细胞内活性氧在晚期糖基化终产物促肾小球系膜细胞合成纤维连接蛋白中的作用

目的 观察晚期糖基化终末产物(AGEs)对大鼠肾小球系膜细胞合成和分泌纤维连接蛋白的影响及细胞内活性氧(ROS)在其中的作用.方法 在体外制备AGEs,分别用不同浓度的(0,100,500,1000 μg/mL)AGEs及抗氧化剂N-酰-L-半胱氨酸(NAC 30 mmol/L)作用于肾小球系膜细胞,以氧化敏感的荧光染料2、7-二氢二氯荧光素(DCFH)染色,流式细胞仪测定细胞内ROS强度;再用RT-PCR和ELISA方法测定系膜细胞中纤维连接蛋白的表达.结果 AGEs能使细胞内ROS水平明显升高(P<0. 05),呈现浓度依赖效应;AGEs同时以时效和量效方式促进肾小球系膜细胞中纤维连接蛋白基因和蛋白的表达(P<0.05);而NAC能够明显抑制AGEs所致的细胞内ROS升高,同时抑制肾小球系膜细胞中纤维连接蛋白的合成和分泌(P<0. 05).结论 AGEs可能部分通过诱导细胞内ROS,促进肾小球系膜细胞表达分泌纤维连接蛋白,从而引起肾小球系膜基质增生,最终导致肾小球纤维化,而抗氧化治疗可能有助于阻止糖尿病肾病的氧化应激损害和肾小球纤维化的发展进程.     

糖基化终产物对人肾小球系膜细胞半乳糖凝集素-3基因表达的影响

目的:研究糖基化终产物(AGEs)对人肾小球系膜细胞半乳糖凝集素-3(galectin-3)表达的影响。方法:将培养的人肾小球系膜细胞(HRMC)用不同浓度(50、100、200及400 mg.L-1)的AGEs干预24 h或同一浓度(200 mg.L-1)的AGEs干预0、24、48及72 h,以无血清培养基(DMEM)和相应浓度的牛血清白蛋白(BSA)为对照。用RT-PCR检测细胞中半乳糖凝集素-3的mRNA水平。结果:不同浓度AGEs组HRMC的半乳糖凝集素-3 mRNA水平与对照组相比均有显著差异(P<0.01),且随着AGEs浓度的增高,半乳糖凝集素-3 mRNA水平也逐渐增高(P<0.05);AGEs干预HRMC 24、48、72 h,半乳糖凝集素-3mRNA水平与对照组相比有显著差异(P<0.05),且随着干预时间的延长,半乳糖凝集素-3 mRNA水平也逐渐增高(P<0.01)。结论:AGEs以时间及剂量依赖的方式促进HRMC半乳糖凝集素-3 mRNA的表达。     

醛固酮对大鼠肾小球系膜细胞结缔组织生长因子基因表达的影响

目的 探讨醛固酮(ALD)对大鼠肾小球系膜细胞结缔组织生长因子(CTGF)基因表达的影响.方法 ①以不同浓度的ALD (10-11、10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)刺激肾小球系膜细胞72 h后,用半定量KT-PCR.法检测细胞中CTGF mRNA的表达.②以10-9 mol/L的ALD刺激肾小球系膜细胞不同时间(12、24、48、72 h)后,用半定量RT-PCR法检测细胞中CTGF mRNA的表达.结果 半定量RT-PCK结果显示,随着ALD浓度的升高,CTGF mKNA的表达量(以CTGF/GAPDH mRNA表示)明显增加.在10-7mol/L时达高峰,与对照组比较,差异有显著性(P＜0.01).表明ALD促进肾小球系膜细胞CTGF mRNA的表达,且具有一定的剂量-反应关系.以10-7mol/L的ALD作用于大鼠肾小球系膜细胞12～72h,随着作用时间的延长,CTGF mRNA的表达量明显增加,在72 h时达高峰,与对照组比较,差异有显著性(P＜0.01).表明ALD促进系膜细胞CTGF mRNA的表达,且具有一定的时间-效应关系.结论 ALD促进大鼠肾小球系膜细胞CTGF mRNA的表达,从而促进慢性肾脏病进展.     

高糖、茶多酚对人系膜细胞结缔组织生长因子、纤维连接蛋白mRNA表达的影响

目的:研究高糖条件下系膜细胞氧化失衡与结缔组织生长因子(CTGF)、纤维连接蛋白(FN)mRNA表达之间的关系,通过抗氧化剂茶多酚证实氧化应激在糖尿病肾硬化发展中的作用。方法:高糖(35mmol/LD鄄糖)条件下培养系膜细胞,加或不加茶多酚(20μg/ml),采用分光光度法检测不同时间点(0、12、24、36、48h)的上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)含量及RT鄄PCR法细胞CTGF、FNmRNA的表达水平。结果:高糖显著降低上清SOD、CAT活力(P<0.05),升高MDA水平(P<0.05),刺激系膜细胞CTGF、FNmRNA高表达;茶多酚能有效抑制高糖的上述作用(P<0.05)。结论:①高糖条件下活性氧生成增多,抗氧化酶活性下降,氧化失衡,促进组织纤维化的进展。②茶多酚通过调节氧化失衡抑制纤维化的进展。③氧化平衡失调在DN发生、发展中具有重要的作用。     

糖基化终产物对人肾系膜细胞MMP-2表达的影响

目的：观察糖基化终产物（advanced glycosylation end products,AGEs）对人肾系膜细胞（human renal mesangial cell,HRMC）基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase,MMP-2）表达的影响。方法：运用糖基化修饰的牛血清白蛋白（AGE-BSA）干预体外培养的HRMC,Western blot检测系膜细胞MMP-2蛋白表达。结果：HRMC的MMP-2蛋白表达水平随AGE—BSA浓度增加和干预时间延长而降低（P〈0．01）。结论：MMP-2可能参与AGEs所致的糖尿病肾病的发生发展。     

醛固酮对大鼠肾小球系膜细胞表达结缔组织生长因子的影响

目的:探讨醛固酮(ALD)对大鼠肾小球系膜细胞表达结缔组织生长因子(CTGF)的影响,及转化生长因子β1(TGF-β1)是否参与其信号通路。方法:大鼠肾小球系膜细胞加入不同浓度的ALD共同培养0、12、24、36、48h,RT-PCR方法评价CTGF mRNA的表达;用ELISA方法检测TGF-β1蛋白的表达;并用TGF-β1/Smads信号通路的特异性丝、苏氨酸激酶抑制剂Staurosporine(STA)加以对比。结果:ALD刺激后肾小球系膜细胞CTGF mRNA表达水平增加,且呈剂量依赖性,TGF-β1蛋白表达也明显增加;用STA预处理1h后再用ALD刺激24h,则CTGFmR-NA的表达无明显变化。结论:ALD通过TGF-β1/Smads途径上调肾小球系膜细胞表达CTGF。     

PDGF对大鼠肾小球系膜细胞表达纤维连接蛋白和PAI-1的影响

目的：探讨血小板源性生长因子fPDGF）对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞表达纤维连接蛋白（VN）和纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）的影响。方法：分别以0、5、10ng／rnl的PDGF—BB刺激体外培养的大鼠肾小球系膜细胞12、24、48h．以ELISA法检测培养上清中FN水平，发色底物显色法检测PAI-1的活性；以0、5、10ng／ml的PDGF—BB刺激大鼠系膜细胞24h和10ng／ml PDGF-BB分别作用0、12、24、48h。RT-PCR方法检测系膜细胞PAI-1 mRNA的表达。结果：PDGF-BB在10ng／ml以内随浓度增加可促进大鼠肾小球系膜细胞PAI-1 mRNA和FN表达．在48h内其表达呈时间依赖性。而PAI-1活性在24h时表达最高，以后逐渐下降、结论：PDGF-BB可上调FN和PAI-1及其mRNA表达．提示PDGF可能通过促进细胞外基质合成并抑制其降解而导致肾小球细胞外基质的积聚。     

高糖环境对人肾小球系膜细胞表达结缔组织生长因子及其受体蛋白的影响

目的 探讨高糖环境对体外培养的人肾小球系膜细胞(HMC)表达结缔组织生长因子(CTGF)及其受体--低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)的影响以及相应的信号机制。方法 以体外培养的HMC为研究对象,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ABC ELISA)测定正常糖组(NG组)、高糖组(HG组)和甘露醇组(MG组)培养液中CTGF、人磷酸化细胞外信号调节激酶(pERK)及LPR的浓度变化,分别观察高糖环境对系膜细胞CTGF蛋白表达、丝裂素激活蛋白激酶(MAPKS)信号通路的活化以及CTGF受体LRP表达的影响。结果 HMC本身存在基础水平的CTGF蛋白表达,HG组培养1d后,CTGF蛋白表达升高,峰值出现在第3天,自第4天开始下降;而NG组、MG组的CTGF蛋白表达未随时间发生显著变化;高糖环境下HMC外信号调节激酶(ERK)出现动态活化：1h即开始检测到pERK升高,峰值出现在第8至24小时,于48h内降至基础水平,而NG组、MG组在各时点均未能检测到pERK表达;加入ERK活化特异抑制剂PD98059后发现高糖环境对HMC表达CTGF蛋白增加的影响被抵消;另外,高糖环境未影响LRP的表达。结论 高糖环境下HMC表达CTGF蛋白增加,但未增加CTGF受体LRP的表达,初步明确CTGF的高表达是通过磷酸化激活ERK实现的。     

糖基化终产物对人肾系膜细胞趋化因子RANTES表达的影响

目的 探讨糖基化终产物(AGEs)对人肾系膜细胞(HRMC)趋化因子RANTES表达的影响.方法 常规方法制备糖基化终产物(AGEs-BSA),干预体外培养的HRMC,收集培养上清和细胞,ELISA法检测上清中RANTES浓度,实时定量RT-PCR检测RANTES mRNA表达水平,Western blot检测RANTES蛋白表达,分别设立同浓度的BSA组及空白对照组作为对照.结果 AGEs-BSA干预组HRMC RANTES mRNA和蛋白表达水平及上清中RANTES浓度明显高于对照组,并存在浓度和时间依赖效应.结论 AGEs-BSA上调HRMC RANTES表达和分泌,可能参与糖尿病肾病的发生.     

肾小球系膜细胞与糖尿病肾病

糖尿病肾病是糖尿病常见的并发症之一,也是导致终末期肾病的主要原因。糖尿病肾病的基本病理改变为细胞外基质聚集,基膜增厚,晚期出现弥漫性肾小球硬化,最终导致肾衰竭。在肾小球疾病中,系膜细胞是重要的靶细胞及效应细胞,是糖尿病肾病重要的病理改变。因此,研究肾小球系膜细胞的功能,对糖尿病肾病发病机制及临床诊疗具有重要的意义。     

糖基化终产物对小鼠胚胎成纤维细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的：探讨糖基化终产物（AGEs）对NIH Swiss小鼠胚胎成纤维细胞（NIH/3T3）中结缔组织生长因子（CTGF）基因表达的影响,并观察氨基胍（AG）、葛根素（Pue）对NIH/3T3中CTGF mRNA表达的干预作用。方法：葡萄糖和牛血清白蛋白（BSA）共同孵育制备AGEs,运用荧光法测定AGEs水平。用不同浓度葡萄糖（20、50和80 mmol•L^-1）制备的AGEs培养NIH/3T3细胞24 h;用50 mmol•L^-1葡萄糖制备的AGEs培养NIH/3T3细胞0、6、12、24和48 h。观察AG和不同浓度Pue（0.25、0.5、1.0和1.5g•L^-1）的干预作用。应用RT-PCR检测NIH/3T3中CTGF mRNA的表达。结果：与BSA对照组比较,用20、50和80 mmol•L^-1葡萄糖制备的AGEs培养24 h后,NIH/3T3中CTGF mRNA表达增高（P<0.01）,以50 mmol•L^-1最明显。与0 h比较,同一浓度葡萄糖制备的AGEs培养6、12、24及48 h后,NIH/3T3中CTGF mRNA的表达增高（P<0.01）,以24 h最明显。与50 mmol•L^-1葡萄糖制备的AGEs培养24 h比较,AG和不同浓度的Pue干预后NIH/3T3中CTGF mRNA的表达明显降低（P<0.01）。结论：AGEs能增强NIH/3T3中CTGF基因表达,且与孵育AGEs的葡萄糖浓度和作用时间有关,提示AGEs可能促进糖尿病并发症纤维化的发展,AG和Pue可抑制AGEs促纤维化的病理过程。     

AGEs-BSA 对人肾系膜细胞分泌RANTES的影响初探

目的探讨糖基化终产物(AGEs)对人肾系膜细胞(HRMC)分泌正常T细胞表达的调节活化蛋白(RANTES)的影响.方法常规制备糖基化终产物-牛血清白蛋白(AGEs-BSA),干预体外培养的HRMC,用ELISA法检测培养上清RANTES水平.结果AGEs-BSA(640mg*L-1) 干预HRMC后8h,培养液中RANTES水平开始逐步升高,于48h达峰值,对照组BSA则未见升高(P<0.01).结论AGEs呈时间依赖方式增加HRMC对RANTES的分泌.     

糖基化终产物对视网膜Müller细胞表达碱性成纤维细胞生长因子的影响

目的 探讨糖基化终产物(AGEs)对体外培养兔视网膜Müller细胞表达碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的影响.方法 体外分离并培养兔视网膜Müller细胞.37℃条件下制备牛血清白蛋白AGEs(AGEs-BSA)及其对照物.应用AGEs-BSA及其对照物作用于Müller细胞,采用免疫细胞化学(ICC)方法半定量检测AGEs对视网膜Müller细胞表达bFGF的影响.结果 与对照组相比,AGEs作用下体外培养的兔视网膜Müller细胞bFGF的表达增高(P＜0.05或P＜0.01),且具有一定的时间和浓度依赖性.结论 AGEs可以上调Müller细胞表达bFGF,推测AGEs可能通过增加bFGF的表达从而加速糖尿病视网膜病变(DR)新生血管的形成.     

糖基化终产物对人单核细胞源树突状细胞VCAM-1表达的影响

目的:探讨糖基化终产物 (AGEs))对人单核细胞源树突状细胞(DCs)血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的影响?方法:用免疫磁珠分离人外周血CD14+单核细胞,经含重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF) 100 μg/L和重组人白细胞介素-4(rhIL-4) 20 μg/L的RPMI1640培养,使其分化为DCs,加入糖基化人血清白蛋白(AGE-HSA) 200 μg/ml,采用RT-PCR和Western blot法,观察AGE-HSA对DCs VCAM-1 mRNA和蛋白表达的影响,同时检测培养液上清中IL-12和IL-18的浓度?结果:与空白对照相比,AGE-HSA可上调DCs VCAM-1 mRNA和蛋白的表达(P < 0.05),并且明显促进了DCs IL-12和IL-18的分泌(P < 0.05)?AGE-HSA干预组与空白对照组相比差异无统计学意义(P > 0.05)?结论:AGEs能够上调DCs VCAM-1的表达,并且促进DCs IL-12和IL-18的分泌,这可能是糖尿病通过DCs促进动脉粥样硬化发生的重要机制之一?     

人肝脏星状细胞糖基化终产物受体表达的研究

目的　研究人肝脏星状细胞（ ＨＳＣ） 上糖基化终产物受体（ＲＡＧＥ） 的表达。方法　用生物素将体外制备的糖基化终产物（ ＡＧＥｓ － ＢＳＡ） 标记成配基,以细胞化学法显示细胞表面受体高亲和性结合。用反转录聚合酶链反应（ ＲＴ－ＰＣＲ） 检测ＡＧＥｓ 受体基因的表达。结果　细胞化学法显示ＡＧＥｓ － ＢＳＡ 与ＨＳＣ 呈高亲和性结合,部分被内化。用按人ＲＡＧＥ 基因序列设计的引物,反转录扩增出２８３ ｂｐ ＤＮＡ 片段。结论　人肝脏星状细胞表达的ＡＧＥｓ 受体可能在糖尿病人加速的肝纤维化过程中起一定作用