携带GALV.fus基因的重组单纯疱疹病毒-Ⅰ的构建及抗肺腺癌裸鼠荷瘤实验研究

目的 探讨重组单纯疱疹病毒-Ⅰ(HSV-Ⅰ)介导的长臂猿白血病病毒致融性外膜糖蛋白(GALV.fus)基因系统对肺腺癌的体内外杀伤效果.方法 扩增已成功构建的HSV-UL38P-GALV.fus、HSV-CMVPGALV.fus、HSV-CMVP-EGFP质粒,在Vero细胞用脂质体转染、包装成重组嗜肿瘤HSV-Ⅰ,分...     

单纯疱疹病毒介导GALV致融性糖蛋白对人肺腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 探讨Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅰ)载体介导的长臂猿白血病病毒致融性外膜糖蛋白(GALV.fus)基因转导肺腺癌细胞的体内抗肿瘤作用及建立人肺腺癌皮下瘤裸鼠模型的最佳方案.方法 将重组HSV-Ⅰ载体质粒通过脂质体导入非洲绿猴肾细胞(Vero)中包装制备重组HSV-Ⅰ病毒,通过细胞悬液接种或组织块移植法构建人肺腺癌细胞(A549)裸鼠皮下移植瘤模型,将重组HSV-Ⅰ病毒注入裸鼠肺癌瘤体中观察其体内抗肿瘤作用.结果 成功包装重组HSV-Ⅰ病毒,病毒对肺癌细胞有明显的杀灭作用且对裸鼠皮下肺癌转移灶抑制明显.结论 细胞悬液接种和套管针组织块接种均为建立裸鼠荷瘤模型理想方法;GALV.fus基因对肺癌细胞有强效的抗肿瘤作用,明显抑制人肺腺癌裸鼠移植瘤的生长,为临床肺癌治疗探索出一种新型基因治疗方法.     

GALV致融性糖蛋白转导肺腺癌细胞的抗肿瘤实验研究

目的 探讨特异性启动子控制下嗜肿瘤Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅰ)载体介导的长臂猿白血病病毒致融性外膜糖蛋白(GALV.fus)基因转导肺腺癌细胞的抗肿瘤作用.方法 将重组HSV-Ⅰ载体质粒通过脂质体导入非洲绿猴肾细胞(Vero)中包装制备重组HSV-Ⅰ病毒,用来转染肺腺癌细胞(A549)和正常人胚胎成纤维细胞(HFL-Ⅰ GNHu 5)及裸鼠皮下肺癌转移模型,观察其体外及体内抗肿瘤作用及细胞毒性作用.统计学方法采用t检验.结果 成功包装重组HSV-Ⅰ病毒, BALB/c 裸鼠皮下接种A549细胞2周后均有肿瘤生长,成瘤率为100%.重组单纯疱疹病毒能特异性转染A549细胞,治疗组及对照组细胞存活率分别为20%及70%,病毒对A549细胞有明显的杀灭作用且对裸鼠皮下肺癌转移灶抑制明显.结论 GALV.fus基因对肺癌细胞有强效的抗肿瘤作用,为临床肺癌治疗探索出一种新型基因治疗方法.     

单纯疱疹病毒Ⅰ型Stocker株gD膜外区基因的克隆与序列测定

目的：为了克隆单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV－1）gD膜外区基因。方法：采用Vero细胞培养HSV－I Stocker株,并提取病毒DNA作为PCR模板。PCR扩增出的gD片段经EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切,插入质粒pB220相应位点,转化E.coliDH5α。重组质粒经PCR、酶切鉴定命名为pBV220-gD。对克隆的HSV－I Stocker株gD基因进行序列,并与其他HSV－Ⅰ,ⅡgD基因相应部分进行比较。结果：核苷酸序列同源性分别为99．77％、86．55％,氨基酸序列同源性分别为99．31％、88．28％。结论：SHV－Ⅰ gD基因的克隆为表达该基因,进一步研制重组抗原诊断试剂、研究亚单位疫苗及gD,gD受体的结构功能奠定了基础。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型Stocker株糖蛋白G基因在PBV221原核表达载体的表达与纯化

目的：构建Ⅰ型单纯疱疹病毒型特异性包膜糖蛋白G基因片段的表达载体,进行原核表达,并纯化目的蛋白。方法：用PCR法扩增HSV1-gG强抗原决定簇的基因片段,将该段基因克隆于PBV221表达载体。转化大肠杆菌DH5α,温控诱导目的蛋白表达,表达产物以包涵体形式存在。用SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白,经离子交换纯化获得较纯的目的蛋白。结果：获得了重组的原核表达载体及相对分子质量为14．7kD的重组蛋白,并纯化获得了纯度大于90％的目的蛋白抗原。结论：成功克隆和表达了高纯度的HSV1-gG蛋白。     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白B基因疫苗的构建

目的：构建用于治疗和预防单纯疱疹病毒性角膜炎的核酸疫苗,探讨单纯疱疹病毒1型糖蛋白B(HSV-1gpB)基因作为基因疫苗的可能性。方法：利用PCR技术从HSV-1 SM44毒株基因组中扩增出编码HSV-1gpB去除N端部分信号肽序列(39 bp)的基因片断（2 673 bp）,定向插入真核表达质粒pcDNA3载体中,构建出重组真核表达质粒pcDNA-gpB,并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定。 结果：双酶切重组质粒pcDNA-gpB,电泳可见两条带,分别为目的基因（2 700 bp）和线性质粒pcDNA3（5 400 bp）; 以重组质粒pcDNA-gpB为模板进行PCR扩增,在2 700 bp位置扩增出特异的产物;测序结果表明,克隆基因插入方向正确,与GenBank中登录的HSV-1 F株gpB基因序列比较,同源性达99.5%。 结论：利用PCR技术从HSV-1 SM44株基因组中扩增出编码HSV-1gpB去除N端部分信号肽序列（39 bp）的基因片断（2 673 bp）, 成功地构建了HSV-1基因疫苗pcDNA-gpB。     

单纯疱疹病毒2型糖蛋白G的基因扩增、克隆及其B细胞抗原表位分析

目的:克隆单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白G-2(gG-2)全长基因并对糖蛋白G-2进行B细胞抗原表位预测. 方法:用PCR法扩增HSV-2的gG-2基因,连接到pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α株后测序. 利用Lasergene,Clustal X等软件,进行B细胞抗原表位预测. 结果:完成单纯疱疹病毒2型(HSV-2)gG-2全长基因克隆. 通过B细胞抗原表位分析,发现HSV-1的gG-1和HSV-2的gG-2氨基端的同源性很低. gG-2蛋白在"独特区"存在抗原指数非常强的抗原表位. 结论:成功构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)gG-2全长基因克隆,为单纯疱疹病毒感染的诊断试剂的研发及抗单纯疱疹病毒疫苗研究寻找更好的靶位点提供研究材料和参考.     

含Ⅰ型单纯疱疹病毒包装信号序列片段的分离及扩增子质粒双表达载体的构建

利用基因工程技术分离出含有Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV－1）包装信号序列和HSV－1基因组复制起点序列的片段，表达外源基因所必需的启动子序列以及其下游作为报告基因的lacZ基因片段，构建成质粒型HSV－1载体pHSVL。用脂质体介导的方法可将该质粒转染入经辅助病毒HSV－1tsK株超感染的Vero细胞，并将其包装成HSV－1假型病毒颗粒，可如天然病毒一样再感染传代细胞和神经细胞并在其中进行基因表达。在pHSVL的基础上，我们还构建了一种可同时表达两种外源基因的质粒型疱疹病毒载体pHLCL，即在pHSVL中插入第二个转录单位：HCMVIE启动子和其下游的荧光素酶基因（lucgene），由此获得的pHLCL病毒接种传代细胞证明它可在其中同时表达两种报告基因．本研究成功地构建了两种质粒型HSV－1载体，其独特的基因转移方式使之在神经生理、病理及神经系统疾病的基因治疗的实验研究中都具有广阔的应用前景。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型载体中介lacZ基因导入猴嗅中枢皮质及其表达的研究

目的：研究用ＨＳＶ－１载体经猴嗅神经通路将外源基因导入中枢神经系统的方法。方法：将ＨＳＶ－１载体接种于猴嗅神经末梢，在不同时间取各部位脑组织检测ｌａｃＺ基因表达产物β－半乳糖苷酶活性，并观察猴脑组织局部及全身的病理学和免疫学变化。结果：接种ＨＳＶ－１载体后４ｄ在嗅中枢皮质神经元内检测到β－半乳糖苷酶活性，并持续１个月以上；脑组织及全身脏器未见病理学及免疫学改变。结论：ＨＳＶ－１载体可通过嗅神经通路将外源基因导入中枢神经系统并在其中表达，     

单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因的扩增、克隆和测序

目的：对单纯疱疹Ⅰ型胸苷激酶基因扩增、克隆和测序．方法：从单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１）１７ｓｙｎ＋株感染的ＢＨＫ２１细胞上清液中提取ＨＳＶ－１基因组ＤＮＡ，以此为模板，用ＰＣＲ方法扩增胸苷激酶（ＴＫ）．将扩增的片段克隆入载体ｐＵＣ１８中，并进行测序．结果：除终止码外，ＨＳＶ－１ＴＫ基因全部编码区为１１２８ｂｐ，编码３７６个氨基酸，其中含１２个蛋氨酸，４个半胱氨酸．ＴＫ的第２４９和２５０位氨基酸残基分别为Ｌｅｕ和Ｇｌｎ，其相应密码子为ＣＴＧ，ＧＡＧ，构成１个ＰｓｔＩ位点，第３１３和３１４氨基酸残基分别为Ａｓｐ和Ｖａｌ，其相应密码子为ＧＡＣ和ＧＴＣ，构成另一个ＰｓｔＩ位点．结论：本研究扩增出了ＨＳＶ－１ＴＫ基因的全部编码区序列     

单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因Stocker株的分子克隆及序？…

根据已发表的单纯疱疹病毒Ｉ型ＣＬ１０１株胸苷激酶基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以ＨＳＶ－Ｉ Ｓｔｏｃｋｅｒ株核酸为模板,应用ＰＣＲ技术扩增出１．４２７Ｋｂ大小的片段,并将此片段克隆载体ｐＵＣ１１９中,通过酶切和序列分析证明含完整的ＴＫ基因序列,此序列与ＣＬ１０１株ＴＫ基因的核苷酸序列一致性为９９．０％,氨基酸的一致性为９７．６％,此基因的成功克隆为进一步研究了ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ系统在肿     

单纯疱疹病毒Ⅰ型——慢性痛基因治疗的载体

慢性顽固性疼痛严重危害人类健康,传统的药物治疗效果不佳。单纯疱疹病毒I型(herpes simplex virus type I,HSV-I)载体具有天然嗜神经性,适合神经系统转基因治疗。皮下接种HSV-I载体,能有效传递疼痛调节基因至背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)的感觉神经元,编码抑制性神经递质或抗炎递质,减轻了炎性和神经病理性疼痛。这种全新的止痛方法,没有全身用药的不良反应,能与标准的止痛治疗措施联合应用,显示了巨大的潜力。现就HSV-I在慢性疼痛治疗中的应用作一综述。     

环介导等温扩增法检测孕妇血清中单纯疱疹病毒Ⅰ型方法的建立

目的建立稳定、可靠的环介导等温扩增法（LAMP）快速检测孕妇血清中单纯疱疹病毒Ⅰ（HSV-Ⅰ）DNA的方法。方法通过对影响LAMP反应体系的几个主要因素进行优化,确定最佳反应条件,并对其特异性、灵敏度及可靠性进行评判。结果 LAMP检测HSV-Ⅰ DNA的最佳反应条件：甜菜碱和Mg2＋的终浓度分别为1.0mol/L和10mmol/L,于62℃恒温反应1h。扩增产物可被Hinf Ⅰ消化,理论上检测下限可达10个拷贝,与定量PCR相比符合率达94.5%。结论本实验建立的LAMP检测HSV-I的方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点,适合基层用于HSV-Ⅰ筛查。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因 Stocker 株的分子克隆及序列分析

根据已发表的单纯疱疹病毒 Ｉ型（ Ｈ Ｓ Ｖ Ｉ） Ｃ Ｌ１０１ 株胸苷激酶（ Ｔ Ｋ） 基因的核苷酸序列,设计并合成一对引物,以 Ｈ Ｓ Ｖ Ｉ Ｓｔｏｃｋｅｒ 株核酸为模板,应用 Ｐ Ｃ Ｒ 技术扩增出１ ．４２７ Ｋｂ 大小的片段,并将此片段克隆至载体ｐ Ｕ Ｃ１１９ 中,通过酶切和序列分析证明含完整的 Ｔ Ｋ 基因序列,此序列与 Ｃ Ｌ１０１ 株 Ｔ Ｋ 基因的核苷酸序列一致性为９９０ ％ ,氨基酸的一致性为９７６ ％ ,此基因的成功克隆为进一步研究 Ｈ Ｓ Ｖ Ｔ Ｋ Ｇ Ｃ Ｖ 系统在肿瘤基因治疗中的应用打下了基础。     

单纯疱疹病毒I型DNA疫苗的构建(英文)

目的　构建表达单纯疱疹病毒 1型糖蛋白D的DNA疫苗。方法　采用聚合酶链式反应 (PCR) ,从HSV 1基因组中扩增出 gD基因 ,插入中间载体pGEM T ,然后克隆入真核表达载体pcDNA3 .1 ,构建重组质粒 pLy D .经部分测序和限制性内切酶分析证实。将pLy D转染Cos 7细胞 ,并肌肉接种ICR小鼠。用免疫组化和ELISA方法分别检测gD蛋白表达及小鼠血清中的特异性抗体。结果　转染的Cos 7细胞中有 gD蛋白的表达 ;经三次肌肉免疫接种的小鼠血清中有特异性HSV 1抗体产生。结论　本研究构建的重组质粒 pLy D能够在哺乳动物细胞中表达目的蛋白 ,免疫接种后可以诱导动物产生免疫反应     

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D酵母表达载体的构建

目的:构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础.方法:应用PCR方法从HSV-Ⅰ基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD.结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%.结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒.     

单纯疱疹病毒I型糖蛋白D酵母表达载体的构建

目的:构建含有单纯疱疹病毒I型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础。方法:应用PCR方法从HSV-I基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD。结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%。结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒I型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒。     

小鼠脑无症状性单纯疱疹病毒Ⅰ型感染的实验研究

【目的】观察单纯疱疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus—type one,HSV-1）是否可以引起脑组织的无症状性感染,探讨多发性硬化的发病机制。【方法】将Balb／c小鼠分为实验组、对照组和脑炎组,在不同时间点观察小鼠神经病学体征、行为学以及体重变化;用聚合酶链反应法检测三叉神经节病毒DNA片段;免疫荧光法检测脑组织疱疹病毒抗原表达,以判定脑组织病毒增殖性感染的存在。【结果】实验组小鼠各时相点神经病学体征、神经行为学和体重变化与对照组小鼠相比较差异无统计学意义。在病毒接种的各时相点,大部分小鼠三叉神经节检测到了疱疹病毒DNA片段,同时脑的颞叶、顶叶和额叶皮层均发现片状HSV抗原阳性表达神经元,以7d组阳性细胞最多,荧光亮度最强,15d组阳性细胞减少,荧光亮度减弱。【结论】单纯疱疹病毒Ⅰ型能够引发小鼠脑组织的急性、短暂性、无症状性非坏死性感染。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因旁观者效应的实验研究

目的 :研究单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因 (HSV -Ⅱtk)对人原发性肝细胞癌SMMC - 772 1的旁观者效应 .方法 :HSV -Ⅱtk基因通过阳离子脂质体Lipofectin介导 ,体外转染人原发性肝细胞癌SMMC -772 1,孵育 18h .取出细胞及上清液 ,对倍稀释 ( 2× ,4× ,8× ,16× ,3 2× )后分别加入另一 2 4孔板 .结果 :正常SMMC - 772 1细胞的浓度升高 ,亲本细胞的存活率随之降低 ,两者呈明显的负向相关关系 ;细胞组的OD值明显低于上清液组及空白对照组 (P <0 0 1) ;细胞组可见凋亡峰出现 ,而上清液组则无凋亡峰出现 .结论 :HSV -Ⅱtk基因对人原发性肝细胞癌SMMC - 772 1细胞具有旁观者效应 ,其作用机制可能与细胞紧密连接及细胞凋亡有关     

单纯疱疹病毒2型结构的生物学功能分析

单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus 2,HSV-2)是引起全球生殖器溃疡疾病的主要病原体之一.HSV-2病毒基因组庞大、结构复杂、编码蛋白种类繁多,这些蛋白分子不仅在机体免疫系统中作为病毒抗原参与宿主天然和适应性免疫过程,也能够作为结构分子和功能分子参与病毒的复制和宿主细胞的病理性反应.因此对该...