大鼠腰椎终板软骨细胞的培养及其生物学性状的研究

目的通过对大鼠腰椎终板软骨细胞的培养，观察细胞的生物学性状，探讨终板软骨细胞的生物学行为厦影响因素。方法取犬鼠腰椎终板软骨细胞，在加10％灭活胎牛血清的F12-DMEM培养液中培养，建立体外终板软骨细胞培养模型。采取绘制细胞生长曲线、HE、甲苯胺蓝染色厦免疫组织化学染色等方法，对细胞形态、活力、生长情况厦软骨细胞的表型进行鉴定。结果终板软骨细胞可以在体外培养，但细胞活力随着培养时间的延长厦传代逐渐降低；终板软骨细胞的生长情况厦细胞表型类似于关节软骨，有Ⅱ型胶原和aggrecan的表达。结论体外成功培齐了大鼠腰椎终板软骨细胞，为进一步研究终板软骨在椎间盘退变中的作用打下了基础。     

Sox9基因在终板软骨细胞退变模型中的表达变化及意义

目的 建立大鼠腰椎终板软骨细胞体外自然退变模型,并探讨Sox9基因在终板软骨细胞自然退变中的变化及作用.方法 取大鼠腰椎终板软骨细胞,酶消化及自然传代法分离培养大鼠终板软骨细胞,建立体外终板软骨细胞培养模型.采取绘制细胞生长曲线、HE、甲苯胺蓝染色及免疫组织化学染色等方法,对该模型进行鉴定.RT-PCR检测各代细胞中Sox9、Ⅱ型胶原mRNA的表达变化.结果 大鼠终板软骨细胞表达特征性Ⅱ型胶原,其生长情况及细胞表型类似于关节软骨,细胞传至4、5代后表现出细胞形态呈梭形、细胞增殖速度减慢等退变的特征.与原代相比,Sex9基因mRNA在4、5代终板软骨细胞的表达明显下降(P<0.05),受其调控的Ⅱ型胶原mRNA的表达也相应降低,两者表达变化呈正相关(r=0.912,P<0.05).结论 终板软骨细胞自然退变模型成功建立,为椎间盘退变机制研究提供了较好的细胞学基础.Sox9基因与终板软骨细胞自然退变存在明显关联,Sox9基因的表达下降可抑制软骨终板细胞的增殖及基质合成,从而促进或诱发椎间盘的退变.     

大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型的建立

目的：建立大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型，为椎间盘退变的机制研究提供载体。方法：酶消化及自然传代法分离培养大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞，观察其形态学变化。采用MTT法测定第Ⅲ代软骨细胞的生长曲线。采用免疫细胞化学法检测其特征性Ⅱ型胶原的表达情况，对该模型进行鉴定。结果：大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞表达特征性Ⅱ型胶原。第Ⅲ代细胞培养在生长第13天后，细胞分裂能力明显下降，核仁不清，细胞变形明显，以梭形为主，折、旋光性弱，细胞间隙变大，轮廓增强，胞浆内可见空泡、脂滴；Ⅱ型胶原合成明显下降，细胞增殖率显著降低；呈现自然退变过程。结论：建立椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型，为椎间盘退变机制研究提供较好的细胞学基础。     

IL-6对体外培养的兔软骨终板细胞生物学行为的影响

目的 探讨IL-6对体外培养的兔软骨终板细胞生物学行为的影响.方法 分离培养兔软骨终板细胞,通过甲苯胺兰染色等方法鉴定后,分别加入不同浓度的IL-6,MTT法测定不同时间点软骨终板细胞增殖活性的变化;流式细胞仪检测软骨终板细胞生长周期的变化;RT-PCR检测蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA的表达变化.结果 10、50、100 ng/ml IL-6对软骨终板细胞的增殖无影响,50 ng/ml IL-6对软骨终板细胞细胞周期无影响,10、50 ng/ml IL-6均对Aggrecan mRNA的表达无影响,仅50 ng/ml浓度时IL-6可降低Collagen Ⅱa mRNA的表达.结论 较大剂量IL-6时可抑制软骨终板基质合成,从而促进椎间盘的退变.     

椎体终板软骨细胞凋亡与椎间盘退变的相关性研究

目的 探讨椎体软骨终板内软骨细胞凋亡和椎间盘退变之间的关系.方法 40只成年新西兰白兔,随机平均分为实验组和对照组.实验组采用阻断椎体软骨终板营养途径的方法制作椎间盘退变模型,对照组不做任何处理.术后4周和8周,每组各处死10只动物,切取软骨终板和相应的椎间盘组织.TUNEL法检测终板软骨细胞的凋亡数,免疫组织化学方法检测椎间盘内Ⅱ型胶原阳性细胞数,并对两组数据进行相关性分析.结果 实验组软骨终板内凋亡的软骨细胞在4周、8周时分别为9.9±O.88个/视野和12.4±0.71个/视野,较对照组明显增加,4周、8周组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).相关分析显示,术后4周和8周终板软骨细胞凋亡与Ⅱ型胶原表达之间有高度的相关性,相关系数分别为0.86和0.82(均P＜0.05),表明椎体终板软骨细胞凋亡与椎间盘退变之间存在有高度的相关性.结论 阻断椎体软骨终板营养途径可导致椎间盘退变的发生,椎体终板软骨细胞凋亡增加可导致椎问盘内Ⅱ型胶原表达进一步减少.     

人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型的建立及其意义

目的 建立人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型,观察人正常颈椎椎体和退变颈椎椎体终板软骨细胞的形态及表征.方法 选择2010年7月至2011年7月49例颈椎骨折、脱位(19例)及颈椎病(30例)患者术中取出的颈椎终板软骨,用酶消化法分别分离培养人正常颈椎椎体终板软骨细胞(对照组)和退变颈椎椎体终板软骨细胞(颈椎病组);用倒置显微镜和HE染色法观察细胞形态学变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线;甲苯蓝染色及反转录-PCR(RT-PCR)法对终板软骨细胞进行鉴定;RT-PCR法检测终板软骨细胞特征性基因蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Ⅰ型胶原的表达.结果 人颈椎椎体终板软骨细胞表达特征性蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Ⅰ型胶原,其生长情况及细胞表型类似于关节软骨细胞.对照组原代终板软骨细胞以多角形为主,增殖速度较快;而颈椎病组原代终板软骨细胞以梭形为主,细胞增殖速度较慢.颈椎病组原代终板软骨细胞表达的蛋白多糖基因(0.695 ±0.052)和Ⅱ型胶原基因(0.726 ±0.035)均低于对照组(0.950±0.032、0.907±0.078,t=7.263、3.681,P=0.002、0.021),Ⅰ型胶原基因则高于对照组(0.795±0.028比0.552±0.070,t=-5.560,P=0.005).结论 成功建立了人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型,为椎间盘退变机制研究提供了较好的细胞学基础,解决了以前一直以动物细胞模型为研究对象的局限性.     

胶原-纤维蛋白混合凝胶对关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原的影响

目的：以胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行关节软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,研究载体对软骨细胞在其中的表达及合成Ⅱ型胶原的影响。方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,制成软骨培养物并在体外培养。培养第3周时,取材进行Masson染色、Ⅱ型胶原寡核苷酸探针原位杂交和Ⅱ型胶原的免疫组化观察。 结果：体外培养3周,培养物内细胞大部分存活, Masson染色形成软骨陷窝,同源性细胞簇出现,细胞周围有蓝色物质环绕存在,原位杂交证实其软骨细胞表达Ⅱ型胶原mRNA,免疫组化证实软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。 结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可促进关节软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原是软骨组织最主要的细胞外基质成分。     

骨关节炎患者软骨细胞的体外培养技术

目的 探索骨关节炎患者软骨细胞的分离和培养技术.方法 用关节镜采集10位骨关节炎患者膝关节非负重部位退变部分软骨组织.以0.2%Ⅱ型胶原酶及0.25%胰蛋白酶联合消化分离关节软骨细胞,体外培养观察骨关节炎患者软骨细胞形态、生长以及增值情况.结果 Ⅱ型胶原酶胰蛋白酶联合消化软骨可成功分离软骨细胞,骨关节炎患者软骨细胞增殖缓慢,Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝异染反应均较弱.结论 Ⅱ型胶原酶胰蛋白酶联合消化分离骨关节炎患者软骨细胞的技术简单且易操作,分离培养的软骨细胞符合骨关节炎患者软骨退变的表现,可为骨关节炎的体外诊疗研究提供实验基础.     

腰椎软骨终板细胞凋亡与椎间盘退变的关系

目的:建立脊柱退变的动物模型,确定脊柱软骨终板细胞凋亡在脊柱退变过程中的意义。方法:选取健康大白鼠24只,随机分为实验组和对照组。建立模型后,在不同时间段对腰椎标本行矢状位切片,分离软骨终板和椎间盘。计数椎间盘软骨终板细胞凋亡数量,评估软骨终板消失状况。结果:腰椎间盘退变的组织学表现,HE染色观察腰椎间盘细胞凋亡状况,TUNEL染色比较对照组和实验组在18周均有明显差别。结论:脊柱退变模型显著增加了软骨终板细胞凋亡数量,腰椎间盘退变过程加速,所以软骨终板细胞凋亡是椎间盘发生退行性变的重要原因。     

乳兔关节软骨细胞的分离、培养及生物学特性的观察

目的：建立乳兔软骨细胞分离及培养的方法,观察软骨细胞在体外培养中的生物学特性.方法：采用两步消化法,将乳兔关节软骨进行分离、培养.采用苏木精伊红染色和甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定,用MTT法绘制生长曲线、并在倒置显微镜观察各代软骨细胞形态、通过免疫组化染色、逆转录聚合酶反应（RT PCR）法观察其生物学特性.结果：通过两步酶消化法,成功分离出乳兔关节软骨细胞,培养24 h后细胞贴壁呈短梭形.培养2周左右软骨细胞聚集似“铺路石”样.MTT法显示细胞生长曲线近似“S”形.甲苯胺蓝呈阳性结果,并随代数增加阳性结果呈减弱趋势.通过免疫组化染色和RT PCR显示随代数增加软骨细胞Ⅰ型胶原表达增强,Ⅱ型胶原表达减弱.结论：本研究采用两步酶消化法,成功从乳兔软骨内获取大量活性好、纯度高的软骨细胞,3代以内软骨细胞生长良好,并保持其生物学特性,适于软骨组织工程的应用.3代以后开始出现去分化现象.     

软骨终板细胞凋亡与颈椎间盘退变关系的研究

目的：探讨脊柱软骨终板细胞凋亡与颈椎间盘退变之间的关系。方法：24只清洁型wista大鼠,随机分为实验组和对照组。实验组沿C1-C7棘突做正中切口,剥离椎旁肌,切除C1-C7的棘上、棘间韧带及两侧关节突关节后外1/2,诱发加速脊柱退变;对照组仅切开皮肤后缝合。分别于第9周、18周、36周对两组动物施行过度麻醉处死,完整取下包含上下椎体的椎间盘。对颈椎标本行矢状位切片,分离软骨终板和椎间盘。颈椎间盘按Thompson椎间盘退变病理分级标准进行分级评定;将软骨终板石蜡包埋,切片。HE染色和Tunnel染色后,计数椎间盘软骨终板凋亡数量,评估软骨终板消失状况。结果：两组软骨终板细胞凋亡随时间进展而加速。与对照组相比,18周实验组软骨终板细胞凋亡率明显增高（P〈0.05）;在9周和27周时,实验组与对照组软骨终板细胞凋亡率无统计学差异。结论：脊柱退变模型显著增加了软骨终板细胞凋亡数量,加速了脊柱退变;随年龄增加,软骨终板凋亡细胞数量逐渐增加,软骨终板破坏程度增加,颈椎间盘退变过程加速;年龄是颈椎间盘退变的重要因素;软骨终板细胞凋亡是椎间盘发生退行性变的重要原因。     

MRI对骨质疏松性椎体压缩骨折患者椎体终板和骨折椎体邻近间盘损伤的评估及其临床意义

目的：探讨通过MRI评价急性或亚急性骨质疏松性椎体压缩骨折（OVCF）患者椎体终板损伤和骨折椎体邻近间盘损伤的关系,为OVCF的诊断提供依据。 方法：选择行椎体成型术的66例（76个骨折椎体）老年OVCF患者临床资料,通过MRI评估患者骨折椎体终板和骨折椎体邻近间盘的损伤情况。 结果：76个骨折椎体中57个椎体有终板损伤（75％）。57个有终板损伤的骨折椎体中27个椎体只有上终板损伤（47％）,22个椎体同时有上下终板损伤（39％
）,8个椎体只有下终板损伤（14％）。76个骨折椎体中48个椎体有邻近间盘损伤（63％）。48个有邻近间盘损伤的骨折椎体中22个间盘损伤位于骨折椎体上方（45％）,19个骨折椎体同时有上下间盘损伤（40％）,7个间盘损伤位于骨折椎体下方（15％）。结论:骨折椎体终板损伤与邻近椎间盘损伤有密切关联,提示临床诊断和治疗中应重视骨折椎体的终板损伤及邻近间盘损伤。     

TRAIL在正常椎间盘细胞中的分布及表达

目的了解肿瘤坏死因子超家族成员TRAIL在正常椎间盘不同部位中的表达及TRAIL/DR4诱导的细胞凋亡情况。方法将31个包括髓核、纤维环及软骨终板的正常椎间盘组织制成石蜡标本后切片,免疫组化方法检测TRAIL的表达,计算阳性细胞所占的百分比。结果在髓核、纤维环及软骨终板中存在TRAIL的表达,其中髓核中TRAIL表达高于纤维环及软骨终板,纤维环中表达最低,差异有显著性（F=23.51,q=3.190-9.526,P〈0.05）。结论TRAIL在正常椎间盘组织的不同部位存在着区域性分布,在正常椎间盘组织中可能存在着由TRAIL/DR4诱导的第3种凋亡途径。     

大鼠椎间盘终板软骨细胞自然退变中焦磷酸环路关键酶蛋白的表达及意义

目的 观察大鼠终板软骨细胞体外自然退变过程中焦磷酸环路关键酶(ENPP1、TNAP、ANK蛋白)表达的变化.方法 采用连续酶消化及自然传代法,选取原代至第四代终板软骨细胞,用免疫印迹方法分析各代终板软骨细胞中ENPP1、TNAP、ANK蛋白的表达.结果 ENPP1、TNAP、ANK蛋白在各代终板软骨细胞中均有表达;随着细胞的传代,蛋白表达量逐渐减少,第三、四代的表达微弱,ENPP1、TNAP、ANK蛋白在第三、四代的光密度值和内参Actin表达条带光密度值相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 该实验提示我们对终板细胞自然退变过程中焦磷酸环路关键蛋白进行研究时,选取第三代细胞以前的意义较大;从分子水平对软骨终板退变的发生机制进行研究,通过调控软骨终板中上述蛋白的表达,可能有助于遏制椎间盘退变的发生,为防治椎间盘退变确立新的有效靶点.

Abstract：

Objective To study the expression of the pyrophosphoric acid loop's key enzymes (ENPP1, TNAP and ANK proteins) in the degeneration of rat endplate chondrocyte. Methods The method of enzyme digestion plus natural subculture was employed. And the primary to forth-generation cells were collected. Western blot was used to analyze the expression of ENPP1, TNAP and ANK proteins in each generation of endplate chondrocytes. Results The expression of ENPP1, TNAP and ANK proteins could be detected in each generation of endplate chondrocytes. With the continuing passage of cells, the level of protein expression declined gradually and that of the third and forth-generation decreased. Conclusion While studying the correlation between the degeneration of rat endplate chondrocytes and pyrophosphoric acid loop,it is more significant to choose the cells before the third generation. Meanwhile it is possible to lower the incidence of intervertebral discs degeneration by controlling the expression of the above-mentioned proteins in endplate cartilage.     

颈椎软骨终板Ank表达的变化

目的 观察ANK/ANKH(ANK/ANKH)在正常颈椎软骨终板和退变软骨终板中的表达变化,探讨软骨终板中ANK/ANKH的表达与椎间盘退变的相关性.方法 选择2007年11月至2009年2月45例颈椎骨折、脱位及颈椎病患者术中取出的颈椎软骨终板,其中实验组28例,男17例,女11例;对照组17例,男10例,女7例.对照组术前MRI检查软骨终板均为Miller分级0级,术后病理证实椎间盘无明显退变或Thompson椎间盘退变病理分级1级;实验组Miller分级1～3级,Thompson病理分级3～5级.VON KOSSA染色观察标本的钙化情况,免疫组织化学SABC染色法、逆行聚合酶链反应和免疫印迹方法检测ANK的表达.结果 VON KOSSA染色显示实验组可见较多的矿化结节,对照组出现少量或无矿化结节.免疫组织化学染色显示终板软骨细胞有Ankh蛋白表达,主要定位于细胞膜.实验组ankh基因mRNA表达(0.682±0.154)低于对照组(0.805±0.171),差异有统计学意义(P＜0.05).实验组Ankh蛋白表达(0.172±0.030)低于对照组(0.196±0.028),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 伴随软骨终板的退变,ANK/ANKH的表达明显降低且与椎间盘的退变程度呈正比,提示调节ANK在终板软骨细胞中的表达有可能会阻止椎间盘的退变.     

单间隙颈椎间盘突出三种不同颈前路手术方式的对比分析

目的:探讨颈前路单间隙椎间减压植骨融合三种不同术式对融合时间、椎间高度、前凸角的影响。方法:回顾性分析本院自2000年1月~2005年8月因单节段椎间盘突出行前路手术并获得随访的患者35人,根据手术方法分为3组:环锯法+自体髂骨植骨(A组)19例,保留终板+自体髂骨植骨(B组)7例,保留终板+自体髂骨植骨+内固定(C组)9例。其中环锯法完全去除植骨床中的骨性终板,于术后1周、3月、6月、1年摄颈椎正侧位片,了解3组病例在融合时间、椎间高度丢失、前凸角丢失方面的差异。结果:3组病例融合时间无显著性差异(P>0.05);椎间高度丢失、前凸角丢失A组大于B、C组(P<0.01),B组与C无显著性差异(P>0.05)。结论:在单节段椎间减压植骨融合中,保留终板能有效地减少术后椎间高度及前凸角丢失,钛板内固定在预防术后椎间高度及前凸角丢失无显著作用,保留终板与否融合时间无明显影响。