新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因进化和变异分析

目的：对新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因的进化和变异进行分析,为进一步研究致病性禽流感的致病机制和毒力因子奠定基础。方法：从IRD数据库中下载2013年2月19日至2013年10月31日的H7N9流感病毒PBl基因序列63条,运用MEGA5．2．1软件进行序列分析,用邻接法构建基因进化树;通过氨基酸序列分析PB1基因95～367片段的PB1-F2蛋白氨基酸位点变化;应用Excel表格对氨基酸构成进行计算;运用Predictive Analytics Software（PASW）18．0软件对氨基酸构成改变进行统计分析。结果：63株甲型H7N9毒株中有17株毒株的PB1-F2蛋白在其氨基酸序列第25位后发生断裂。新型甲型H7N9的进化主要分为两个系别,系别I主要由完整型PB1-F2蛋白毒株构成,系别Ⅱ主要由52aa截短型PB1-F2蛋白毒株构成。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白各类氨基酸构成存在差异。结论：H7N9流感毒株中存在着截短型PB1-F2蛋白毒株,并且H7N9流感病毒毒株PB1-F2蛋白断裂位点均在25位氨基酸后,这将成为H7N9流感毒株进化过程中重要的特征。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白氨基酸构成的差异对于甲型H7N9流感病毒致病性的影响有待进一步研究。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶编码基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型流感病毒(A/H1N1)聚合酶PA、PB1和PB2编码基因的进化规律。方法:从NCBI流感病毒基因数据库下载2009年新型甲型H1N1流行株的PA、PB1和PB2聚合酶编码基因序列以及人、猪和禽流感病毒相应的参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA4.0）软件比对和修剪此次流行株的代表序列及所有参考株序列并构建系统树,再比对和修剪此次流行株的代表序列及人A/H1N1病毒各年代(1918~2008年)参考序列并构建系统树,同时比对此次流行株的代表序列及人A/H1N1各年代(1918~2008年)参考序列编码PB2蛋白的氨基酸序列。结果:不同地区分离的2009年新型甲型H1N1流感病毒的聚合酶PA、PB1和PB2编码基因均具有高度同源性,并聚集在一个独特的进化支上,与猪流感病毒对应基因接近。三者均与2005年美国爱荷华州分离的人A/H1N1病毒基因(A/Iowa/CEID23/2005/H1N1)具有高度的相似性。2009年新型甲型H1N1流感病毒、2005年美国爱荷华州流行的H1N1 (DQ889682)病毒PB2蛋白第627位氨基酸与禽类流感病毒相同,均为谷氨酸,而与其他人A/H1N1 (1918~2008年)病毒的赖氨酸不同。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶基因可能来源于2005年美国爱荷华州分离的人A/H1N1病毒,禽流感病毒可能参与了聚合酶基因的重排过程。     

深圳市H7N9禽流感病毒神经氨酸酶基因演化分析

目的掌握深圳市从禽类市场外环境及人感病例中分离到的H7N9禽流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的演化,以及病毒对神经氨酸酶抑制剂(NAI)的耐药情况,为人感染H7N9病例的临床救治方案提供参考。方法将深圳市11份人感染H7N9禽流感病例鼻咽拭子标本以及3份活禽市场的环境拭子样本,经分离培养后对其NA片段进行全长测序。并选取国内外的H7N9病毒株序列作为参考,运用Mega软件进行种系发生树的构建、耐药相关位点及糖基化位点的分析。结果对NA片段的序列分析发现,所有深圳株NA基因的蛋白抗原位点和糖基化位点都相对保守,并且未出现R294K耐药位点。但发现三株未出现H7N9特征性蛋白柄部氨基酸的缺失株。结论深圳市分离到的H7N9病毒株与中国其它省份的流行株高度同源,对NAI仍然敏感。蛋白柄部氨基酸变异提示还需要对其进行进一步的研究和监测。     

PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒的致病性的影响分析

目的 本研究利用A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,评估PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒的致病性,探究A/H6N1流感病毒的致病性分子基础。方法 通过A/H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/SanJiang/275/2007株反向遗传操作系统和点突变技术拯救病毒rA/H6N1和PB2 E627K位点发生突变的 rA/H6N1-627,两株拯救病毒分别以101EID50~106EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、死亡率、病毒滴定等方面进行致病性分析。结果 成功构建A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,rA/H6N1的8个基因片段完全源于A/H6N1的基因组,核苷酸序列及生物学特性与A/H6N1完全一致。rA/H6N1能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性(MLD50>106.5EID50),病毒在小鼠体内的分布情况及各个脏器中的病毒滴度与A/H6N1保持一致; rA/H6N1-627能感染小鼠,引起小鼠体重下降,但不能引起所有106EID50组小鼠死亡,病毒能在小鼠的肺脏和脑部进行增殖。结论 实验结果表明,在H5N1禽流感中发挥重要作用的PB2-E627K位点并非A/H6N1流感病毒的毒力决定因子。A/H6N1流感病毒致病性的分子基础还有待继续研究,该反向遗传操作系统和点突变技术的建立为研究该亚型流感病毒致病机制、传播机制及病毒基因功能奠定了基础,同时也为A/H6N1亚型禽流感病毒新型疫苗的研制开辟了新途径。     

广东人H5N1毒株PB2基因进化和特性

目的:通过对人禽流感H5N1毒株PB2基因序列的变异分析,揭示毒株PB2基因特征与进化.方法:检测广东地区人禽流感H5N1毒株PB2基因核苷酸序列,同时检索全球人禽流感H5N1毒株PB2基因序列,采用DNAStar5.0软件对检索的人禽流感H5N1毒株PB2基因核苷酸序列进行比对和分析;并结合流行病学资料对变异毒株进行进化速度分析.结果:1997/2006 48株毒株PB2基因核苷酸序列同源性分成两组,1997/1998毒株为第一组(G1),2003/2006毒株为第二组(G2).PB2基因错义置换导致101个氨基酸位点变异,占比例13.3%(101/759).PB2基因Ks值为39.4×10-6～63.4×10-6 Nt/d,Ka值为3.36×10-6～5.11×10-6 Nt/d;提示PB2基因进化主要受到自发突变影响.2003/2006毒株(包括毒株GD-01-06)仅保留一个糖基化位点(NPT301-303),丢失3个糖基化位点,可能影响蛋白致病性和抗原性.结论:目前PB2基因进化分成两组,主要受到除自发突变影响;PB2基因丢失3个糖基化位点可能影响蛋白致病性.人禽流感H5N1毒株PB2基因在自然界变异非常频繁,不断变异将影响H5N1毒株在人-人传播能力和引发大流行.     

东南亚禽流感病毒H5N1的HA基因特征分析

目的分析东南亚禽流感病毒HA基因和蛋白序列的特点,比较与我国人禽流感病毒的异同,为人禽流感防控工作提供参考。方法从GenBank获得东南亚和我国H5N1禽流感病毒HA核酸序列,ClustalX1.83和MEGA4.0对HA核酸和蛋白分析,构建遗传进化树。结果东南亚各国H5N1病毒受体位点氨基酸为QSG;越南、泰国、柬埔寨HA蛋白关键位点氨基酸基本没有变化;印尼多个样本发生改变,进化树中聚于一个分支内;中国人与老挝、马来西亚样本关键位点氨基酸相同,进化树中处于同一分支中。结论越南、柬埔寨和泰国H5N1病毒流行株HA蛋白未影响病毒毒力,印尼为一独立的病毒体系,中国与老挝和马来西亚样本来源于同一毒株,中国、老挝和马来西亚之间存在着病毒扩散现象。     

新型甲型H7N9流感病毒血凝素基因进化分析

目的探讨2013年4月流行的新型甲型H7N9禽流感病毒的表面蛋白血凝素(HA)基因的进化,以及氨基酸的变异情况。方法从美国国家生物技术信息中心(NCBI)和全球禽流感基因共享数据库(GISAID)中下载H7N9流感病毒以及有代表性的H7N2、H7N3、H7N7亚型流感病毒的HA基因序列,运用Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)version 5.05软件进行序列分析,用邻接法构建基因进化树;通过氨基酸序列分析HA蛋白受体结合位点、糖基化位点和裂解位点的变化。结果 2013年新型甲型H7N9流感病毒与2011年浙江禽类H7N3流感病毒株(JQ906573.1)的相似性达到95.3%～95.6%;受体结合位点氨基酸发生变异,为Q226L,5个糖基化位点高度保守;HA裂解位点位于aa339和aa340之间,仅有1个碱性氨基酸:R。结论 2013年新型甲型H7N9流感病毒HA基因是由中国禽类H7亚型进化而来,Q226L变异导致的受体结合位点的变化可能是新型流感病毒具有人感染性的原因。     

2株广西鸭源H6N2亚型禽流感病毒遗传进化以及对BALB/c小鼠的致病性分析

目的：探讨广西鸭源H6N2亚型禽流感病毒的分子遗传特征，评估其对哺乳动物BALB/c小鼠的致病性。方法：选择前期在广西分离的2株鸭源性H6N2禽流感病毒A/DK/GX/3101/2018(GX3101)、A/DK/GX/5220/2018(GX5220)，基因测序和遗传进化分析病毒全基因组的核苷酸同源性及遗传进化，受体结合特异性法分析2株病毒的受体结合特性，应用BALB/c小鼠评估鸭源H6N2病毒的致病性。结果：2株H6N2病毒属于欧亚谱系，HA裂解位点处为PQIETG/GL，属低致病性禽流感病毒特征，HA蛋白氨基酸位点出现E190V位点的氨基酸突变，2株病毒均识别与结合禽型SAα-2,3 Gal受体。病毒接种小鼠后，肺组织病毒分离培养阳性，小鼠肺组织出现炎症细胞浸润、肺泡结构完整性破坏，免疫组化检测病毒抗原显示，GX3101病毒接种小鼠的肺组织出现流感病毒核蛋白（NP）阳性。结论：广西鸭源H6N2毒株具有禽流感病毒的特点，可不经适应直接跨种属间屏障感染哺乳动物小鼠，须密切监测家禽中流感病毒H6N2流行和进化演变。     

H7N9禽流感病毒在小鼠体内的适应性研究

目的进一步探讨H7N9禽流感病毒对哺乳动物的感染与致病能力,并对其分子机制进行研究。方法以病毒滴鼻感染小鼠,在BALB／c小鼠肺组织中连续传代,通过病毒全基因组测序及比对探寻适应的分子机制。结果禽流感H7N9A／Anhui／1／2013病毒,经过在小鼠体内进行9次传代后,对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对,发现适应株HA基因,NA基因以及PA亚基共发生了4个有义突变。结论禽流感H7N9A／Anhui／1／2013病毒经连续传代后基因发生突变,但对病毒的毒力以及致病力影响仍需后续实验验证。     

H7N9禽流感病毒在小鼠体内的适应性

目的进一步探讨H7N9禽流感病毒对哺乳动物的感染与致病能力,并对其分子机制进行研究。方法以病毒滴鼻感染小鼠,在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,通过病毒全基因组测序及比对探寻适应的分子机制。结果禽流感H7N9 A/Anhui/1/2013病毒,经过在小鼠体内进行9次传代后,对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对,发现适应株HA基因,NA基因以及PA亚基共发生了4个有义突变。结论禽流感H7N9 A/Anhui/1/2013病毒经连续传代后基因发生突变,但对病毒的毒力以及致病力影响仍需后续实验验证。