自体血清对牛血清适应性人间充质干细胞增殖的影响

目的观察自体血清对牛血清适应性人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)体外增殖的影响.方法用10%的自体血清培养牛血清适应性hMSCs,分别以新生牛血清、胎牛血清及全程自体血清组作为对照,通过相差显微镜、细胞计数、MTT法、CCK-8(cell counting Kit-8)检测观察各组hMSCs的增殖状况.结果各组细胞均呈现正常的形态,细胞生长曲线相似,自体血清促进hMSCs体外增殖的效率与胎牛血清相似,较新生牛血清高;自体血清对牛血清适应性hMSCs的增殖效率有负面影响,但仍比新生牛血清更高.结论10%的自体血清对hMSCs具有与胎牛血清类似的良好促增殖作用,并对牛血清适应性hMSCs的促增殖效率有尚可接受的轻微不利影响.     

不同氧浓度微环境对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响实验研究

目的 观察不同氧浓度微环境时间充质干细胞增殖的影响,对比分析间充质干细胞在体外常规培养与机体生理微环境中增殖情况的差异.方法 从大鼠骨髓中分离获取间充质干细胞;体外培养扩增后,以0.3×104细胞/孔密度接种于96孔培养板;待细胞完全贴壁后,按照实验分组、常规培养组、高压氧组和低压氧组进行处理;采用MTT发连续5d测定各组细胞OD值;统计分析不同氧浓度条件下骨髓间充质干细胞的增殖情况.结果 与常规培养组比较,5kPa高压氧组MSCs增长旺盛,第5天的OD值是常规培养组的1.2倍;且随着每次吸氧时间的延长而有增加趋势;2.0kPa高压氧组和低压氧组MSCs表现不同程度的增殖抑制,仅为常规培养组的64%和26%.结论 适宜的高浓度氧微环境可以促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖.     

不同浓度兔自体血清对脂肪源性干细胞增殖能力的影响

目的：观察不同浓度兔自体血清对脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells,ADSC）增殖活力的影响,并筛选出最佳血清培养浓度。方法：以大鼠为实验动物,首先制备自体血清,分离获取ADSC;然后选DMEM为基础培养基,采用不同体积分数（分别为5%、10%、20%）自体血清及10%体积分数胎牛血清培养基分别对ADSC进行培养;通过显微镜下细胞形态学观察、活细胞计数及MTT等方法对细胞进行检测,并对检测数据做统计学分析。结果：不同浓度自体血清培养培养条件下ADSC形态正常。与10%胎牛血清组进行比较,5%自体血清组ADSC增殖较慢（P〈0.01）,10%、15%自体血清组增殖较好,但组间无统计学差异（P〉0.05）。结论：兔自体血清培养ADSC是可行的,10%浓度自体血清是最佳培养浓度。     

孤啡肽对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的 观察孤啡肽(OFQ)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)增殖的影响.方法 Percoll法分离大鼠骨髓间充质干细胞,传2代后分别在含有浓度为0、10-13、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8和10-7 mol/L的OFQ培养基中继续培养,MTT法测定细胞活性.结果 当OFQ浓度小于10-11 mol/L时,OD值随着浓度的增大而增大,而当OFQ浓度大于10-11mol/L时,OD值随着浓度的增大而减小.结论 适当浓度的孤啡肽可促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖.     

鱼卵小分子多肽对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖作用的影响

目的观察不同浓度的鱼卵小分子多肽对SD大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)增殖作用的影响。方法分离、培养SD大鼠BM-MSCs,并采用流式细胞仪进行鉴定。选取第3代细胞进行观察和检测。实验组选取25、50、75、100、125、150、200、250、300μg/ml 9个多肽浓度,对照组加入不含小分子多肽的DMEM完全培养基。各组孵育24 h后采用MTT法检测其细胞增殖情况,确定其最佳作用剂量。在最佳作用量下,于12、16、20、24、32、40、48 h 7个时间点观察鱼卵小分子多肽对SD大鼠BM-MSCs增殖的情况。并采用流式分析鱼卵小分子多肽对BM-MSCs细胞周期的影响。结果鱼卵小分子多肽对BM-MSCs的促增殖作用的最佳浓度为100μg/ml,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。流式分析显示鱼卵小分子多肽可提高SD大鼠BM-MSCs非G1/G0期细胞比例。结论鱼卵小分子多肽对SD大鼠BM-MSCs有促增殖作用,最佳作用浓度为100μg/ml。     

过氧化氢对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响

目的观察过氧化氢(H2O2)对骨髓间充质干细胞的增殖活性的影响。方法使用密度梯度法分离大鼠骨髓间充质干细胞进行培养,以CD44鉴定后以不同浓度H2O2作用于MSC,建立MSC氧化损伤模型,通过MTT法检测MSC细胞损伤程度。结果在0.02%,0.04%,0.06%,0.1%,0.12%,0.17%,0.21%(V/V)浓度H2O2作用1h对MSC活性无影响,与对照组比较,差异无显著性(P>0.05);0.1%～0.21%浓度H2O2分别作用3,6和12h引起MSC增殖活性降低,呈量效依赖关系。结论0.1%～0.21%浓度H2O2作用3h后对MSC增殖起抑制作用,最佳H2O2作用浓度为0.12%和3h作用时间。     

不同浓度富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞增殖活性的影响

目的:探讨不同浓度的富血小板血浆(PRP)在不同时间段对体外培养骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖活性的影响。方法:将体外培养的MSCs分为对照组(单纯血清培养组)和不同浓度的PRP组(0.5%,1.0%,1.5%),用四唑盐比色法(MTT)检测在不同作用时间(24h、48h、72h)对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响。免疫组化方法检测细胞CD44、CD29、CD34的变化。结果:PRP中血小板浓度为全血的3.18倍,TGF-β和PDGF的浓度为全血的3.40倍;培养的细胞呈纤维状、克隆样生长;免疫组化表明CD29、CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达;MTT法显示不同浓度的PRP组在24h、48h、72h的平均吸光度(OD)值均高于对照组。结论:不同浓度的PRP在不同时间段可以促进骨髓间充质干细胞的增殖,并且随着浓度的增加PRP促进骨髓间充质干细胞增殖作用也增强。     

刺五加注射液对骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的探讨刺五加注射液对大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）增殖的影响。方法体外培养MSC，用四甲基偶氮唑法检测刺五加注射液促进大鼠MSC增殖的作用；用免疫组化法检测MSC细胞的Brdu标记阳性率。结果4种浓度的药液对MSC的增殖作用与对照组比较有显著性差异（P〈0．05）。结论刺五加注射液有促进MSC增殖的作用。     

CGRP对人骨髓间充质干细胞增殖影响的研究

目的探讨外源性重组人降钙素基因相关肽（hCGRP）对人源性骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）的增殖的影响,进而探索CGRP促进成骨的作用机制。方法采用梯度离心法和选择性培养基分离、纯化骨髓间充质干细胞,培养体系中添加不同浓度CGRP。于传代第三代进行细胞鉴定,光镜下观察细胞形态、MTT法检测细胞增殖能力、流式细胞仪测定细胞周期,以观察CGRP对MSCs增殖能力的影响。结果CGRP对MSCs增殖形态无明显影响,MTT示CGRP组细胞增殖速率快于对照组,流式细胞仪检测示CGRP组的MSCs的G2/G1期比例明显升高。结论CGRP对MSCs的增殖有直接促进作用,从而有利于骨形成。     

六味地黄丸对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:观察不同浓度六味地黄丸水提液对体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响.方法:应用全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠BMSCs,并传代扩增,倒置显微镜进行细胞形态学观察,免疫组化检测细胞表面抗原鉴定其表面标志.将BMSCs分为对照组及不同浓度六味地黄丸干预组,采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)观察其增殖情况.结果:采用全骨髓贴壁法获取的BMSCs形态呈长梭形,呈集落样生长;免疫细胞化学鉴定,CD44、CD29阳性,CD34阴性.MTT检测结果显示,与空白对照组相比,相当于生药含量4～0.25mg/ml浓度范围内,六味地黄丸水提液干预24h后,干预组吸光度均增高(P<0.05),其中1mg/ml浓度干预组吸光度升高最明显(P<0.01).结论:所培养的大鼠骨髓细胞在表型表达和细胞形态上具备MSC特征.在一定浓度范围内,六味地黄丸水提液可以提高BMSCs的体外增殖能力.     

辛伐他汀对骨髓间充质干细胞增殖及分泌功能影响的研究

目的:细胞水平观察不同浓度的辛伐他汀对骨髓间充质干细胞(bone marrow-drived mesenchymal stem cells,BMSCs)的增殖及旁分泌功能的影响并探讨其可能的机制?方法:采用全骨髓贴壁培养法培养SD大鼠的骨髓间充质干细胞,取3代对数生长期细胞,无血清培养12 h,不同剂量的辛伐他汀(0?0.001?0.010?0.100?1.000 ?滋mol/L)与MSCs共培养24 h,采用CCK-8试剂盒检测各浓度组BMSCs增殖情况,通过半定量RT-PCR检测不同浓度的辛伐他汀诱导BMSCs中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的mRNA表达?采用Western blot检测PAkt?AKt的表达?结果:辛伐他汀在一定浓度范围内(0.001~0.100 ?滋mol/L)显著提高了BMSCs增殖和VEGF和HGF的mRNA表达水平(与对照组比较,P < 0.01)?辛伐他汀浓度在0.010 ?滋mol/L时对BMSCs的增殖和分泌功能的影响最为显著,随着药物浓度的加大,BMSCs的上述功能呈下降趋势?与对照组比较,1.000 ?滋mol/L辛伐他汀对BMSCs无显著的促增殖作用,但却明显上调了VEGF和HGF mRNA的表达?0.010 ?滋mol/L辛伐他汀组pAKt表达及pAKt/AKt比值显著高于对照组(P < 0.01)?结论:辛伐他汀在一定浓度范围内对骨髓间充质干细胞的增殖及分泌功能有促进作用,其机制可能与Akt信号通路有关?     

血清及细胞因子对人骨髓间质干细胞增殖的影响

目的 :探讨影响体外骨髓间质干细胞增殖的因素。方法 :取胸部外科手术无血液系统疾病病人肋骨 ,采用密度梯度离心法分离单个核细胞 ,以每皿 5× 10 5个的细胞浓度接种 ,9d后 ,瑞士 吉姆萨染色 ,计数集落并进行统计分析。结果 :在 5 %～ 30 %的血清浓度范围内 ,骨髓间质干细胞集落数随血清浓度的升高而增多。bFGF ,IL 1α ,IL 3,IL 6等细胞因子可促进骨髓间质干细胞的增殖。结论 :血清浓度与细胞因子bFGF ,IL 1α ,IL 3,IL 6可促进MSC的增殖     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法及其生物学特性。方法采用全骨髓贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD29、CD34、CD45、CD90）等鉴定BMSCs特征。结果全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs,原代和传代培养具有活跃的增殖能力;BMSCs经诱导后可分别向成骨、成脂转化;流式分析表面标志分子高表达CD90（96.5%）、CD29（92.3%）,低表达CD34（0.89%）、CD45（1.41%）。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BMSCs,分离培养的BMSCs具有潜在的多向分化能力。     

兔骨髓间充质干细胞的提取与体外培养

目的：评价兔自体骨髓间充质干细胞作为半月板组织工程理建中种子细胞的可能性。方法;采用体外细胞培养技术将兔骨髓间充质干细胞自骨髓血中分离、纯化和和培养,并研究其增殖及生长特征。结果：原代培养及传代培养显示,兔自体骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖增能力。结论：兔自体骨髓间充质干细胞生物年龄较为年轻,用作半月板组织工程 种子细胞具有较强的可行性。     

骨髓间充质干细胞对继发性骨质疏松大鼠骨缺损愈合的影响

目的：探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)在继发性骨质疏松性的个体骨缺损愈合过程中的作用。方法采用全骨髓贴壁分离法培养原代BMSCs细胞,并使用流式细胞仪检测及使用成骨成脂特异性染色鉴定培养的BMSCs;选取60只雌性SD大鼠,通过肌注地塞米松(DEX,1 mg·kg-1·d-1)8周,建立大鼠骨质疏松模型。所有大鼠经手术于胫骨平台下钻孔造骨缺损模型,将大鼠随机分成三组：对照组(NS组,骨折不处理)、DEX骨折+生理盐水(NS)组、DEX+BMSCs组,将BMSCs注射到大鼠骨缺损部位治疗(采用生理盐水进行对照),于术后4周和8周,采用Micro-CT检测各组大鼠的骨缺损愈合情况。结果经流式细胞表型鉴定及成骨成脂特异性染色实验均证实分离得到的细胞是BMSCs。Micro-CT结果表明,与DEX+NS组比较,BMSCs细胞治疗能促进DEX诱导的骨质疏松性骨折的愈合。结论 BMSCs对继发性骨质疏松性大鼠的骨缺损具有显著的促进愈合作用,这为临床治疗继发性骨质疏松个体的骨损伤提供了一种新的研究思路。     

Effect of RGD-modified silk material on the adhesion and proliferation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells

In order to investigate the effect ofArg-Gly-Asp （RGD） peptide-modified silk biomaterial on the adhesion and proliferation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells （MSCs）, MSCs of third generation were seeded onto the surface of RGD-decorated silk （silk-RGD group）, silk alone （silk group） or tissue culture plate （TCP group）. After incubation for 4 or 12 h, MSCs were examined quantitatively by using precipitation method for cell attachment. The cell proliferation, which was defined as cell density, was compared among the three groups after culture for 1, 2, 3, and 4 days. Cell skeleton, which was labeled fluorescently, was observed under laser confocal microscope after 24 h of culture. The results showed that cell adhesion rate in silk-RGD group was higher than in silk group （P〈0.05）, but similar to that in TCP group after incubation for 4 or 12 h （P〉0.05）. There were no sig- nificant differences in the cell proliferation among the three groups at different time points （P〉0.05 for all）. Laser confocal microscopy revealed that in silk-RGD group, MSCs, strongly fluorescently stained, spread fully, with stress fibers clearly seen, while in silk group, actin filaments were sparsely aligned and less stress fibers were found. It was concluded that RGD peptide could improve the ad- hesion of MSCs to the silk scaffold, but had no impact on the proliferation of the cells.     

In vitro chondrogenic phenotype differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells

Summary In order to study the chondrogenic phenotype differentiation of adult sheep bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) in a defined medium as potential seed cells for cartilage tissue engineering, MSCs were isolated by density centrifugation with Percoll solution from bone marrow aspirated from sheep iliac crest. The third passage of MSCs were induced with H-DMEM containing TGF-β3. IGF I. Dexamethasone and VitC. The shape and ultrastructure of cells were observed, toluidine blue stain for GAG and immunohistochemistry for type II collagen were applied for chondrogenic phenotype identification. After 14 days of induction, MSCs changed from a spindle-like appearance to a polynal shape, a large amount of endoplasmic reticulum. Golgi complex and mitochondria were observed, and the differentiation of MSCs chondrogenic phenotype was verified by positive staining of toluidine blue and immunohistochemistry. MSCs derived from bone marrow can differentiate to chondrogenic phenotype when inducedin vitro and can be used as optimal seed cells for cartilage tissue engineering. ZHANG Yufu, male, born in 1976, M. D., Ph. D. This project was supported by a grant from the National Basic Science Research and Development Foundation (2001AA216031).     

大鼠骨髓间充质干细胞植入大鼠脑内后的迁移

目的：研究大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）植入脑内后的存活和迁移性。方法：分离大鼠MSCs体外培养、纯化。Hoechst33342标记后立体定向植入大鼠海马CA4区,1、2、4周后处死大鼠取脑,制作冷冻切片;用荧光显微镜观察Hoechst33342阳性细胞。结果：原代、传代细胞贴壁生长,有较强的增殖能力;植入大鼠海马后沿针道及注射区可见多数存活细胞,散在分布,自植入区及针道向周围逐渐减少。结论：大鼠MSCs植入大鼠脑内后能够存活并具有向周围组织迁移的能力。