银染mRNA差异显示方法的建立

目的：建立银染mRNA差异显示方法，为差异表达基因片断的分离克隆奠定基础，方法：采用随机引物和锚定引物各1条，建立差异显示反转录聚合酶链式反应（DDRT－PCR）和银染方法，对DDRT－PCR过程中各实验影响因素进行优化，割取差异条带进行二次扩增。结果：当总RNA用量为0．2ug，引物浓度为0．6－1．0umol/L,dNTP浓度为200unmol/L,MgCl2浓度为1．6－2.0mmol/L，时，同时起始5个循环的退火温度为50℃，扩增效率最佳，特异性好，背景 干净，结论：DDRT－PCR方法简便，灵敏，高效，可用于分离差异表达基因。     

兼并PCR技术反应条件的探索

[目的]探索兼并PCR技术反应的条件。[方法]依据过氧化物酶N-末端氨基酸序列设计的兼并引物,提取幼龄梨果实的DNA和RNA并将RNA反转录为cDNA,分别以DNA、cDNA和PCR产物为模板,利用PCR和琼脂糖电泳分析的方法,在不同的退火温度和引物添加量的配比下,对PCR条件进行优化。[结果]优化了PCR反应的条件,并且得到目的基因。[结论]优化后的兼并PCR技术可以更好地应用于新基因的克隆、病毒的检测等研究领域。     

改良的降落PCR扩增中国地鼠目的基因

目的优化PCR程序，尝试用降落PCR扩增中国地鼠目的基因。方法设计了4对引物，用普通PCR和改良的降落PCR扩增中国地鼠COX1、COX2、NADH5、NADH6部分基因。结果普通PCR只有1对引物扩增出特异性条带，而降落PCR4对引物都扩增出特异性条带，并与中国地鼠目的基因大小一致。结论降落PCR省略了常规PCR中摸索最适退火温度的过程，对中国地鼠一些Tm值相近的基因可以使用降落PCR温度程序扩增，是一种行之有效的PCR方法。     

不同RNA提取及反转录方法对环状RNA聚合酶链反应的影响

［摘要］ 目的 比较不同总RNA提取方法及不同反转录引物对喉鳞状细胞癌细胞株Hep2细胞环状RAN扩增的影响,进一步为环状RNA鉴定与扩增提供可靠的实验方法。 方法 使用Trizol抽提法和miRNeasy Mini试剂盒提取Hep2细胞中的总RNA;Nanodrop 2000对总RNA进行定量及纯度测定;使用随机引物和通用引物分别对总RNA进步反转录;实时定量聚合酶链反应检测Hep2细胞中环状RNA-circHIPK3及circFLNA的表达。 结果 Trizol抽提法提取的RNA浓度和RNA总量高于miRNeasy Mini试剂盒提取的RNA总浓度结果（P＜0.01）,但应用miRNeasy Mini试剂盒提取的RNA纯度要高于Trizol抽提法（P＜0.05）,应用随机引物反转录,能扩增出circHIPK3和circFLNA,而利用通用引物进行反转录,circHIPK3及circFLNA不能被扩增;另外,利用miRNeasy Mini试剂盒法提取总RNA后所扩增出circHIPK3及circFLNA的相对表达量明显高于Trizol抽提法（P＜0.01）。 结论 miRNeasy Mini试剂盒提取总RNA纯度更高,更有利于环状RNA的扩增,利用随机引物进行反转录而非通用引物,可顺利扩增出环状RNA。     

引物浓度与退火温度不当导致巢式PCR非特异性扩增

目的 探索巢式PCR非特异性扩增的产生原冈及消除方法.方法 以巢式PER扩增乙型肝炎病毒(HBV)S gene为模型,分别使用小同退火温度组合与不同引物浓度组合进行巢式PCR扩增,观察并分析实验结果.结果 降低引物浓度或提高退火温度均可消除巢式PCR的非特异性扩增,但提高退火温度有可能影响反应的扩增效率,导致产物量下降甚至得不到产物.结论 巢式PCR发牛非特异性扩增时,可以提高退火温度或降低引物浓度对反应体系进行优化.     

利用M-RAPD技术绘制不同病原微生物基因指纹图

目的探讨一种多重随机引物PCR方法(M-RAPD)对不同种株病原微生物进行鉴定的可能性。方法将10个碱基的随机引物进行随机组合，利用三条组合的随机引物在较高的退火温度下对不同种株病原微生物染色体。DNA进行扩增，通过15g／L琼脂糖凝胶电泳获得不同种株病原微生物的扩增图谱，并用软件Gelworks 1d Intermediate进行分析。结果初步实验表明，M-RAPD技术可以得到稳定的种株特异的DNA指纹图谱，其条带清晰、数目较多、片段大小分布均匀。三引物的扩增产物包含了其中任意两引物的绝大多数扩增产物，大、小片段均可出现增减，但小片段更易增加；对同一种病原微生物三引物所提供的基因信息要远多于两引物所提供的信息，增加的信息量约为原来的50％；不同耐药菌株问及其与相应标准株问差异亦很明显，但同种不同株问相同的扩增产物要多于不同的扩增产物。软件Gelworks 1d Intermediate的分析数据亦支持我们的实验结果。结论M-RAPD技术对不同种株病原微生物染色体DNA扩增时，能获取较丰富的遗传信息，可迅速、简便地鉴定不同种株的病原微生物。     

比格犬雌激素β受体RNA干扰实验细胞及PCR检测引物的筛选

目的筛选用于比格犬ERβ基因RNA干扰实验的细胞和检测所用引物。方法根据比格犬ERβ氨基末端区域和DNA结合区设计三对引物,用阳性质粒筛选最佳引物应用于RNA干扰效果检测,并利用293T、Hela和vero细胞的cDNA验证该引物的特异性。对这三种细胞内人ERβ基因的存在情况也进行了检测。结果经过三次重复性实验之后,结果显示引物C36684扩增效率高,且没有非特异条带,该引物对293T、Hela和vero细胞cDNA扩增时同样没有非特异性条带,但293T细胞中存在人的ERβ基因。结论引物C36684用于检测RNA干扰效率,而Hela细胞则作为RNA干扰实验的细胞工具。     

RNA加尾和引物延伸RT-PCR法实时定量检测microRNA

目的：用改进的RNA加尾和引物延伸RT—PCR法实时定量检测组织中的microRNAs（miRNAs）,并评价其敏感性和特异性。方法：提取组织中的小于200bp的RNA,用poly（A）聚合酶在其3’末端加尾,再用5’带40nt延伸序列的单碱基锚定Olig—dT引物进行反转录,得到约80nt的cDNA,然后用特异引物进行SYBRGreen实时定量PCR扩增。结果：该法线性范围宽,可检测低丰度的miRNAs,能特异区分3’末端碱基不同的亚型,但对序列中间个别碱基不同的亚型不能鉴别。对15种miRNA在大鼠心、肝和大脑皮层的相对表达的检测验证了该法的可靠性。另外,海马组织中的miRNAs表达与大脑皮层组织有一定差异。熔解曲线的单一峰型和电泳检测到的单一条带都证明了扩增的特异性。结论：该法可快速、敏感地检测不同组织中大多数miRNAs的表达差异,可用于寻找组织特异及疾病相关的miRNAs。     

CFL2基因半定量多重RT-PCR检测方法的建立

目的在CFL2基因功能的研究中,建立一种能检测CFL2基因mRNA表达水平的半定量多重RT-PCR体系。方法细胞总RNA经反转录合成cDNA,以GAPDH为内参与CFL2进行同管扩增,以常规PCR体系为参照对退火温度、Mg-（2＋）、dNTP和循环数等参数进行优化并与常规组比较,建立了检测C2C12细胞CFL2基因半定量多重RT—PCR体系。结果CFL2和GAPDH的cDNA同时PCR扩增后电泳条带清晰,与预期产物大小一致,两对引物间无明显竞争,其扩增效率和特异性与单一基因的RT—PCR体系相同。结论成功建立CFL2基因半定量多重RT—PCR方法,有利于半定量检测CFL2 mRNA表达变化。     

通过引物设计和提高退火温度提高实时定量PCR检测microRNA的特异性

目的：了解因某些microRNA (miRNA) 家族成员序列相似,以及同一种成熟miRNA的长度不均一对PCR定量检测结果的影响,寻找区分相似miRNA成员和准确定量的方法和条件。方法: 采用RNA加尾和引物延伸实时定量RT-PCR法,设计不同位置错配的引物,以克隆到质粒中的全长成熟miRNA为模板,比较在不同退火温度下各种错配引物与完全匹配引物在扩增miRNA上的效率差异,并根据由此得出的经验设计let-7家族成员引物,以克隆的成熟miRNA为模板,检测其在不同退火温度下区分相似家族成员的能力。此外,设计了10组3′末端碱基位置不同的特异引物,比较了它们在检测小鼠大脑miRNA表达水平上的差异。结果：提高退火温度12 ℃~14 ℃将最大限度增加特异性而不降低敏感性,将引物的3′ 末端置于差异碱基或其附近可以有效区分相似miRNA序列,将引物3′ 末端置于miRNA第18~20个碱基,可避免漏检较短的成熟miRNA,使定量更真实准确。结论：精心设计引物并提高退火温度可提高实时定量PCR检测microRNA的特异性和准确性。     

骨髓增生异常综合征患者HLA-DR15基因的表达

目的探讨骨髓增生异常综合征(MDS)患者HLA-DR15基因的表达状况。方法采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)检测MDS患者(n=59)HLA-DR15基因的表达,并与健康对照组(n=104)进行比较。结果MDS组HLA-DR15基因表达率为44.07%,明显高于健康对照组的12.5%(P<0.01)。其中难治性贫血(RA)患者HLA-DR1的表达率为16/34,环状铁粒幼细胞性贫血(RAS)患者为4/6,原始细胞过多难治性贫血及其转化型(RAEB/RAEB-T)患者为4/12,CMML患者为2/7。低危组HLA-DR15表达比例高于高危组(P<0.05)。MDS核型异常和核型正常者HLA-DR15基因表达无差异(P>0.05)。结论MDS患者HLA-DR15阳性率明显增高;HLA-DR15基因可能是MDS的易感基因,可能可作为MDS的一个预后评价指标。     

内皮素拮抗剂对大鼠硝酸甘油耐药性的影响

目的: 探讨内皮素受体拮抗剂Bosentan对大鼠硝酸甘油耐药的改善作用.方法: Wistar 大鼠28只,随机分成对照组(C组,n=10),硝酸甘油组(NTG组,n=6), Bosentan组(n=6),硝酸甘油+Bosentan组(NTG+Bosentan组,n=6).观察各组大鼠对硝普钠(SNP)的降压反应.用放射免疫方法测定各组血浆和血管组织的内皮素-1(ET-1) 含量.结果: NTG组大鼠对SNP的降压反应最弱,NTG +Bosentan组大鼠对SNP的降压反应明显强于NTG 组大鼠, NTG +Bosentan组大鼠离体主动脉环对不同浓度SNP的舒张反应较NTG组大鼠有明显的改善. NTG +Bosentan组大鼠血浆及血管组织ET-1含量与NTG组大鼠比较差异无显著性,均明显高于C组大鼠.结论:内皮素受体拮抗剂Bosentan可以改善NTG耐药的发生.     

不同海拔脓毒症大鼠细胞因子表达和肺损伤的实验研究

目的分析海拔因素对脓毒症大鼠血清中细胞因子表达和肺损伤的影响,探讨细胞因子网络与脓毒症及某些高原疾病的相关性。方法将果洛州玛多组（4268m）、西宁组（2276m）和郑州组（112m）各54只雄性SD大鼠随机分为正常对照组（n=6）、假手术组（n=24）和模型组（n=24）。采用盲肠结扎穿孔术（CLP）制备脓毒症模型,于造模后2、6、12、24h处死大鼠,假手术组在相同时间点处死大鼠,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清TNF-α、IL-6、IL-10水平;留取各时间点完整左肺组织做病理切片,右肺组织测定湿干（W/D）比重;记录模型组各时间点脓毒症大鼠死亡例数,统计其死亡率。结果模型组各时间点TNF-α、IL-6、IL-10水平均高于假手术组（P〈0.01）;各组间相比较,随着海拔升高,炎症细胞因子各时间点表达水平均明显升高（P〈0.01）;肺组织损伤情况呈递进性加重;模型组于造模6h以后肺湿干比重差异显著（P〈0.01）;模型组脓毒症大鼠死亡率明显增加（P〈0.05）。结论模型组各时间点细胞因子表达水平均高于假手术组;海拔越高,炎症细胞因子表达水平越高,肺组织损伤越严重,脓毒症症状较低海拔者越重,脓毒症大鼠死亡率越高。     

MK-801对局灶性脑缺血再灌注大鼠细胞增殖的影响

目的 研究MK-801对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经干细胞增殖的影响.方法 60只雄性SD大鼠,随机分为正常时照组(n=6)、假手术组(n=6)、手术组(n=12)和手术MK-801不同浓度干预组(0.2、0.4、0.6、0:8、1.0和1.2 mg/kg n=36).用线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型,在模型制作前30 min按照不同浓度组的剂量腹腔注射MK-801,假手术组和手术对照组腹腔注射等量的生理盐水.在模型建立后第7天,通过免疫组化技术标记大鼠梗塞区大脑皮质的Brdu阳性细胞数目.结果 MK-801浓度为0.4mg/kg时,可以明显抑制内源性神经干细胞的增殖,0.8ms/ks剂量以上有显著的抑制作用,并且随着浓度升高抑制作用呈递增趋势.结论 NMDA受体拮抗剂MK-801在局灶性脑缺血后对大鼠内源性神经干细胞的增殖有抑制作用,并且随浓度的增加抑制作用增强.     

不同受压时间窗及干预方式对压疮大鼠模型皮肤损伤及缺血再灌注的影响

目的 观察不同受压时间窗及干预方式对压疮大鼠模型的皮肤损伤及缺血再灌注的影响.方法68只SD大鼠随机分为空白组(S组,n=4,不施压)及造模组(n=64);根据是否采取干预措施,将造模组随机分为不处理(a组,n=32,施压后直接处死)及后处理组(b组,n=32,施压后予缺血后处理后再处死)两小组,分别在受压2、4、6、8 h(每个时间点均为n=8)后观察皮肤受压程度、中性粒细胞浸润程度及血清氧自由基的水平.结果 S、a及b三组大鼠的皮肤损伤程度构成差异有统计学意义(P=0.001),以b组轻于a组;在时间窗方面,受压6h组有2只大鼠表现为重度损伤,8h有6只重度损伤(37.5%);而受压2h及4h均无造成重度损伤,不同时间窗的损伤程度差异有统计学意义(P=0.043);中性粒细胞浸润程度方面,b组Ⅰ级程度(最轻)只数多于a组(n=17 vs n=15),Ⅱ级少于a组(n=8 vs n=10),不同干预方式下的浸润程度差异有统计学意义(P=0.002);受压2 h造成的浸润程度最轻,其次为4 h及6 h;8 h最重,不同受压时间所致的中性粒细胞浸润程度有统计学意义(P=0.027).在缺血再灌注方面,随着干预时间的延长,a及b组均表现血清超氧化物歧化酶含量下降,而丙二醛及一氧化氮上升,总体以2h及4h的再灌注损伤程度低于6 h及8 h;组间比较显示b组的超氧化物歧化酶含量显著高于a组,而丙二醛及一氧化氮低于a组(均为P<0.05).结论 缺血后处理能减轻急性压疮缺血再灌注损伤,其保护作用的有效时间窗为骨骼肌缺血6h以内,4h次之,2h内保护效果更佳.缺血后处理能有效改善大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤所致的氧自由基的损伤和炎症反应.     

人参皂苷Rg1对脑挫伤后大鼠脑内胰岛素样生长因子1表达的影响

目的：探讨人参皂苷Rg1对脑组织挫伤后大鼠脑中胰岛素样生长因子1（insulin—like growth factor-1，IGF-1）表达的影响。方法：Wistar大鼠26只，分为正常对照组（2只），脑挫伤模型组（8只）及人参皂苷Rg1治疗组（16只），在损伤后不同时间点（损伤后6h、12h、2d及6d）分别处死大鼠，使用免疫组化方法观察并检测脑中IGF-1的表达。结果：与对照组相比，脑挫伤模型组损伤后各时间点脑组织中IGF-1的表达有所升高（P〈0．05）；与模型组比较，人参皂苷Rg1治疗组IGF-1的表达明显升高（P％0．05）。结论：人参皂苷Rg1可能通过促进脑挫伤后脑组织IGF-1的表达，促进脑组织的功能恢复。     

“贺氏三通法”不同时点针刺对脑缺血再灌注大鼠超氧化物歧化酶和丙二醛的影响

目的观察"贺氏三通法"不同时点针刺对脑缺血再灌注大鼠缺血区脑组织和血清超氧化物歧化酶(super oxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平的影响。方法将成年雄性SD大鼠随机分为假手术组(8只)、模型对照组(10只)、针刺组(30只)。根据干预时间的不同,针刺组分为3h针刺组、6h针刺组、48h针刺组,每组各10只。采用线栓法复制大鼠脑缺血再灌注模型,针刺组在模型复制成功后分别按3、6、48h分组给予"贺氏三通法"针刺,每日1次。模型复制成功72h后测定血清及脑组织中SOD活性和MDA含量。结果与模型对照组比较,各针刺组大鼠脑组织SOD活性显著增加(P<0.01),6h针刺组血清SOD活性有升高趋势(P>0.05);而针刺组大鼠血清MDA含量显著增加(P<0.01)。6h针刺组大鼠血清SOD活性、MDA含量显著高于3h和48h针刺组(P<0.05,或P<0.01)。结论 "贺氏三通法"早期介入可调节SOD、MDA的代谢紊乱,从而对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织起到保护作用。     

重组人促红细胞生成素对大鼠急性创伤性脑损伤脑组织中基质金属蛋白酶-9及水通道蛋白-4表达的影响

目的 探讨重组人促红细胞生成素（rhEPO）对大鼠急性创伤性脑损伤的神经保护作用及其机制。方法健康雄性SD大鼠55只随机分为假手术组（n=5）、对照组（n=25）和EPO治疗组（n=25）;对照组和治疗组采帽改进的Feeney等的方法制作脑创伤模型,EPO治疗组在模型建立后立即腹腔注射rhEPO5000U／kg,对照组和似手术组往等时间点给予等量生理盐水。根据伤后处死时间点不同每组再分为5个亚组,即6h、24h、48h、3d、7d组．每个亚组5只动物。断头、取脑,行HE染色和免疫组织化学方法检测大脑皮层组织中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及水通道蛋白-4（AQP-4）的表达。结果脑创伤大鼠6h创伤灶脑组织出现MMP-9和AQP-4的表达。与假手术组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。EPO治疗组和对照组槲比较MMP-9及AQP-4的表达明显降低（P〈0．05）。结论 rhEPO对大鼠急性创伤性脑损伤有一定的神经保护作用,其机制可能是通过降低MMP-9及AQP-4的表达来实现的。     

根据细胞周期序贯联合用药对阿霉素肾病大鼠的疗效

目的观察三种根据细胞周期序贯联合用药方案对阿霉素肾病大鼠的治疗效果并进行比较。方法38只大鼠随机分为正常对照组（n=6）、肾病组（n=8）和治疗组（n=24）。采用阿霉素诱导肾病大鼠模型。治疗组随机分为3组：Mp＋Cs＋CTX组、Mp＋Rap＋CTX组、Mp＋LEF＋CTX组,分别采取三种根据细胞周期序贯联合用药方案治疗4周。以S-丽春红法测24h尿蛋白定量,全自动生化仪检测血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）。结果①肾病组大鼠24h尿蛋白定量显著高于正常对照组,3个治疗组的大鼠24h尿蛋白定量均显著低于肾病组;肾病组大鼠血清TP水平显著低于正常对照组,Mp＋Cs＋CTX组、Mp＋Rap＋CTX组的大鼠血清’T1）水平显著高于肾病组;肾病组大鼠血清ALB水平显著低于正常对照组,3个治疗组大鼠血清ALB水平均显著高于肾病组。②3个治疗组中Mp＋Cs＋CTX组的大鼠24h尿蛋白定量、血清TP、血清ALB水平与肾病组相比变化最为显著。结论三种根据细胞周期序贯联合用药方案对阿霉素肾病大鼠尿蛋白排出量增加和血清蛋白水平下降均有改善,其中激素联合Cs与CTX的治疗方案疗效最好。     

急性心肌缺血损伤后大鼠穴区NO和NOS的变化及不同频率电针的干预作用

目的 观察大鼠急性心肌缺血损伤( AMI)后,经穴一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性的特异性变化及不同频率电针内关穴在保护急性心肌缺血损伤时对相关经穴NO含量和NOS活性的特异性影响.方法 30只雄性Wistar大鼠随机分为4组,正常组6只,将18只心肌缺血模型制备成功的大鼠平均分为模型组、低频治疗组和高频治疗组各6只.采用硝酸还原酶法测定NO的含量,比色法测定NOS活性.结果 心肌缺血模型组的内关、天泉、郄门、外关和足三里穴区NO水平和NOS活性较正常大鼠同名穴区均显著降低(P ＜0.001),高频电针内关治疗后,内关、天泉和郄门穴区NO水平较模型组显著升高(P＜0.05),内关、外关和足三里穴区NOS活性较模型组明显升高(P＜0.05).结论 高频电针内关可保护心肌缺血损伤的机理可能与其阻抑了内关、郄门和天泉穴区NO含量的降低,提高内关、外关和足三里穴区NOS活性相关.