after VEGF gene transfer, and the apoptotic bodies were observed under fluorescence microscope with Hoechst33342 staining. RESULTS: The expression of VEGF was significantly increased in pAdCMV VEGF(165)-infected cells, resulting in inhibition of the apoptosis of C17.2 neural stem cells induced by hypoxia manifested by a significantly lower apoptotic rate of the stem cells transfected by pAdCMV VEGF(165) than that of the untransfected cells (10.38%;+/-0.48%; vs 19.98 %;+/-0.55%;, P<0.01) and of the cells transfected with pAdCMV VEGF(165) along with VEGF anti-sense oligodeoxynucleotide (19.07%;+/-0.64%;, <0.01) after hypoxia. CONCLUSIONS: Recombinant adenovirus can efficiently mediate VEGF gene transfer into C17.2 neural stem cells, resulting in high expression of the exogenous VEGF in vitro, which effectively reduces C17.2 neural stem cell apoptosis induced by hypoxia.     

鼻息肉中 IL-15 mRNA的表达及其作用

目的：观察IL-15mRNA在鼻息肉与下鼻甲中表达的差异及其与Bcl-2、Bcl-XL表达的关系,明确鼻息肉中IL-15的来源,探讨其在鼻息肉发病机制中的作用。方法用原位杂交的方法测定24例鼻息肉与8例下鼻甲的IL-15mRNA的表达情况,同时用免疫组化法检测其组织中Bcl-2及Bcl-XL的表达情况。结果鼻息肉组中IL-15mRNA在黏膜下固有层浸润的以EOS为主的炎症细胞有很强的表达,与下鼻甲组IL-15mRNA的表达差异有统计学意义（P＜0．05）。 IL-15mRNA在多数鼻息肉中的黏膜下腺体上皮细胞有表达,且强于在下鼻甲组的表达。黏膜下固有层炎症细胞IL-15mRNA的表达与Bcl-XL的表达有相关性（ r＝0．592）。结论 IL-15通过旁分泌或自分泌的方式作用于位于黏膜下固有层中以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞,并通过Bcl-XL途径诱导的凋亡抑制在鼻息肉的发病中可能起重要作用。 IL-15在鼻息肉中黏膜下腺体的表达强于在下鼻甲中的表达,可能参与了鼻息肉形成过程中黏膜下腺体分泌功能紊乱的病理过程。