p66Shc-线粒体信号通路在氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞凋亡中的作用

【立论依据】 氧化低密度脂蛋白(oxLDL)可经线粒体途径诱导巨噬细胞凋亡并影响动脉粥样硬化斑块稳定性,但具体的分子机制尚未阐明。近有研究显示:在人内皮细胞,oxLDL可通过激活蛋白激酶C-β(PKCβ)与c—Jun氨基末端激酶(JNK)从而使衔接蛋白p66^Shc发生磷酸化;另有文献报道:磷酸化的p66^Shc可转位到线粒体引起线粒体损伤。本实验旨在探讨p66^Shc-线粒体信号通路在oxLDL诱导的人巨噬细胞凋亡中的作用。 【设计思路】 本实验分两部分:第一部分拟证明oxLDL可促进巨噬细胞中p66^Shc的磷酸化及线粒体转位;第二部分拟证明p66^Shc磷酸化及转位在oxLDL诱导的线粒体损伤、线粒体凋亡途径中起重要作用。 【实验内容】 采用序列超速离心法分离健康人新鲜血浆LDL,继而用CuSO4氧化制备oxLDL;体外培养THP-1细胞(人外周血单核细胞)并用佛波酯诱导为巨噬细胞,蛋白质印迹法检测oxLDL对p66^Shc及胞浆和线粒体中磷酸化p66^Shc(Ser36)蛋白表达的影响;而后将细胞分为对照组、oxLDL组及oxLDL+SiRNAp66^Shc组,用流式细胞仪及荧光显微镜检测线粒体膜电位、线粒体内超氧阴离子及细胞凋亡的变化,蛋白质印迹法检测线粒体凋亡途径相关蛋白的表达。 【材料】 采用含10%FBS的高糖1640培养液培养细胞;采用Rhodamine 123染色检测线粒体膜电位,MitoSOX Red试剂盒染色检测线粒体内超氧阴离子,AnnexinV FITC 试剂盒双染检测细胞凋亡;采用p66^Shc、phospho-p66^Shc( Ser36)、细胞色素C、caspase-9等抗体检测相关蛋白的表达。 【可行性】 我们前期预实验结果显示oxLDL可加速p66^Shc磷酸化和线粒体损伤,且两者呈正相关,这为该假说的成立提供了有力证据;实验负责人跟随导师进行科研工作两年,已熟练掌握相关实验技术;本实验承担单位泰山医学院动脉粥样硬化研究所具备实验所需全部仪器设备,实验条件完善。 【创新性】 本实验首次研究p66^Shc在oxLDL诱导的人巨噬细胞线粒体凋亡中的作用,可进一步阐明p66^Shc与AS发生发展的关系,从而为AS的防治锁定新靶点。     

晚期糖基化终产物诱导内皮细胞通透性增高的机制

【立论依据】 晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)可通过[Ca²⁺]通道诱导细胞凋亡,而AGEs是否也能通过该通道诱导内皮细胞通透性增高尚不清楚,若我们能够证实,将对于糖尿病防治及其并发症的控制具有重大指导意义。 【设计思路】 用EGTA抑制外钙内流,研究[Ca²⁺]在AGEs介导的肌动蛋白骨架的改变,通透性的增高以及moesin磷酸化中所起的作用。 【实验内容】 探讨AGEs介导肌动蛋白丝F-actin改变的剂量和时间效应;证实 EGTA对AGEs介导内皮细胞骨架肌动蛋白改变的抑制作用;探讨AGEs引起内皮细胞通透性增高的时间和剂量效应;证实AGEs介导内皮细胞通透性的改变是[Ca²⁺]依赖性的;探讨AGEs引起moesin蛋白磷酸化的时间和剂量效应;验证AGEs引起moesin蛋白磷酸化是[Ca²⁺]依赖性的。 【材料】 激光共聚焦显微镜,跨上皮细胞电阻检测仪,倒置显微镜,垂直电泳仪,Transwell培养皿,低温离心机,Petri Dish培养皿,HUVECS细胞株,胰蛋白酶,Moesin抗体及磷酸化Moesin抗体,罗丹明-鬼笔环肽,胎牛血清,磷酸盐缓冲液,0.5% TritonX-100,4%多聚甲醛固定液,FITC标记的右旋糖干,EGTA标准溶液,细胞裂解液,封闭缓冲液,Tris盐缓冲液,TBST缓冲液,电泳加样缓冲液,Tris溶液。 【可行性】 本项目假设有类似文献支持,有一定的理论基础。本研究团队近年来一直在休克微循环实验室从事AGEs和内皮细胞通透性方面的工作。经过多次试验,已掌握一定的技术手段和研究数据。我们的预实验结果已经显示AGEs刺激脐静脉内皮细胞呈浓度和时间效应,且EGTA能有效地抑制了AGEs在第8小时诱导的通透性的增高。 【创新性】 本研究将首次阐述AGEs是否依赖于[Ca²⁺]导致内皮细胞通透性的增高,目前国内外还未有论文涉及此话题,研究结果将进一步揭示AGEs在糖尿病并发症、动脉粥样硬化相关疾病的机制。     

TRPC通道在阿尔茨海默病(AD)大鼠的蛋白表达及其功能研究

【立论依据】 阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)也称老年痴呆症,是发生在老年人的一种中枢神经系统退行性疾病。临床表现为进行性记忆力丧失、认知功能减退以及人格改变。AD的发病病因和机制至今尚不清楚。瞬时受体电位阳离子通道(TRPC)是一类非选择性Ca²⁺通道,广泛表达于平滑肌细胞、内皮细胞和中枢神经系统,主要维持细胞内、ER和线粒体的Ca²⁺水平。在神经系统,主要参与神经增殖和退行性变。单核苷酸多态性(SNP)研究表明,TRPC4通道参与到阿尔茨海默病的发病中,但目前TRPC通道在阿尔茨海默病动物模型神经组织中的表达和功能机制尚不清楚。 【设计思路】 本项目采用寡聚型Aβ早期AD大鼠模型,对TRPC家族通道在神经系统的表达进行分析,给予TRPC通道激活剂和阻断剂,观察分离神经细胞的钙代谢变化及AD大鼠的行为学改变,探讨TRPC通道在AD发病过程中的作用。 【实验内容】 (1)大鼠海马区注射Aβ寡聚体构建早期的阿尔茨海默病模型;Morris水迷宫检测大鼠的神经元损伤和学习记忆功能障碍及病理学改变。(2) 分离海马区的神经元细胞,利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测TRPC家族通道在神经组织中的表达。(3)分离海马区的神经元细胞,给予TRPC通道的激活剂和阻断剂,利用激光扫描共聚焦显微镜技术,检测神经细胞的胞内钙离子浓度变化。(4)给予在体AD大鼠模型TRPC通道的激活剂和阻断剂,观察大鼠的行为学改变。 【材料】 Morris水迷宫设备、激光扫描共聚焦显微镜。 【可行性】 研究室拥有本实验所需的设备和大鼠AD模型制备技术。学生拥有基本的分子生物学实验技能。 【创新性】 目前TRPC通道在阿尔茨海默病动物模型神经组织中的表达及其功能机制尚不清楚,未见有相关报道;试验结果可以为以TRPC通道为靶点的阿尔茨海默病的药物治疗提供理论基础。     

人胚胎干细胞诱导分化角膜内皮细胞

【目的】 体外模拟角膜内皮细胞(corneal endothelial cell, CEC)的发育过程,利用生长因子和细胞外基质构建微环境,制备适当的条件培养基诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cell, hESC)分化为CEC。 【方法】 用丝裂霉素C处理胚鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs),接种于明胶预包被培养皿内做饲养层细胞。hESCs接种于MEFs饲养层,传代并免疫荧光鉴定。分割hESCs克隆团块,用拟胚体(embryonic bodies, EBs)培养基悬浮培养形成球形的EBs。用丝裂霉素C处理角膜基质细胞,接种于明胶预包被培养皿内做饲养层细胞。EBs接种于膜基质细胞饲养层,将SV-40转染的人晶状体上皮细胞接种于transwell小室与EBs共培养,EBs逐渐分化形成类角膜内皮细胞。环钻钻取新鲜猪眼球中央角膜片,脱细胞处理后,机械切取脱细胞猪角膜基质(acellular porcine cornea matrix, APCM),即获得APCM支架。倒置显微镜下剖切APCM后板层,甘油脱水。将hESCs来源的类角膜内皮细胞接种于APCM后弹力层表面构建CEC植片,培养7 d。 【结果】 hESCs培养6 d后可于饲养层上形成类圆形克隆团,在悬浮培养基中悬浮培养形成EBs。EBs于角膜基质成纤维细胞饲养层上与人晶状体上皮细胞系共培养,EB面积逐渐增大,中央部分形态发生变化,形成单层排列的多边形细胞。免疫荧光检测,可表达类角膜内皮细胞标记物Na⁺/K⁺ ATPase。类角膜内皮细胞接种于APCM支架培养,H-E染色证实后弹力层表面形成单层类角膜细胞结构。 【结论】 目前已经完成了hESC、人角膜基质成纤维细胞和人晶状体上皮细胞系的培养。实现了hESCs向角膜内皮细胞的诱导分化。完成了APCM的制备和鉴定。并成功以hESC和APCM构建了组织工程角膜内皮植片。植片的功能有待动物实验进一步研究。     

TSC1基因对调节性T细胞发育分化的免疫调控作用

【目的】 本研究利用TSC1的T细胞特异缺失小鼠探讨TSC1对T细胞尤其是调节性T细胞(Treg)发育的免疫调控效应。 【方法】 主要应用T细胞特异性TSC1基因敲除小鼠(Lck-cre; TSC1loxp/loxp)及细胞分子免疫学技术, 阐明TSC1基因对CD4⁺ Treg发育分化及其免疫功能的重要调控作用和规律。 【结果】 (1)TSC1基因缺失小鼠,其胸腺CD4⁺CD8^-T (CD4SP),CD8⁺CD4^-T(CD8SP),CD4^-CD8^-T(DN)和CD4⁺CD8⁺T(DP)细胞百分率无显著差异;(2)TSC1基因缺失小鼠CD4⁺Foxp3⁺Tregs百分率和细胞绝对数均明显增加;(3)小鼠外周免疫器官(脾脏)的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞百分率和绝对数均无显著差异;(4)小鼠胸腺中CD4⁺CD25⁺Foxp3^-T细胞百分率和绝对数有下降的趋势;(5)小鼠胸腺中Treg其他亚型如CTLA-4以及GITR型均有所增加。 【结论】 TSC1缺失可以影响nTreg的发育和分化,而对iTreg发育和分化无明显影响,并且TSC1对于nTreg的调节可能是通过调控其前体发育分化而实现的。     

同型半胱氨酸经PRMTs调控E2F1 差异甲基化介导内皮细胞凋亡和平滑肌细胞增殖的作用机制研究

【立论依据】 动脉粥样硬化(AS)是以退行性和增生性病变为特征的复杂性疾病,高同型半胱氨酸血症(HHcy)是其独立危险因子。内皮细胞(ECs)和血管平滑肌细胞(VSMCs)是HHcy致AS形成的基本细胞类型,但两者的病理变化却截然相反:ECs主要表现为凋亡、损伤和功能障碍;而VSMCs则主要表现为增殖、基质合成和分泌亢进;有研究提示E2F1可因修饰位点不同而分别调控细胞的凋亡和增殖,是决定细胞增殖或凋亡的"开关",但其在Hcy致ECs凋亡和VSMCs增殖并存中的具体作用未见报道。 【设计思路】 E2F1是既能促增殖亦能促凋亡的关键靶基因,Hcy经PRMTs修饰E2F1 不同位点导致血管ECs凋亡和VSMCs增殖并存从而引起As。 【实验内容】 复制HHcy AS模型,验证模型是否成功;分析血管组织中ECs凋亡和VSMCs增殖的变化,并在体外培养ECs和VSMCs上验证;检测E2F1在血管和两种细胞中的表达,在HHcy致ApoE^-/-鼠AS模型和ECs/VSMCs共培养的基础上确定E2F1在Hcy致ECs凋亡和VSMCs增殖并存中的作用。分别在ECs和VSMCs及共培养的细胞内过表达和沉默PRMTs,检测E2F1修饰后产物的变化,并以流式细胞术等观察ECs凋亡和VSMCs增殖情况,探讨不同细胞类型中E2F1 精氨酸甲基化的作用及调控机制。 【材料】 ApoE^-/-鼠;核酸提取试剂盒;细胞培养系统;限制性内切酶; DNA甲基化试剂盒;PCR试剂盒;PCR仪;高速冷冻离心机;恒温摇床紫外凝胶成像系统;琼脂糖电泳系统等。 【可行性】 本课题经导师组老师仔细论证并完成了一部分实验,证实研究方案具有较高的可行性;本课题依托我校心脑血管疾病实验室,该室主要从事表观遗传学修饰在Hcy致AS作用机制研究,研究经验丰富,实验技术成熟稳定,具备本课题所需的平台和设备;课题组成员作为生物技术班的学生,已在实验室工作了一年时间,为本课题的顺利实施提供保障。 【创新性】 首次揭示以"Hcy经PRMTs调控E2F1精氨酸甲基化修饰致ECs凋亡和VSMCs增殖中的潜在差异"为核心的基因表达调控通路。     

TGF-α对角膜内皮细胞的保护作用及机理研究

【立论依据】 成人角膜内皮细胞缺乏增殖能力,损伤后只能由邻近细胞的扩大移行来填补缺损区,当损伤至一定程度时,可导致视力下降直至失明。经本课题组研究首次发现TGF-α既可促进角膜内皮细胞增殖,又可维持其正常功能,提示TGF-α可用于角膜内皮损伤类疾病的治疗。 【设计思路】 阐明TGF-α角膜内皮保护作用的机制,并以此为基础治疗角膜内皮损伤类疾病。 【实验内容】 (1) TGF-α角膜内皮保护作用的机制研究:以原代培养的大鼠角膜内皮细胞制造划痕损伤模型,通过蛋白质印迹实验、免疫荧光染色、实时定量PCR、流式细胞术等方法,①检测TGF-α受体EGFR表达量及其循环途径的改变;②检测其与EGFR结合后下游信号通路的激活;③检测角膜内皮细胞周期时相及相关周期蛋白的变化。(2)TGF-α角膜内皮保护剂体内疗效评价:以超声乳化机建立角膜内皮细胞损伤动物模型,通过不同剂型、剂量的TGF-α进行给药处理,①使用裂隙灯、共聚焦显微镜及内皮细胞计数仪等评估角膜内皮细胞的形态、数量及功能;②以形态学及免疫组化方法检测角膜内皮细胞增殖及功能特异性蛋白表达状况;③以基因芯片的方法检测TGF-α对受损角膜内皮细胞基因表达谱的改变及影响。 【可行性】 (1)理论可行性:本项目指导教师和导师组老师是长期从事眼科研究的资深教授,且本项目已进行部分实验,论据充分。(2)技术保障:本课题技术路线合理成熟,相关手段课题组成员在都已熟练掌握并灵活应用。(3)实验设备保障:项目依托单位为厦门大学眼科研究所,是福建省重点研究室,拥有一批先进的实验设备及相关技师可辅助本课题开展。 【创新性】 (1)本研究首次发现TGF-α可促进角膜内皮细胞增殖,且维持其功能,其作用及机制的研究将有利于深入了解角膜内皮细胞的再生,并可能获得理论上的突破。(2)有关角膜内皮细胞保护剂的研发尚属空白,国内外均未见报导,本课题将提供新的治疗角膜内皮细胞损伤的途径及药物。     

补阳还五汤对高血压前期大鼠T淋巴细胞亚群的影响

[目的]通过观察补阳还五汤对高盐所致高血压前期大鼠T淋巴细胞亚群比例及γ-干扰素（INF-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响,探讨补阳还五汤在调节高血压前期T细胞免疫中的作用机制。[方法]选取7周龄盐敏感大鼠（DS）与盐抵抗大鼠（SS）各20只,SS大鼠随机分为正常组和正常给药组,DS大鼠随机分为模型组和治疗组。各组大鼠适应性喂养后,改用高盐饲料喂养,同时监测大鼠尾动脉收缩压,待其血压值升高至120~139/80~89 mmHg （1 mmHg=0.133 kPa）这一范围时,确定为高血压前期大鼠模型,并以补阳还五汤灌胃治疗。治疗结束后大鼠腹主动脉取血,以流式细胞术检测全血中T淋巴细胞CD4⁺与CD8⁺的百分率,并计算CD4⁺/CD8⁺的比值。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测血清中INF-γ、TNF-α的含量。[结果]补阳还五汤可以下调CD4⁺T淋巴细胞及CD8⁺T淋巴细胞百分率,上调CD4⁺/CD8⁺的比值,降低TNF-α、INF-γ的含量。[结论]补阳还五汤可能是通过下调CD4⁺T淋巴细胞与CD8⁺T淋巴细胞的百分率以及INF-γ、TNF-α细胞因子的表达,改善高血压前期机体T细胞免疫功能及其炎症反应,延缓高血压前期的发展进程。     

虾青素对脊髓压迫性损伤脱髓鞘病变的治疗作用及其机制的研究

【立论依据】 在临床上,脊髓压迫性损伤(CSCI)十分常见,但目前尚缺乏有效的治疗方法。在CSCI过程中脊髓血液循环障碍,缺血使细胞内产生大量ROS,自由基同膜脂质不饱和脂肪酸作用致膜脂质过氧化,一方面导致内质网应激,激活内质网caspase12, caspase12在无Cyt-C的参与下激活下游的caspase9和caspase3,级联反应发生;另一方面内质网应激释放大量Ca²⁺,引起胞浆Ca²⁺超载,而大量Ca²⁺从胞浆进入线粒体导致其膜的结构及通透性改变,其结果是Cyt-C的过度释放,进而激活caspase9和caspase3,级联反应发生,引起少突胶质细胞凋亡。研究表明,CSCI中少突胶质细胞(OL)凋亡是诱发脱髓鞘病变的重要原因之一,而脱髓鞘病变是CSCI继发性损伤的重要病理改变之一。因此,如何抑制少突胶质细胞凋亡,是控制CSCI病情发展的关键。虾青素是目前发现的最强的天然抗氧化物质,具有强大的自由基清除和抗凋亡能力,但关于虾青素对CSCI脱髓鞘病变的影响尚未见报道。 【设计思路】 本实验通过自制脊髓压迫器,建立脊髓压迫性损伤大鼠模型,对虾青素抗OL凋亡及其机制进行研究。 【实验内容】 (1)建立CSCI大鼠模型,根据BBB评分法进行神经行为学评定。(2)LFB染色观察脱髓鞘病变,并用神经纤维髓鞘计数法计数。(3)分别利用TUNEL和化学发光法检测OL凋亡数量和自由基含量的变化。(4)利用荧光双标分别检测少突胶质细胞中Cyt-C、caspase-12和caspase-3的表达变化,利用Ca²⁺荧光剂测量细胞内游离Ca²⁺的浓度,激光共聚焦检测线粒体内Ca²⁺的浓度,在分子生物学层面上对CSCI中OL的凋亡机制以及虾青素的作用途径进行研究。 【材料】 雄性SD大鼠,脊髓压迫器,高纯度虾青素等。 【可行性】 (1)本课题组成功研制脊髓压迫器,并取得专利ZL:200520009289X;稳定性高,可靠性强。(2)LFB染色显示虾青素治疗组脱髓鞘病变显著低于CSCI组,初步证明虾青素可明显减轻CSCI后所导致的脱髓鞘病变。 【创新性】 (1)首次将虾青素应用于CSCI的研究和治疗,并取得初步成果;(2)对少突胶质细胞凋亡的内质网途径和线粒体途径进行研究,并把两条途径联系起来。     

大鼠大脑皮质星形胶质细胞α2A型肾上腺受体的表达研究

目的 验证大鼠大脑皮质星形胶质细胞中的α2A肾上腺素能受体（α2A-AR）的表达情况，并与α2B肾上腺素能受体（α2B-AR）、α2C肾上腺素能受体（α2C-AR）相比较。方法 获取目的基因α2A-AR、α2B-AR、α2C-AR的RNA反转录，与内参基因β-actin一起进行实时荧光定量PCR。重复6组，所得数据进行统计学分析并运用2^-△△Ct的方法进行计算。结果 大鼠大脑皮质星形胶质细胞中确实表达了α2A-AR，并且α2A-AR的相对表达量是α2B-AR的2^4.53倍，是α2C-AR的2^7.98倍。结论 α2A-AR可能为大鼠大脑皮质星形胶质细胞接受儿茶酚胺类神经递质调控的主要受体。