人tau融合蛋白的原核表达及纯化

目的构建人His-tau和GST-tau融合蛋白表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达及纯化。方法以质粒pEGFP-tau为模板通过PCR扩增出人tau全长cDNA,并构建到原核表达载体pET28a和pGEX-5X-1中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21中,然后用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE染色及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。分别使用His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B与融合蛋白结合来纯化融合蛋白。结果成功构建原核表达质粒pET28a-tau和pGEX-5X-1-tau并在大肠杆菌BL21中诱导其大量表达。经His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B纯化后,可以得到较纯化的His-tau和GST-tau融合蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异性的抗tau单克隆抗体(tau-5)所识别的融合蛋白分子量与理论值相近。结论构建了人tau两种原核表达的融合蛋白质粒,并高效表达和纯化了该蛋白,为进一步的tau与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。     

冈田酸诱导SH-SY5Y细胞tau蛋白的过度磷酸化

目的 观察冈田酸（0A）对SH—SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响。方法 MTT比色法观察OA对SH—SY5Y细胞代谢率的影响，免疫细胞化学法和蛋白免疫印迹法观察OA对SH—SY5Y细胞磷酸化tau蛋白水平的影响。结果 40nmol／LOA孵育SH—SY5Y细胞24h可显著降低细胞代谢率，其效应随着OA浓度的增加和孵育时间的延长而增强。OA作用于细胞3～48h，蛋白免疫印迹显示Ser-396位点磷酸化tau蛋白水平逐步升高，24h达高峰，之后下降。免疫细胞化学法显示，OA作用于细胞24h，Ser-396位点磷酸化tau蛋白水平较对照组细胞增强。结论 OA增强SH—SY5Y细胞tau蛋白Ser-396位点磷酸化水平。     

冈田酸诱导SH-SY5Y细胞后tau蛋白磷酸化与PTEN蛋白水平的变化

目的 研究冈田酸（OA）诱导SH—SY5Y细胞后tau蛋白磷酸化程度和PTEN蛋白水平的变化。方法 40nmol／LOA孵育SH—SY5Y细胞不同时间（0，3，6，12，18，24，36，48h）后，倒置显微镜观察细胞的形态变化，免疫印迹检测各时间点tau蛋白ser^396。位点的磷酸化及PTEN蛋白水平的变化。结果 SH-SY5Y细胞随OA孵育时间的延长逐渐出现细胞胞体变圆，突起回缩，悬浮生长至死亡。细胞tau蛋白ser^396位点磷酸化水平于OA作用3h开始升高，18h达高峰，随后逐渐下降，48h低于基础水平；而PTEN蛋白水平于OA作用3h开始升高，6h达高峰，之后逐渐下降，18h开始低于基础水平。结论 OA诱导SH—SY5Y细胞后tau蛋白磷酸化水平和PTEN蛋白水平均呈先上升后降低的变化趋势。     

电磁辐射对原代培养的皮层神经元中tau蛋白磷酸化的影响

目的研究电磁辐射对原代培养皮层神经元tau蛋白磷酸化的影响。方法原代培养大鼠皮层神经元分为假辐照组和辐照组,辐照组采用平均功率密度为90 mW/cm2的电磁波辐照10 min,分别于辐照后0、1、3、6、12 h取材。采用CCK-8检测电磁辐射辐照后神经元活性,Western blot检测tau蛋白磷酸化位点ser199/202、ser396、ser404磷酸化变化,同时观察细胞周期素依赖性蛋白激酶5(cyclin dependent kinase 5,CDK5)抑制剂Roscovitine、糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)抑制剂氯化锂(LiCl)和钙激活蛋白酶(calpain)抑制剂PD150606对电磁辐射暴露后tau蛋白磷酸化水平的影响。结果电磁辐射辐照后6 h和12 h,原代培养大鼠皮层神经元细胞活性明显降低[与假辐照组比较,分别下降19%(P<0.05)和30%(P<0.01)]。电磁辐射辐照后1 h和3 h,原代培养大鼠皮层神经元tau蛋白ser404位点磷酸化程度一过性增强[与假辐照组比较,分别升高89%(P<0.01)和46%(P<0.05)],而ser199/202、ser396位点磷酸化程度变化不明显(P>0.05)。Roscovitine、LiCl和PD150606对电磁辐射引起的tau蛋白ser404位点过度磷酸化有显著抑制作用(P<0.01)。结论电磁辐射可引起原代培养的皮层神经元tau蛋白ser404位点过度磷酸化,CDK5、GSK-3β和calpain参与其中。     

冈田酸诱导SH-SY5Y细胞后tau蛋白磷酸化与PTEN蛋白水平的变化

目的 研究冈田酸(OA)诱导SH-SY5Y细胞后tau蛋白磷酸化程度和PTEN蛋白水平的变化.方法 40nmol/L OA孵育SH-SY5Y细胞不同时间(0,3,6,12,18,24,36,48h)后,倒置显微镜观察细胞的形态变化,免疫印迹检测各时间点tau蛋白ser396位点的磷酸化及PTEN蛋白水平的变化.结果 SH-SY5Y细胞随OA孵育时间的延长逐渐出现细胞胞体变圆,突起回缩,悬浮生长至死亡.细胞tau蛋白ser396位点磷酸化水平于OA作用3h开始升高,18h达高峰,随后逐渐下降,48h低于基础水平;而PTEN蛋白水平于OA作用3h开始升高,6h达高峰,之后逐渐下降,18h开始低于基础水平.结论 OA诱导SH-SY5Y细胞后tau蛋白磷酸化水平和PTEN蛋白水平均呈先上升后降低的变化趋势.     

外源性脑源性神经营养因子通过抑制tau蛋白磷酸化减少细胞凋亡

目的 观察外源性脑源性神经营养因子(BDNF)对tau蛋白过磷酸化及神经元凋亡的影响,探讨其可能的作用机制.方法 将培养的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)分为正常对照组；冈田酸(OA)组:浓度为40 nmo/L的OA处理24 h；BDNF组:OA处理24 h后加入浓度为50 ng/mL的BDNF处理15 min;LY294002组:OA处理24 h后加入BDNF(50 ng/mL)及LY294002(40 nmol/L)共同处理15 min；K252a组:OA处理24 h后加入BDNF(50 ng/mL)及K252a (40 nmol/L)共同处理15 min.通过MTT检测细胞存活率、流式细胞仪检测细胞凋亡率、Western blot检测Ser199/202、pSer199/202及bcl-2表达.结果 MTT 实验显示OA组、LY294002组及K252a组细胞存活率较正常对照组及BDNF组明显减低(P＜0.01)；BDNF组与正常对照组无明显差异(P＞0.05).流式细胞仪检测显示OA组、LY294002组及K252a组细胞凋亡率较正常对照组及BDNF组明显增加(P＜0.01)；BDNF组与正常对照组之间无统计学差异(P＞0.05).Western blot显示OA组、LY294002组及K252a组pSer199/202表达较正常对照组及BDNF组明显增多(P＜0.01),Ser199/202及bcl-2表达较对照组及BDNF组明显减少(P＜0.01),BDNF组与正常对照组比较无统计学差异(P＞0.05).结论 外源性BDNF可通过抑制tau蛋白磷酸化减少细胞凋亡.     

褪黑素对冈田酸致NG108-15细胞tau蛋白过度磷酸化的影响

目的 观察褪黑素（MLT）对冈田酸（OA）致大鼠神经母细胞和小鼠胶质细胞瘤细胞的杂交细胞系NG108—15细胞tau蛋白过度磷酸化的影响。方法 10nmol／LOA作用于NG108—15细胞0，3，6，12及24h，免疫细胞化学法和免疫印迹法（Western blot法）观察Ser-396位点磷酸化tau蛋白，观察MLT对细胞内Ser-396位点磷酸化tau蛋白的影响。结果 在OA作用后3h增高，6h达到峰值，之后逐渐降低。选取OA作用6h，低、高剂量MLT较模型组Ser-396位点磷酸化tau蛋白水平明显降低。结论MLT 可对抗tau蛋白过度磷酸化，可能是其发挥抗阿尔茨海默病作用的机制之一。     

微管相关蛋白tau转基因细胞和动物模型的建立及tau蛋白病变表征

目的 构建并表征tau及突变tau蛋白细胞和动物模型,检测模型tau蛋白及磷酸化tau蛋白表达情况及微管的形态,为tau蛋白及相关疾病的研究提供疾病模型。方法 将不同的质粒分别转染到HEK293细胞中,构建过表达野生型tau以及P301L/P301S突变tau的细胞模型。引进并繁育rTg4510小鼠（P301L突变tau转基因小鼠）以及PS19小鼠（P301S突变tau转基因小鼠）。通过Western blotting法检测总tau及磷酸化tau蛋白的表达,应用免疫组织化学的方法检测转基因小鼠脑内磷酸化tau蛋白的表达情况,应用免疫荧光的方法检测HEK293细胞微管形态的变化。结果 本研究成功构建过表达tau蛋白的细胞模型,繁育了两种tau转基因小鼠,在这些模型中tau蛋白表达及tau蛋白的磷酸化水平显著高于对照组。在不同突变类型的细胞和动物模型中,tau蛋白不同位点的磷酸化水平变化以及微管形态变化略有差异。结论 本研究成功构建了P301L/P301S突变tau蛋白的细胞和动物模型,这些模型均表现了显著的tau蛋白过度磷酸化的病变,并引起了细胞微管形态或tau蛋白病理的变化,进而为包括AD在内的tau蛋白病变提供了实验模型。     

人PTP1B真核载体在COS-7细胞中的表达及其体外抑制剂实验

目的构建人蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B并在猴肾成纤维细胞COS-7中稳定表达,分离纯化表达的重组融合蛋白,进行酶活性测定及抑制剂的初步实验。方法应用RT-PCR从2型糖尿病患者的外周血总RNA中扩增出PTP1BcDNA全长序列,并在基因上下游分别引入BamHⅠ、EcoRⅠ两个酶切位点,酶切后定向导入pcDNA3.1/Hismyc-B多克隆位点,构建真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B,转染COS-7细胞,G-418筛选2周后取细胞裂解上清液经Ni2＋亲和层析柱纯化后,测定了其酶活性及小分子抑制剂钒酸钠的IC50。结果从2型糖尿病患者外周血中扩增得到1301bpPTP1BcDNA全长序列,经双酶切鉴定及测序分析,表明hPTP1B已克隆到pcD-NA3.1/Hismyc-B中。RT-PCR和免疫印迹表明转染成功。酶活性实验初步显示rhPTP1B的活性随酶浓度增加而增加,随PTP1B的特异性抑制剂钒酸钠的浓度增加而减少。结论获得具有酶活性的融合蛋白rhPTP1B,为进一步筛选其特异性抑制剂奠定基础。     

重组人tau蛋白对神经细胞的毒性作用

目的 观察重组人tau蛋白对神经来源的细胞株SHSY5Y及体外原代培养的神经元是否有毒性作用.方法 将原核表达纯化的重组人tau蛋白加入SH-SY5Y细胞和原代培养的大鼠神经元培养液中,通过观察细胞形态、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞增殖活性、TUNEL染色检测细胞凋亡、免疫荧光染色观察凋亡诱导蛋白CHOP及内质网应激上调蛋白ARMET的表达情况研究tau蛋白对神经细胞生长、增殖和凋亡的影响.结果 随着tau蛋白作用时间的延长,细胞胞体逐渐变圆,突起减少甚至消失,染色质聚集,部分神经元出现了凋亡.MTT检测结果显示tau蛋白可抑制细胞的增殖.同时发现,细胞外的tau作用可诱导内质网应激标志性蛋白CHOP和ARMET的表达.结论 重组人tau蛋白对神经细胞有毒性作用,该作用可能部分与tau诱导的内质网应激有关.     

瘦素降低全反式维甲酸诱导的SH-SY5Y细胞tau蛋白过度磷酸化

目的探讨瘦素（leptin）与阿尔茨海默病发生发展过程的联系。方法全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）诱导人神经纤维母细胞瘤细胞系SH-SY5Y产生过度磷酸化tau蛋白,模型成功后给予外源性leptin处理,检测磷酸化tau蛋白表达水平。结果模型诱导成功后,PCR检测leptin长型受体ObRb表达上升（P〈0.01）;给予leptin后,Western Blot显示磷酸化tau蛋白表达显著降低（P〈0.01）,细胞形态也随之改变。结论 leptin能够在体外降低阿尔茨海默病相关的过度磷酸化tau蛋白。     

脑低灌注触发脑内tau过度磷酸化和胆碱能神经损害

目的 探讨脑低灌注对脑内tau蛋白的过度磷酸化和胆碱能指标变化的影响.方法 40只SD大鼠随机分为低灌注组和假手术组,永久性阻断双侧颈总动脉制作脑低灌注模型;应用Y迷宫检测大鼠学习记忆能力,用免疫组化法检测大脑皮质和海马组织色氨酸404位点tau蛋白过度磷酸化(Pser404-Tau)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)的表达,用考马斯亮蓝法检测海马组织乙酰胆碱酯酶(AChE)活性.结果 脑低灌注术后14 d和21 d,大鼠学习记忆能力明显减退,与假手术组相比差异有统计学意义(P＜0.01);大脑皮质和海马组织Pser404-Tau阳性细胞数较假手术组明显增加(P＜0.01);大脑皮质和海马组织ChAT阳性细胞计数较假手术组明显减少(P＜0.01);海马组织AChE活性较假手术组明显降低(P＜0.01).结论 脑低灌注后出现认知功能障碍,可能与脑缺血导致脑内tau蛋白过度磷酸化、损害胆碱能神经功能有关.     

GFP-ATZ在HEK 293T中的表达及其细胞毒作用

目的 构建具有绿色荧光蛋白(GFP)标签的α1抗胰蛋白酶Z突变型(ATZ)的真核表达载体,在人胚胎肾细胞(HEK 293T)中验证表达情况及检测其对细胞的影响.方法以pcDNA3.1-zeo+-ATZ质粒为模版,设计引物,PCR扩增出ATZ的cDNA序列,插入真核表达载体 pEGFP-C1中,构建带有GFP标签的ATZ真核表达载体pEGFP-C1-ATZ,脂质体转染体外培养的HEK 293T细胞,Western blot、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜检测GFP-ATZ在细胞中的表达、分布情况及其对细胞形态和分裂的影响.结果 ATZ片段成功插入pEGFP-C1表达质粒,在表达GFP的HEK 293T细胞内,绿色荧光呈弥散的全细胞分布,而表达GFP-ATZ的细胞绿色荧光分布于细胞质内;Western blot结果显示特异性条带,分子量大小与GFP-ATZ预期相符;GFP-ATZ的过度表达引起细胞出现不同程度的形态改变、分裂障碍、聚集体出现甚至死亡.结论 成功构建了具有绿色荧光标记的ATZ真核表达载体,GFP-ATZ的表达具有细胞毒性.     

糖尿病大鼠脑皮质tau过度磷酸化的机制及氯化锂的作用

目的研究糖尿病大鼠并发阿尔茨海默病的可能机制以及氯化锂(LiCl)的作用。方法用链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型,用32P放射性标记法检测对照组、糖尿病(DM)组、DM NaCl组和DM LiCl组的糖原合酶激酶-3(GSK-3)的活性,用蛋白印迹法检测tau蛋白磷酸化水平,用电跳台试验检测大鼠的保留记忆。结果DM组与对照组相比,GSK-3活性明显增加,tau蛋白磷酸化程度明显升高,且伴有记忆障碍(P<0·05)。与DM组相比较,DM LiCl组GSK-3活性和tau蛋白过度磷酸化程度均降低(P<0·05,P<0·01),记忆障碍改善(P<0·05)。结论糖尿病大鼠脑皮层GSK-3活性升高,LiCl通过抑制GSK-3活性,降低tau蛋白过度磷酸化,改善糖尿病大鼠的记忆障碍。     

肝刺激因子稳定转染人肝癌细胞系的方法建立与表达鉴定

目的 建立稳定表达肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)的BEL-7402肝癌细胞系,并对其生物学特性进行鉴定。方法 采用脂质体法将鉴定后的Flag-HSS-pcDNA3.0质粒转染到肝癌细胞系BEL-7402中,进行G418筛选,获得稳定转染的人肝癌细胞系。通过real-time PCR、 Western blotting和免疫荧光染色等方法鉴定HSS mRNA和蛋白质表达及亚细胞定位。结果 免疫荧光染色实验证实HSS基因能在稳定转染的肝癌细胞系中表达,并定位于线粒体中。同时发现在稳定转染细胞中HSS mRNA和蛋白质的表达也均高于野生型BEL-7402细胞。结论 目前已成功构建稳定转染HSS的BEL-7402肝癌细胞系。为深入研究HSS的生理功能提供实验工具和研究基础。     

Inhibition of tau hyperphosphorylation and beta amyloid production in rat brain by oral administration of atorvastatin

Background Alzheimer＇s disease （AD） is a neurodegenerative disorder and the leading cause of dementia in the elderly. The two hallmark lesions in AD brain are deposition of amyloid plaques and neurofibrillary tangles （NFTs）. Hypercholesteremia is one of the risk factors of AD. But its role in the pathogenesis of AD is largely unknown. The aim of this study was to investigate the relationship between hypercholesteremia and tau phosphorylation or β-amyloid （Aβ）, and evaluate the effect of atorvastatin on the level of tau phosphorylation and Aβ in the brains of rats fed with high cholesterol diet. Methods Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into normal diet control group, high cholesterol diet group, and high cholesterol diet plus atorvastatin （Lipitor, 15 mg.kg^-1 .d^-1） treated group. Blood from caudal vein was collected to measure total cholesterol （TC）, triglyceride （TG）, low density lipoprotein （LDL） and high-density lipoprotein （HDL） at the end of the 3th and the 6th months by an enzymatic method. The animals were sacrificed 6 months later and brains were removed. All left brain hemispheres were fixed for immunohistochemistry. Hippocampus and cerebral cortex were separated from right hemispheres and homogenized separately. Tau phosphorylation and Aβ in the brain tissue were determined by Western blotting （using antibodies PHF-1 and Tau-1） and anti-Aβ40/anti-Aβ42, respectively. Results We found that high cholesterol diet led to hypercholesteremia of rats as well as hyperphosphorylation of tau and increased Aβ level in the brains. Treatment of the high cholesterol diet fed rats with atorvastatin prevented the changes of both tau phosphorylation and Aβ level induced by high cholesterol diet. Conclusions Hypercholesteremia could induce tau hyperphosphorylation and Aβ production in rat brain. Atorvastatin could inhibit tau hyperphosphorylation and decrease Aβ generation. It may play a protective role in the patho-process of hypercholesteremia-induced neurodegeneration in the brain.     

神经生长因子对局灶性脑缺血再灌注大鼠顶叶皮质tau蛋白磷酸化的影响

目的探讨外源性神经生长因子(NGF)对局灶性脑缺血再灌注大鼠顶叶皮质神经元tau蛋白过度磷酸化的影响。方法用线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型,应用免疫组织化学SABC法、Western Blotting和图像分析方法检测大鼠缺血侧顶叶皮质tau蛋白在Ser199/202位点磷酸化程度和总tau蛋白表达。结果缺血再灌注组顶叶皮质tau蛋白在Ser199/202位点磷酸化水平和总tau蛋白表达比假手术组显著升高(P<0.05);NGF组大鼠顶叶皮质tau蛋白在Ser199/202位点磷酸化水平显著低于缺血再灌注组和高于假手术组,NGF组总tau表达也下降但仍高于假手术组(P<0.05)。结论NGF明显减轻局灶性脑缺血再灌注大鼠顶叶皮质tau蛋白磷酸化程度,NGF可能通过降低tau蛋白磷酸化水平对缺血神经元起保护作用。     

HEK293T细胞扩增重组腺病毒研究

目的探讨HEK293T细胞扩增重组腺病毒的可行性。方法重组腺病毒保存液稀释后感染HEK293T细胞,观察细胞病变效应,半数组织培养感染量测定扩增病毒的滴度,通过体外感染心肌细胞,成纤维细胞验证其感染活性。结果HEK293T细胞可以扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒,病毒滴度为5×10^6PFU/mL,扩增后的腺病毒可以感染体外培养的心肌细胞和成纤维细胞。结论HEK293T细胞可有效扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒。     

稳定高效表达正反义Alu-Sx细胞系的建立

目的建立稳定高效表达正反义Alu-Sx的细胞系.方法根据Alu亚家族Sx序列合成两对两端带有限制性酶切位点的引物,提取HEK293细胞的总DNA后PCR扩增,产物连接到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A中构建成重组体.经酶切及测序鉴定后,阳离子脂质体转染法转染HEK293细胞后G418筛选稳定表达的细胞克隆,Northern杂交检测并挑选出表达最强的亚克隆.结果成功构建Alu亚家族Sx的正反义真核表达载体并获得高效稳定表达的HEK293细胞亚克隆.结论高效稳定表达正反义Alu Sx的HEK293细胞亚克隆可用于下一步研究.