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相似文献
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1.
猪肝细胞的Gerlach分离法   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的 :探讨猪肝细胞分离收获率、存活率。方法 :取本地杂种小猪作为肝细胞供体 ,采用Gerlach五步胶原酶灌流法分离猪肝细胞 ,血细胞计数板计数细胞产量 ,TrypanBlue拒染法计算细胞活率。结果 :每只猪肝平均可获得 (12 .2 2± 1.5 7)× 10 9个肝细胞 ,平均活力为 95 .4 %± 2 .4 1%。结论 :采用Gerlach五步胶原酶灌流法分离猪肝细胞 ,获得较高产量和活力的游离肝细胞  相似文献   

2.
【目的】探讨氧合dispase及胶原酶组酶消化法从屠宰成年猪肝脏高效分离肝细胞的方法及分离肝细胞的生物活性。【方法】部分肝叶逆行灌注、氧合组酶dispase及胶原酶消化、密度梯度离心法分离、纯化肝细胞 ,并对其生物活性进行检测。【结果】肝组织细胞的收获量达10× 10 6 个 / g ,细胞平均存活率可达 92 5 % ,且无泡状变性的发生 ,原代培养生物活性与原代培养鼠肝细胞一致 ,随时间的延长而减退。【结论】氧合组酶dispase及胶原酶消化、密浓度梯度离心法自屠宰成年猪分离肝细胞产量高、且保持着良好的生物活性 ,可作为生物人工肝的理想肝细胞源用于肝脏终末性疾患的治疗。  相似文献   

3.
原代培养大鼠肝细胞分离方法的比较研究   总被引:6,自引:0,他引:6  
目的 探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法。方法 以Wistar大鼠做为肝细胞供体,分别采用直接分离法与胶原酶消化法分离获取肝细胞并原代培养;以台盼蓝染色法测细胞存活率,在位相关倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT法测培养细胞活性,并检测不同时期培养上清液中白蛋白的含量。结果 直接分离法获取的肝细胞活性及功能欠佳,而胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整,贴壁良好、活性高、功能强。结论 经胶原酶消化分  相似文献   

4.
目的 观察采用经心脏逆行置管灌注肝脏的方法分离小鼠原代肝细胞的效果。方法 对传统的分离原代肝细胞方法(Seglen两步胶原酶灌注法)进行改良,即从小鼠右心房的裂口处经肝上下腔静脉向下方置管,并以输液器滴注含体积分数10%胎牛血清的胶原酶灌注液进行肝脏灌注。评价此法与传统方法的置管成功率及所得肝原代细胞的数量及活力。结果 改良组总的置管操作成功率高达95%,且在一次置管成功率上改良组高于传统组(94.7% vs. 68.8%,P<0.05)。改良组小鼠肝脏灌注均匀,肝细胞产量高达1.07×106/g小鼠体质量,细胞活力平均为92.16%,两者均高于传统组(分别为0.99×106/g小鼠体质量及86.44%,P<0.05或P<0.01)。结论 经心脏逆行置管灌注法分离小鼠原代肝细胞简便易学,重复性高,且能保证分离所得的肝细胞产量和质量。  相似文献   

5.
目的:探讨猪肝细胞膜蛋白结构与异种移植细胞免疫反应原性的关系.方法:肝衰大鼠分为冻存细胞移植组(17只)、新鲜细胞移植组(9只)和对照组(9只,不移植肝细胞),腹腔内分别移植新鲜和冻存的猪肝细胞,记录鼠的存活率.圆二色光谱测定新鲜和冻存猪肝细胞的膜蛋白构象,抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)试验检测肝细胞破损情况.结果:对照鼠存活3只(3/9),新鲜细胞移植鼠存活6只(6/9);移植冻存肝细胞后,存活16只(16/17),显著高于对照鼠,P=0.002 2.新鲜肝细胞膜蛋白构象中α螺旋比率为47.5%,经液氮处理后,α螺旋增至56.5%;ADCC显示存活的新鲜细胞数为0.24×105,冻存细胞0.68×105.结论:异种移植细胞免疫反应原性的降低与肝细胞膜蛋白中α螺旋比率增高有关.  相似文献   

6.
目的 :研究水疱性口炎病毒 (VSV)对肝癌细胞感染和溶解的选择性。 方法 :将 VSV分别感染 5种经过或未经过干扰素预处理的肝癌细胞系 (Hep3B、Hep G2、SMMC- 772 1、BBEL- 74 0 2和 BEL- 74 0 4细胞 )、正常传代肝细胞 (L- 0 2细胞 )和正常原代培养肝细胞 ,应用标准噬斑测定技术滴定病毒在各类细胞中的产量 ,锥虫蓝染色排除试验检测细胞活力 ,亚甲蓝和伊红染色观察细胞溶解动力学。 结果 :0 .1pfu/细胞的 VSV与上述 5种肝癌细胞、正常传代和正常原代人肝细胞共同培养 18h后 ,各细胞 VSV的产量分别为 1.8× 10 9、1.5× 10 8、8.0× 10 7、5 .6× 10 8、7.7× 10 8、6 .5× 10 7、2 .3× 10 5pfu/ m l;而经 10 0 0 U/ m l干扰素预先处理后 ,上述细胞 VSV的产量分别降至 2 .4× 10 4 、3.8× 10 4 、6 .9× 10 5、4 .2× 10 3、8.3× 10 5、5 .3× 10 4 、<10pfu/ ml。无论是否经干扰素 α- 2 b(10 0 0 U/ m l)预处理 ,除正常原代培养肝细胞外 ,VSV感染后 2 4 h其他细胞被大量溶解。结论 :VSV可迅速感染并溶解肝癌细胞及正常传代肝细胞 ,干扰素虽能完全保护正常原代肝细胞 ,但仅能部分降低 VSV在肝癌细胞和正常传代肝细胞中的增殖和溶细胞速率。说明有干扰素存在时 ,VSV能够选择性地感染和溶解肝癌细胞 ,提  相似文献   

7.
用于生物人工肝的乳猪肝细胞球形聚集培养   总被引:1,自引:0,他引:1  
采用胶原酶门静脉灌注法分离乳猪肝细胞 ,旋转振荡法进行乳猪肝细胞的球形聚集培养 ,旨在探索一种新颖的肝细胞培养方法用于生物人工肝。台盼蓝拒染法判定细胞活力 ,同时分别采用光镜、透射电镜和扫描电镜进行培养肝细胞的形态学检测。结果显示 :肝细胞的产量平均为 ( 4 2~ 5 0 )× 1 0 6个 /g肝组织 ,即时存活率达 ( 90± 5 ) % ;旋转振荡法进行乳猪肝细胞的球形聚集培养 ,2 4 h后绝大多数细胞形成了球形聚集体 ,细胞超微结构正常且保持了较高活性。旋转振荡法是一种简便、经济的球形聚集培养肝细胞的方法  相似文献   

8.
乳猪肝细胞-196 ℃保存的初步研究   总被引:3,自引:0,他引:3  
目的探索适合于乳猪肝细胞-196 ℃冷冻保存的条件和方法.方法体外分离新生乳猪肝细胞,以含不同浓度二甲亚砜(DMSO)的冻存液及不同的细胞浓度在液氮中保存.2个月后复苏接种培养,对其存活率、贴壁率、尿素合成能力、猪白蛋白mRNA的表达等进行检测,并观察其形态结构变化.结果不同DMSO浓度保存猪肝细胞复苏后的活力及形态均有所不同, 其中含5% DMSO冻存液组保存效果最差;10%组次之;15%组最佳.15% DMSO冻存液组复苏后肝细胞的存活率为(83±4)%,贴壁率是(81±5)%,细胞形态与未冻存组相似,均保持较强的尿素合成能力及猪白蛋白mRNA的表达,较5%与10% DMSO冻存液组有显著性差别(P<0.05).冻存时肝细胞浓度为(5~10)×106个/ml组复苏后细胞存活率明显优于(1~2.5)×106个/ml组.结论 15% DMSO浓度适合于乳猪肝细胞的长期保存.高浓度组猪肝细胞的冻存效果优于低浓度组.  相似文献   

9.
人端粒酶逆转录酶诱导的猪肝细胞初步鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的观察应用四步灌流法分离后原代猪肝细胞的数量和活力,初步鉴定人端粒酶逆转录酶(hTERT)诱导的猪肝细胞的生物学特性。方法四步灌流法分离12只猪肝脏组织中的猪肝细胞,采用锥虫蓝拒染法测定其肝实质细胞数量和活力;将含hTERT真核表达的载体转染到原代猪肝细胞,经G418硫酸盐筛选,获得耐药性的猪肝细胞克隆并传代3代。观察原代猪肝细胞和hTERT诱导后的猪肝细胞的形态,检测两种猪肝细胞不同时期培养上清液中白蛋白、尿素氮的浓度。结果每只肝脏的肝细胞产量约为2.0×1010个,具有活力的肝细胞所占百分比为(95.5±3.2)%。原代猪肝细胞和hTERT诱导的猪肝细胞培养上清中分泌白蛋白和尿素氮在前3天无统计学差异(P>0.05),第4、5天差异有统计学意义(P<0.05)。结论四步灌流法分离获取的猪肝细胞产量高、功能活性好。hTERT诱导的猪肝细胞具有正常肝细胞的基本功能,可作为生物人工肝及细胞移植等的理想的细胞源。  相似文献   

10.
探讨冻存猪肝细胞异种移植治疗大鼠急性肝衰的可能性。将中国实验用小型猪的肝细胞在液氮中冻存150d后移植给切除80%肝叶的Wistar鼠,移植前检测冻存肝细胞的活率为冻前的78%,光镜及电镜检查显示细胞结构完整,组化检测糖原和葡萄糖-6-磷酸酶丰富,冻存猪肝细胞培养,生长良好。移植冻存猪肝细胞组Wistar鼠的存活率为16/17,对照组的存活率为3/9,P=0.0022。结果表明,将液氮冷冻保存的猪肝细胞移植给大鼠后可提高急性肝衰的存活率。  相似文献   

11.
猪肝细胞的分离与原代培养   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:建立稳定的猪肝细胞的分离与原代培养体系,满足生物人工肝体外支持系统对肝细胞的需求。 方法:应用改良Seglen法进行肝脏原位胶原酶灌流分离猪肝细胞,进行平面培养,动态观察细胞生长过程中的形态结构变化。 结果:平均每只猪可获得2×1010个肝细胞,细胞活率达到92.5%。在平面培养过程中维持了正常肝细胞的形态。 结论:原位胶原酶灌流法是获得大量高活率的猪肝细胞的首选方法,猪肝细胞原代分离培养是目前解决组合型生物人工肝脏(HBLSS)应用中细胞来源问题的主要途径。  相似文献   

12.
目的:建立免疫磁珠法,分离纯化小鼠肝脏Kupffer细胞并进行功能鉴定。方法:采用原位肝脏酶灌注、制备肝非实质细胞悬液、加入PE标记的大鼠抗小鼠F4/80一抗,然后结合山羊抗大鼠IgG Dynabeads免疫磁珠分选Kupffer细胞,流式细胞仪检测其纯度并检测其吞噬功能。结果:在经过胶原酶Ⅳ型消化、免疫磁分选,获得小鼠肝Kupffer细胞产量约为(8.05±0.34)×106/鼠肝,细胞纯度为(96.6±0.7)%,细胞活力大于90%。结论:应用免疫磁珠法能有效地分离纯化小鼠肝脏Kupffer细胞,为体外进一步研究提供了高纯度和活力的Kupffer细胞群。  相似文献   

13.
目的观察三明治构型大鼠原代肝细胞长期培养的形态学变化,并对其功能进行测定。方法采用改良原位2步法门静脉胶原酶灌注分离单肝细胞,台盼蓝拒染实验观察细胞活力,利用三明治培养构型培养成年大鼠原代肝细胞,倒置显微镜下连续观察肝细胞的形态学变化,定期收集培养细胞上清液,检测培养肝细胞的分泌及合成功能,并与单层胶原培养肝细胞比较。结果平均每个鼠肝可获取2×108~3×108个肝细胞,活率在(93±3)%;体外肝细胞培养第3天,清蛋白分泌功能、尿素合成能力恢复到最佳状态。三明治构型培养的肝细胞清蛋白分泌功能、尿素合成能力在培养的14d内始终维持较高的水平,并形成肝索样结构,伴胆小管网络形成,肝细胞形态维持达28d以上。结论三明治构型肝细胞培养体系更接近于肝细胞体内生长环境,肝细胞可在较长时间内保持良好的形态结构和功能,三明治构型不仅可以应用于肝细胞的基础研究,而且为肝细胞移植和生物人工肝治疗肝衰竭奠定了一定的基础。  相似文献   

14.
大鼠肝细胞的分离及原代长期培养   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的 :研究大鼠肝细胞分离的简易方法及长期培养过程中肝细胞形态变化过程。方法 :采用体外胶原酶二步灌注法分离大鼠肝细胞 ,TB染色法计算细胞数及细胞活率。 MTT法观测新生牛血清对大鼠肝细胞增殖的影响。在含 1 0 %新生牛血清及其他附助因子的 Williams′E条件培养基中原代长期培养 ,并进行形态学的动态观察。结果 :平均每只大鼠可获取 2 .2 6× 1 0 8个肝细胞 ,平均活力为 95.6%。新生牛血清浓度与大鼠肝细胞增殖有明显的量效关系 (P<0 .0 1 )。在 Williams′E培养基中可存活 5~ 6周并保持正常形态。结论 :本方法分离的肝细胞有较高的获取率和活力 ,适合体外长期原代培养  相似文献   

15.
目的:探讨胶原凝胶包埋聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖(PLA-O-CMC)纳米粒子粘附培养猪肝细胞移植对急性肝衰竭(ALF)大鼠肝的再生作用。方法:D-氨基半乳糖腹腔内注射制作大鼠ALF模型;48h后分别将5mlⅠ型胶原凝胶包埋的PLA-O-CMC纳米粒子粘附培养24h猪的肝细胞、5mlⅠ型胶原凝胶固定培养24h的猪肝细胞、5ml培养24h的猪肝细胞悬液(均含5.0×107个)移植到各组ALF大鼠腹腔内,并以5mlRPMI1640腹腔内注射作为阴性对照。观察大鼠14天存活率和受体肝脏的病理变化。结果:移植后14天ALF大鼠的存活率:单纯肝细胞移植组(Ⅰ组)为56.25%,胶原肝细胞移植组(Ⅱ组)为62.5%,纳米胶原肝细胞移植组(Ⅲ组)为75%,阴性对照组(Ⅳ组)为18.75%,各移植组14天存活率高于对照组(P<0.05),各移植组间无统计学意义(P>0.05)。ALF大鼠肝脏再生于ALF后5~7天最为显著;各组肝脏病理变化以Ⅲ组恢复最好,双核细胞最多,肝再生最快。结论:应用PLA-O-CMC纳米粒子和Ⅰ型胶原联合培养猪肝细胞移植于ALF大鼠腹腔内能促进肝脏的再生。  相似文献   

16.
Background Several kinds of intercellular adhesion molecules closely relate to hepatitis B. The complex of CD2 and CD58 plays an important role in enhancing the adhesion of T lymphocytes to target cells, hyperplasia and activation of T lymphocytes. In this study, we explored the relationship between the expression of CD58 in liver tissue and chronic hepatitus B infection. Methods We determined the expression of the CD58 molecule on the surface of hepatoc~es by using immunohistochemistry and the levels of serum HBV DNA from patients with HBV infection and from normal controls. The biochemical parameters of hepatic function were analyzed as well. Results CD58 expression in hepatocytes significantly increased with the severity progression of chronic HBV infection. The IOD levels (log10) of CD58 in the control, mild, moderate, and severe chronic HBV infection groups were 0, (7.20±4.64)×10^3, (25.63±7.41)×10^3 and (37.47±11.17)×10^3 respectively (P〈O.05 compared with the control group, respectively) Conclusion CD58 probably increases cell mediated immunity to eliminate hepatitis B virus and leads to damage of hepatocytes.  相似文献   

17.
 【目的】 探究一种高效稳定分离、扩增人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的方法。【方法】取材脐带20条,获得Wharton’s Jelly组织,分别用酶联合消化法(12例)和酶序贯消化法(8例)来分离、提取hUC-MSCs,比较两种方法分离hUC-MSCs的成功率、原代培养时间及获得的细胞数量;利用低糖DMEM(LG-DMEM)完全培养基和LD-Mesen培养基(MesenPro RSTM与LG-DMEM的混合培养基)分别培养hUC-MSCs,比较两种培养体系的扩增效率。对所获取细胞的免疫表型以流式细胞术进行鉴定,并诱导成脂、成骨分化验证其多向分化潜能。【结果】 酶联合消化法和酶序贯消化法成功率分别为100%(12/12)和12.5%(1/8),二者相比有显著统计学差异(P=1.03×10-4),前者原代培养平均时间为(14.17±1.14)d,获得细胞(1.30±0.14)×106个。2×105个hUC-MSCs用LD-Mesen和LG-DMEM两种体系培养12d后,扩增所得的细胞数分别为(14.86±0.08)×106和(5.08±0.08)×106,二者有显著统计学差异(P=1.38×10-8)。hUC-MSCs高表达CD73、CD105、CD90、CD29、CD44,不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR;并可向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化。【结论】 酶联合消化Wharton’s Jelly组织并以LD-Mesen体系进行扩增可高效获取hUC-MSCs,效率明显优于传统方法。  相似文献   

18.
目的:建立体外培养小鼠肝细胞的实验体系。方法:采用两步原位胶原酶灌注法分离小鼠肝细胞,在RPM I1640培养液中培养。结果:用胶原酶灌注法分离的小鼠肝细胞活率可达90%以上,产量平均为2.8×107,完全满足实验要求。肝细胞在RPM I1640培养液中2 h即可贴壁,48 h内细胞贴壁充分,伸展良好,1周后死细胞增多。结论:胶原酶灌注法成功制备出小鼠肝细胞。  相似文献   

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