携带鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因腺病毒载体对B16黑色素瘤的抑制作用

目的 :观察携带鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因腺病毒载体 ( Ad CMVGM- CSF)对B1 6黑色素瘤的致瘤性及抑制作用。方法 :将 B1 6黑色素瘤细胞与 Ad CMVGM- CSF在 37℃、5 %CO2 培养箱中孵育 ( RPMI- 1 640培养基 ) 2 h后注射到 C5 7BL/ 6小鼠右侧背部皮下 ( MOI=5 0 0 ) ,观察 Ad CMVGM- CSF对 B1 6黑色素瘤致瘤性的抑制作用 ;观察瘤内一次注射及二次注射对 B1 6黑色素瘤的抑制作用。结果 :Ad CMVGM- CSF能有效地抑制 B1 6黑色素瘤细胞的致瘤性 ,抑瘤率达 60 %;瘤内一次注射 Ad CMVGM- CSF可延缓肿瘤的生长 ,二次瘤内注射 Ad CMVGM- CSF能够强化抗肿瘤效果。结论 :Ad CMVGM- CSF具有抑制肿瘤生长的作用     

白细胞介素12基因修饰的Lewis肺癌瘤苗的抗肿瘤免疫作用

目的：研究白细胞介素12（IL-12）基因修饰的Lewis肺癌瘤苗的抗肿瘤免疫作用。方法：用含IL-12基因的腺病毒载体,在体外以不同感染系数感染Lewis肺癌细胞,并分别接种于C57BL/6小鼠皮下,观察其致瘤性的变化;并用Lewis肺癌细胞及B16黑色素瘤细胞再 次攻击免疫后的C57BL/6小鼠,观察肿瘤发生情况。 结果：以各种感染系数AdCMVIL-12制备的瘤苗,接种于小鼠皮下后,无肿瘤生长,完全消除了Lewis肺癌细胞的致瘤性;瘤苗注射6 d后,用Lewis肺癌细胞再次攻击,仍无肿瘤生长,抑瘤率达100%;用B16黑色素瘤细胞攻击,10~12 d均有肿瘤生长,说明此瘤苗具有肿瘤特异性。结论：AdCMVIL-12能消除Lewis肺癌细胞的致瘤性,并能诱导显著的抗肿瘤免疫反应,对肿 瘤的复发及转移有较好疗效。     

瘤体内注射肿瘤坏死因子重组腺病毒对大鼠乳腺癌的治疗作用

目的:观察腺病毒重组肿瘤坏死因子(TNF)基因转染对大鼠乳腺癌细胞Walker256体内致瘤性的影响及瘤体内注射TNF重组腺病毒对Walker256荷瘤大鼠的治疗作用.方法:Walker256乳癌细胞感染人TNF重组腺病毒后,观察其体外增殖能力、皮下致瘤性的变化及进行肿瘤局部病理学检查;瘤体局部注射TNF重组腺病毒(Ad.hTNF),观察荷瘤大鼠的肿瘤生长情况及生存期.结果:Walker256感染人TNF重组腺病毒后,培养上清中24 h TNF的分泌量达5.2 ng/106细胞,细胞形态学无明显变化,体外增殖能力和皮下致瘤性显著下降,瘤体周围有大量淋巴细胞及单核细胞浸润;肿瘤局部注射Ad.hTNF能显著抑制Walker256的生长,并延长荷瘤大鼠的生存期.结论:重组腺病毒能有效介导TNF基因转染Walker256细胞,瘤体内局部注射Ad.hTNF对Walker256荷瘤大鼠具有明显的治疗作用.     

腺病毒介导mIFN-β基因转染的小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性

目的研究腺病毒(Ad)介导mIFN-β基因转染的B16小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性.方法用Ad为载体将mIFN-β基因导入B16细胞,观察mIFN-β基因转染的B16细胞的体外增殖能力及免疫原性的改变.结果当MOI为50～100,即可获得较高的转染效率,达90%±1%,转染细胞能表达分泌mIFN-β并具有生物学活性;AdmIFN-β感染对B16细胞的增殖能力无影响,但能显著提高细胞表面MHC-Ⅰ类抗原的表达.结论 Ad载体具有较高的转移效率,并能使其携带的mIFN-β基因有效表达;AdmIFN-β转染的B16细胞的免疫原性显著增强.提示利用Ad载体携带有效的目的基因来治疗肿瘤甚至开发瘤苗是可行的.     

骨形态发生蛋白2基因转染对舌鳞癌细胞体内外生物学行为的影响

目的 探讨骨形态发生蛋白2(BMP2)基因转染对体外舌鳞癌细胞的作用及机制,并观察体内转染BMP2基因对严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠皮下移植瘤生长与转移的影响。方法 体外培养舌癌Tca8113细胞,将重组腺病毒介导的BMP2(Ad-BMP2)基因分别按0、50、100感染复数 (MOI) 转染Tca8113细胞后,采用Western blot检测Ad-BMP2组和PBS组细胞中BMP2、Smad1和Smad5表达的差异。建立SCID鼠肿瘤模型并瘤内注射Ad-BMP2基因,观察肿瘤体积的变化及肿瘤转移情况。结果 Ad-BMP2基因成功转染至Tca8113细胞,MOI为100时转染效率较高,Ad-BMP2组和PBS组细胞中BMP2、Smad1和Smad5的表达差异有统计学意义,P＜0.05,Ad BMP2组Smad1和Smad5的表达量与BMP2的浓度呈正比。SCID鼠皮下移植瘤的体积在2周后平均增大0.6cm3,瘤内注射Ad-BMP2基因后,明显抑制移植瘤的生长。肝、脾、肾、大网膜等脏器均未查见肿瘤转移。结论 以腺病毒为载体的BMP2在Tca8113细胞中有效表达,Smad1和Smad5蛋白的表达也显著提高。基因转染BMP2显著抑制SCID鼠舌癌移植瘤的生长。     

复制缺陷型重组腺病毒介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤的作用研究

目的观察体外转mIFN-β基因的B16细胞的体内致瘤性和瘤苗作用,及通过腺病毒载体介导的mIFN-β对体内局部肿瘤治疗和抗肿瘤转移的作用,并对其机制进行探讨。方法利用人类复制缺陷型重组腺病毒将目的基因mIFN-β经体外、体内两种途径导入小鼠黑色素瘤细胞（B16细胞）中。结果①携带目的基因的重组腺病毒感染B16细胞能获得较高的转移效率和目的基因的有效表达;②将mIFN-β基因导入B16细胞对B16细胞的体外增殖能力无明显影响,但能显著提高细胞表面MHC-Ⅰ类抗原的表达;③将转mIFN-β基因的B16细胞接种小鼠,其体内致瘤性明显降低,且对野生型B16细胞的致瘤性有抑制作用;④瘤体内注射和经尾静脉注射途径给予AdCMVmIFN-β,对局部肿瘤和转移瘤有治疗作用。该结果提示,利用腺病毒载体携带有效的目的基因来开发瘤苗和治疗肿瘤具有良好的临床应用前景。     

重组人5型腺病毒对B16黑色素瘤生长的抑制作用

目的 研究瘤内直接注射重组人5型腺病毒H101对B16黑色素瘤生长以及对手术后再次接种B16黑色素瘤细胞后肿瘤生长的影响.方法 建立小鼠B16黑色素瘤动物模型.瘤内直接注射H101腺病毒,测量肿瘤体积,切除肿瘤,再次接种B16黑色素瘤细胞,观察肿瘤生长情况.结果 细胞接种8 d后,全部小鼠均长出肿瘤.H101注射组肿瘤的体积在给药后3,6,9 d,都显著小于对照组.再次接种B16黑色素瘤细胞后,H101注射组肿瘤的生长速度也显著小于对照组.结论 瘤内直接注射H101对B16黑色素瘤生长具有抑制作用,对手术后再次接种的肿瘤生长也具有抑制作用.     

含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体对荷B16黑色素瘤小鼠免疫功能的影响

目的：研究含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体（AdCMVGM-CSF）直接注射荷B16黑色素瘤小鼠瘤体内对小鼠免疫功能的影响。 方法：将B16黑色素瘤细胞（5×10⁶/只）接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,将荷瘤小 鼠随机分为2组,每组12只,待瘤体直径达5 mm时分别注射AdCMVGM-CSF、AdCMVLacZ （5×10⁸ PFU/只）,检测每组小鼠的免疫功能及其对B16黑色素瘤的抑制作用。 结果：AdCMVGM-CSF实验组小鼠注射后第10天,荷瘤鼠血清中GM-CSF水平［(1 563.72±136.58)ng·L^-1］高于对照组（P<0.01）,肿瘤组织周围的CD8＋ T细胞表达明显增强。 结论：AdCMVGM-CSF可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,具有抑制肿瘤生长的作用。     

腺病毒载体介导的野生型P53基因对前列腺癌细胞生长和致瘤能力的抑制效果

目的　为探讨用腺病毒载体携带野生型P53基因作为前列腺癌基因治疗的可能性。方法　应用重组人携带野生型P53基因病毒 (Ad WTP53)感染培养的前列腺癌细胞 ,观察表达P53基因蛋白的癌细胞与对照组癌细胞的体外生长和裸鼠体内致瘤能力变化 ,对荷瘤裸鼠瘤体周围注射Ad WTP53,观察治疗组和对照组肿瘤生长的变化。结果　感染Ad WTP53的前列腺细胞体外生长和裸鼠体内致瘤能力明显下降 ,荷瘤裸鼠瘤体周围注射Ad WTP53后肿瘤生长速度明显减慢。结论　证实了野生型P53基因是一种抑癌基因 ,提示其可能被应用于前列腺癌的基因治疗研究     

小鼠B7-H4重组腺病毒的构建及鉴定

目的:利用AdEasyTM XL system构建携带小鼠B 7-H4基因的重组腺病毒,并鉴定其生物学活性.方法:以RT-PCR方法从C5 7小鼠肺组织中扩增B7-H4全长基因并克隆到T载体,然后测序鉴定.经Xhol Ⅰ和EcoR Ⅴ双 酶切后接入pshuttle-CMV穿梭载体(简称PSC),构建重组腺病毒的穿梭质粒PSC-mB7-H4 ,并电转化至BJ5183-AD-1感受态细菌,经筛选获得携带mB7-H4的重组腺病毒的质粒pmB7 -H4/Ad.将此质粒转化人胚肾细胞(AD-293)产生复制缺陷的重组腺病毒mB7-H4/Ad .以RT-PCR及Western blot方法检测被mB7-H4/Ad感染的AD-293细胞中B7-H4 mRNA和蛋 白的表达,并观察重组腺病毒感染的小鼠成纤维细胞(L929)对T细胞增殖和细胞因子表达的影响. 结果:获得序列准确的mB7-H4基因并成功构建重组腺病毒表达质 粒,转化AD-293细胞获得重组腺病毒;细胞生物学实验证实,该重组腺病毒具有抑制CD3单抗诱导的T淋巴细胞的增殖和细胞因子的分泌. 结论:成功构建具有免疫抑制功能的mB7-H4重组腺病毒.     

IL-12联合B7-1基因放射治疗对小鼠B16移植肿瘤生长的影响

目的：探讨基因联合放疗对小鼠B16移植肿瘤的抑制作用。方法：碱裂解法提取纯化质粒DNA，微量注射法直接将质粒DNA导入体内肿瘤；建立荷瘤小鼠模型, 于小鼠右后肢皮下接种5×10⁵个B16黑色素瘤细胞，待肿瘤直径达0.3~0.5 cm时开始治疗；肿瘤局部注射pNE-mIL-12和pcDNA-B7-1质粒3次，并给予3次X线照射，观察小鼠移植肿瘤的生长情况。结果：pNE-mIL-12重组质粒与pcDNA-B7-1质粒联合2 Gy放射治疗组肿瘤生长速率最低，小鼠生存时间明显延长（P<0.01~P<0.001），末次照射后31 d小鼠死亡率仅为22.2%，而且其中有1只小鼠肿瘤消退。结论：多基因联合放疗可有效抑制小鼠B16移植肿瘤的生长，其效果好于单基因治疗和单纯放疗。     

阳离子脂质体包裹的IL-12基因对小鼠黑色素瘤的治疗作用

目的:观察体内注射阳离子脂质体包裹的小鼠白细胞介素12(mIL-12)基因对小鼠黑色素细胞瘤的治疗作用.方法:C57BL/6小鼠在接种B16黑色素细胞后3、5、7、9 d分别给予lipofectin包裹的pCmIL-12质粒治疗,观察小鼠的肿瘤生长速度、生存期以及NK细胞活性的变化.结果:阳离子脂质体明显增强pCmIL-12质粒在体内的抗肿瘤生长活性,并延长荷瘤小鼠的存活期.此外,pCmIL-12/阳离子脂质体还能显著增强荷瘤小鼠的NK细胞活性.结论:阳离子脂质体介导的IL-12基因对小鼠黑色素瘤有明显的治疗效果.     

Anti-tumor effects of pNEgr-mIL-12 recombinant plasmid induced by X-irradiation and its mechanisms

Objective To study the effect of gene radiotherapy combining injection of recombinant plasmid pNEgr-mIL-12 with local X-irradiation on cancer growth and to elucidate the mechanisms of tumor inhibition. Methods Alkaline lysis was used to extract the plasmid and polyethylene glycol 8000 (PEG 8000) was applied for further purification of plasmids. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the expression of IL-12 protein. C57BL/6J mice were subcutaneously inoculated with B16 melanoma cells and the plasmid was injected directly into the tumor. Gene-radiotherapy combining pNEgr-mIL-12 recombinant plasmid with X-irradiation was given three times to C57BL/6J mice bearing B16 melanoma. Changes in immunologic parameters of tumor-bearing mice were detected with relevant immunologic assays. Results Results showed a significant decrease in tumor growth rate (P<0.05-0.001) after 3 times of gene-radiotherapy with IL-12 and X-irradiation. Immunologic studies showed a significant increase in CTL and NK cytolytic activity (P<0.05-0.001) and an up-regulated secretion of IFN-γ and TNF-α (P<0.01-0.001). Moreover, the expression of mIL-12 in B16 melanoma cells of the treated tumor-bearing mice was found to be higher than that of control. Conclusion pNEgr-mIL-12 plasmid combined with X-irradiation can increase tumor control and the mechanism of increased tumor inhibition is related to the enhancement of anticancer immunity in tumor-bearing mice.     

重组鼠白细胞介素12与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因联合治疗小鼠B16黑色素瘤

目的：研究重组鼠白细胞介素12（AdCMVIL-12）与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（AdCMVGM-CSF）的腺病毒载体联合应用对B16黑色素瘤的抗肿瘤作用。方法：将B16黑色素瘤细胞接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,待瘤体直径达5mm时将荷瘤小鼠随机分为4组,分别为AdCMVIL-12组、AdCMVGM-CSF组、AdCMVIL-12加AdCMVGM-CSF组（联合治疗组）和AdC MVLacZ组（对照组）,每组12只,并于肿瘤组织局部分别多点注射相对应剂量的腺病毒载体,观察各组小鼠肿瘤的生长情况及其诱导的细胞免疫反应,检测各组小鼠血清IL-12和GM-CSF表达水平的变化。结果：病理学观察,联合治疗组肿瘤组织内可见大片凝固性坏死,有大量的淋巴细胞、巨噬细胞浸润。治疗30 d后,联合治疗组肿瘤平均体积为（60.73±11.36 ）mm³,与对照组、AdCMVIL-12组和AdCMVGM-CSF组［分别为（675.18±80.59）、（1 86.91±19.15）和（223.45±23.11）mm³］ 比较差异均有显著性（P>0.01）。同时,AdCMVIL-12与AdCMVGM-CSF联合基因治疗可有效延长IL-12和GM-CSF的表达时间,并且对B16黑色素瘤细胞具有很强的特异性杀伤作用,杀伤率为（69.53 ± 9.20）%。 结论：IL-12与GM-CSF联合基因治疗可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,并能有效降低单独应用AdCMVIL-12的毒副作用。     

蝎毒对B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用

目的：观察蝎毒（scorpion venom, SV）及其分离组分对小鼠B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用。方法：采用MTT法检测肿瘤细胞存活率,集落形成法检测肿瘤细胞增殖, 采用流式细胞术检测细胞周期的变化。结果：400和800 mg•L^-1的SV可明显抑制B16黑色素瘤细胞生长 (P<0.01或P<0.05)。蝎毒组分（SV-Ⅰ、SV-Ⅱ 和SV-Ⅲ）在浓度为200、400 及800 mg•L^-1时,对B16细胞生长有明显的抑制作用 (P<0.05~P<0.01);在400和800 mg•L^-1 时,可使G₀/G₁期细胞数明显减少 (P<0.05~P<0.01),G₂+M期细胞明显增多(P<0.05~P<0.01),S期细胞呈降低趋势,而SV对细胞周期进程未见明显影响。当SV、SV-Ⅰ、SV-Ⅱ及SV-Ⅲ的浓度为400和800 mg•L^-1时, 对B16细胞集落形成均有明显的抑制作用 (P<0.01)。结论：在一定浓度范围内蝎毒及其组分对B16黑色素瘤细胞的存活与增殖均有明显的抑制作用,纯化后各组分的抑瘤作用优于蝎毒,但其抑制作用低于阳性对照丝裂霉素 (Mitomycin-c, MMC) 组。提示蝎毒引起细胞周期进程改变可能是其抑瘤作用的机制之一。     

十全大补汤抗小鼠黑色素瘤作用及与顺铂联合用药的研究

目的 探讨十全大补汤（SQDB）对小鼠黑色素瘤的抑制作用及机制,阐明其与顺铂（DDP）联合用药的作用效果及给药方式。方法 流式细胞术考察SQDB对小鼠黑色素瘤细胞B16F10细胞周期及凋亡的影响;分离小鼠脾细胞,MTS法考察SQDB对刀豆蛋白A（Con A）及脂多糖（LPS）促进小鼠脾细胞向T、B淋巴细胞转化的影响;构建小鼠黑色素瘤皮下移植瘤模型,通过 HE染色、免疫组化、TUNEL染色等方法考察SQDB的抑瘤作用;构建小鼠黑色素瘤转移瘤模型,探讨SQDB抗肿瘤转移作用及潜在机制。结果 10 mg/mL的SQDB能诱导B16F10黑色素瘤细胞凋亡;2.5、5、10 mg/mL SQDB减少了G₀/G₁期细胞数;10 mg/mL SQDB增加了S期细胞数;2.5 mg/mL SQDB增加了G₂/M期细胞数。5%和10%含药血清能够促进Con A所致B淋巴细胞增殖;5%、10%和15%含药血清对于LPS所致T淋巴细胞增殖亦有一定促进作用。同时,SQDB与DDP联用能够显著抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡;在小鼠黑色素瘤转移模型中,DDP与SQDB同时合用,或者先用DDP再用SQDB均能显著抑制黑色素瘤肺转移;两者同时给予能够显著提高小鼠胸腺指数,而先给SQDB再给DDP则显著逆转小鼠脾指数下降的现象,单用SQDB能够降低肿瘤组织局部IL-1β水平,促进IL-4分泌,从而抑制肿瘤转移。结论 SQDB能够抑制黑色素瘤B16F10增殖,促进其凋亡及小鼠脾淋巴细胞增殖;与DDP同时或贯序使用能够增强对小鼠移植瘤及转移瘤模型的抑制作用。      

20(S)-人参皂苷Rg3抑制肿瘤生长的作用

目的：观察20(S)-人参皂苷Rg3的抗肿瘤生长的作用并探讨其机制。方法：通过B16黑色素瘤实体瘤模型、MTT法观察Rg3对B16黑色素瘤生长的作用,采用新生血 管计数实验、流式细胞术检测Rg3对肿瘤组织血管生成及细胞周期的影响。结果：实体瘤模型中,不同浓度Rg3各组瘤重明显低于对照组（P<0.01）,且Rg3组肿瘤周围的血管数也明显少于对照组（P<0.01）。体外实验中,MTT法见Rg3抑制B16黑色素细胞的生长,其IC₅₀为（7.76±0.46）mg·L^-1,并且Rg3可阻滞B16黑色素瘤细胞于G0/G1和S期,使G₂/M期细胞数明显减少。 结论：Rg3抑制B16黑色素瘤的生长,其机制可能是通过抑制肿瘤内血管生成及阻滞肿瘤细胞进入分裂期来发挥作用的。