双醋瑞因对碘乙酸钠诱导的骨关节炎软骨细胞损伤的保护作用

目的：探讨双醋瑞因对碘乙酸钠（MIA）诱导的骨关节炎软骨细胞的保护作用。方法实验分为正常组,模型组（4μMMIA）,双醋瑞因低、中、高剂量组（1、10、100μM）。噻唑蓝（MTT）法检测各组软骨细胞活力;分光光度法检测各组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶‐3（Caspase‐3）活性;Westernblot分析核因子‐κB（NF‐κB）信号通路激活情况及下游靶蛋白Bax、Bcl‐2、基质金属蛋白酶‐9（MMP‐9）、基质金属蛋白酶‐13（MMP‐13）的表达量。结果1、10、100μM双醋瑞因能提高MIA诱导的大鼠软骨细胞的活力并降低Caspase‐3活性（P＜0．05）;10、100μM双醋瑞因能降低IκBα及NF‐κB磷酸化水平,并下调Bax、MMP‐9及MMP‐13的表达,上调Bcl‐2的表达（P＜0．05）。结论双醋瑞因能够抑制MIA诱导的软骨细胞凋亡与细胞外基质降解,与NF‐κB信号通路有关。     

缺氧与肿瘤恶性演进的关系及其机制探讨

目的：观察HT‐29细胞在低氧下分泌的基质金属蛋白酶2／9（MMP‐2／9）活性,检测NF‐κB的蛋白表达,初步探讨低氧与肿瘤恶性演进的关系。方法参照体内肿瘤的氧分压,建立低氧模型。将 H T‐29细胞低氧处理不同时段,明胶酶谱分析检测其分泌的MMP‐2／9活性变化;提取细胞核蛋白,Western blot测定胞核内NF‐κB的表达。结果低氧12 h ,HT‐29细胞分泌的MMP‐2／9活性逐渐上调,24 h达顶峰。在低氧的诱导下,HT‐29细胞核内NF‐κB的表达趋势与MMP‐2／9活性变化趋势基本一致。结论低氧能诱导 HT‐29细胞分泌高活性的 MMP‐2／9而促进其向恶性演进,可能与细胞核内 NF‐κB的表达上调有关。     

阿奇霉素经 TLR-4／NF-κB信号通路干预COPD大鼠炎症的机制研究

目的：探讨阿奇霉素通过TLR‐4／NF‐κB信号通路干预慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠炎症的机制。方法36只SD大鼠分为健康对照组、模型组、阿奇霉素组。模型组及阿奇霉素组采用烟熏联合气管内滴入脂多糖1个月建立COPD大鼠模型。阿奇霉素组烟熏前30 min给予50 mg／kg阿奇霉素灌胃,健康对照组及模型组给予等量生理盐水。1个月后,处死大鼠,苏木素‐伊红（HE）染色观察肺组织病理形态;ELISA法检测肺组织匀浆中肿瘤坏死因子‐α（TNF‐α）、IL‐1β、IL‐6水平;RT‐PCR检测Toll样受体4（TLR4）及核因子‐κB（NF‐κB）、磷酸化p65（pp65） mRNA表达;Western blot检测 TLR4、pp65、基质金属蛋白酶2（MMP‐2）及MMP‐9表达水平。并对大鼠支气管肺泡灌洗液进行细胞分类和计数。结果与模型组比较,阿奇霉素组能改善肺组织形态,降低中性粒细胞数（P＜0．01）,减少肺组织匀浆中 TNF‐α、IL‐1β、IL‐6、MMP‐2及MMP‐9的分泌（P＜0．01）,并抑制TLR4表达及pp65（P＜0．01）。结论阿奇霉素能通过TLR‐4／NF‐κB信号通路干预COPD大鼠炎症。     

熊果酸对喉癌 Hep-2细胞侵袭的影响及机制研究

目的：探讨熊果酸对人喉癌 Hep‐2细胞侵袭能力的影响及机制。方法不同浓度熊果酸处理人喉癌 Hep‐2细胞不同时间后,采用 M TT 法检测细胞的增殖活性,Boyden chamber 检测细胞的侵袭能力,Western blot 检测周期相关基因 NF‐κB蛋白表达的变化。明胶酶谱检测细胞培养上清液基质金属蛋白酶（MM P）‐9和 MMP‐2活性的变化。结果熊果酸对人喉癌Hep‐2细胞的生长具有明显的增殖抑制作用,其作用表现为剂量依赖性和时间依赖性（P＜0．01）。 Boyden chamber 结果显示以熊果酸处理 Hep‐2细胞后,侵袭能力呈浓度依赖性下降（P ＜0．01）。 Western blot 结果显示熊果酸对人喉癌 Hep‐2细胞 NF‐κB蛋白表达呈浓度依赖性下调（P＜0．01）。明胶酶谱结果显示熊果酸对人喉癌 Hep‐2细胞 MM P‐9和 MMP‐2活性呈浓度依赖性下调（P＜0．01）。结论熊果酸通过降低 MMP‐9和 MMP‐2活性及 NF‐κB 蛋白表达来抑制人喉癌 Hep‐2细胞的增殖和侵袭。     

miR-21对人喉鳞癌细胞Hep2迁移侵袭能力的影响

目的：探讨微小RNA‐21（miR‐21）对人喉鳞癌细胞Hep2迁移、侵袭能力的影响。方法用脂质体Lipofectami‐neTM2000将miR‐21抑制剂和miR‐21NC转入人喉鳞癌细胞Hep2中,48h后,运用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室法检测细胞侵袭能力,蛋白质印迹法检测人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（PTEN）／磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）／蛋白激酶B（Akt）的激活情况,以及基质金属蛋白酶（MMP）2、MMP9与伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白（RECK）的表达。结果与miR‐21NC比较,miR‐21抑制剂能明显降低Hep2细胞活力[（0．688±0．043）vs．（0．375±0．012）],抑制细胞迁移能力[（6．57±0．02）μmvs．（20．49±2．18）μm]及细胞侵袭能力[（100．7±10．2）vs．（46．8±4．3）],差异均有统计学意义（P＜0．01）;同时miR‐21抑制剂能明显下调PI3K、MMP2及MMP9的表达（P＜0．01）,降低Akt的磷酸化水平（P＜0．01）,并上调PTEN及RECK的表达（P＜0．01）。结论miR‐21抑制剂能明显抑制人喉鳞癌细胞Hep2的迁移、侵袭能力,可能与PTEN／PI3K／Akt信号通路有关。     

高迁移率蛋白B1对血管平滑肌细胞迁移的影响及分子机制研究

目的：探讨高迁移率蛋白B1（HMGB1）对血管平滑肌细胞（VSMCs）迁移的影响及 TLR4依赖的 TLR4／PI3K／Akt信号通路介导的分子机制。方法体外分离培养大鼠胸主动脉VSMCs ,采用不同浓度 HMGB1（0．1～1000．0 ng ／mL）处理,分为对照组（未经任何处理）、HMGB1组、HMGB1＋ TLR4 siRNA转染组、Control siRNA转染组和磷脂酰肌醇3‐激酶（PI3K）抑制剂（LY294002）干预组,观察各组细胞活性及 HMGB1对 VSMCs 迁移的影响;实时定量 RT‐PCR与 Western blot 分别检测TLR4、Akt、p‐Akt、PI3K mRNA和蛋白的表达;ELISA测定PI3K的活性。结果 HMGB1（0．1～1000．0 ng／mL）呈剂量依赖性促进VSMCs迁移（P＜ 0．05）;经细胞活性测定,HMGB1在使用的浓度范围内对 VSMCs未造成细胞毒性作用（P＜ 0．05）;HMGB1（100 ng／mL）处理的 VSMCs细胞组 PI3K 活性及 Akt磷酸化水平明显增加（P＜ 0．05）;经 TLR4 siRNA 转染发现, HMGB1引起的VSMCs迁移明显减弱（P＜0．05）,同样在PI3k抑制剂干预组,PI3K／Akt途径活化和HMGB1介导的VSMCs迁移也被明显抑制（P＜0．05）。结论 HMGB1呈剂量依赖性促进VSMCs迁移,TLR4依赖的 TLR4／PI3K／Akt信号通路参与了此过程,提示以TLR4依赖的PI3K／Akt途径为靶点,可为阻塞性血管疾病的治疗提供新思路。     

坎地沙坦抑制内毒素诱导的 VSM Cs 炎症因子释放的作用研究

目的：研究坎地沙坦对内毒素（LPS）诱导血管平滑肌细胞（VSMCs）炎症因子释放的影响,探讨 Toll 样受体4（TLR4）介导的信号通路在这一过程中的作用。方法原代培养大鼠 VSMCs ,四甲基偶氮唑蓝（M TT ）法测定不同浓度坎地沙坦对 VSMCs 活性的影响。将细胞分为5组：A 组（对照组）、B 组（LPS 干预组）、C 组（LPS ＋10－7 mol／L 坎地沙坦）、D 组（LPS ＋10－6 mol／L 坎地沙坦）和 E 组（LPS ＋10－5 mol／L 坎地沙坦）。实时定量 PCR 和 Western blot 测定各组细胞 TLR4、髓样分化因子88（Myd88） mRNA 和蛋白的表达、NF‐κB（p65）的核转位水平;ELISA 测定各组细胞上清液白细胞介素‐1β（IL‐1β）和肿瘤坏死因子‐α（TNF‐α）分泌水平;DCFH‐DA 氧化法测定细胞内活性氧（iROS）含量。使用 TLR4阻滞剂 TLR4抗体、NADPH 氧化酶阻滞剂二联苯基碘（DPI）、NF‐κB 阻滞剂 PDTC 或坎地沙坦与阻滞剂联用预处理细胞,ELISA 法测定 IL‐1β和 TNF‐α分泌水平。结果坎地沙坦在10－8～10－3 mol／L 浓度范围内对 VSMCs 活性没有显著影响。同对照组相比,坎地沙坦可以有效抑制 LPS 诱导VSMCs IL‐1β和 TNF‐α的释放,减少 TLR4、Myd88 mRNA 和蛋白的表达以及 iROS 的生成,抑制 NF‐κB（p65）的核转位,并具有剂量依赖性。 TLR4抗体、DPI 、PDTC 均能有效地抑制 LPS 诱导的炎症因子释放,坎地沙坦与阻滞剂联用显示出更强的抗炎作用。结论坎地沙坦能够减少 LPS 诱导的 VSMCs 炎症因子 IL‐1β和 TNF‐α的分泌,这一作用可能是通过抑制 TLR4／Myd88‐iROS‐NF‐κB 信号通路而实现的。     

Ripasudil对PDGF⁃BB诱导人肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的：研究Rho激酶抑制剂ripasudil对血小板源性生长因子（platelet?derived growth factor,PDGF）?BB诱导人肺动脉平滑肌细胞（human pulmonary arterial smooth cells,HPASMCs）增殖和迁移的影响及其相关机制。方法：培养HPASMCs,随机分为control组、PDGF?BB组、PDGF?BB+ripasudil组、ripasudil组。采用CCK?8法检测细胞活力;EdU掺入法检测HPASMCs增殖;Transwell实验检测HPASMCs迁移;Real?time PCR检测基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）?2 mRNA表达;Western blot检测MMP?2蛋白表达以及肌球蛋白磷酸酶目标亚基1（myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1）、细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellar regulated protein kinases 1/2,ERK1/2）、p38激酶和蛋白激酶B（protein kinase B,PKB/Akt）的磷酸化。结果：与control组相比,ripasudil能显著抑制PDGF?BB诱导HPASMCs增殖及迁移（P＜0.01）,降低MMP?2 mRNA及蛋白的表达（P＜0.05）,下调MYPT1、ERK1/2、p38及Akt的磷酸化（P＜0.05）。结论：Ripasudil抑制PDGF?BB诱导的HPASMCs增殖和迁移,可能与下调MYPT1、ERK1/2、p38及Akt的磷酸化有关。Ripasudil可能是治疗肺动脉高压的潜在药物。     

山茶花提取物抑制胶质瘤细胞SW1088增殖、迁移和侵袭的机制研究

目的 探究山茶花提取物通过调控miR-526b-3p的表达抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路抑制胶质瘤细胞SW1088增殖、迁移和侵袭的分子机制。方法 收集对数期SW1088细胞,用浓度为30、60、120 mg/L的山茶花提取物处理细胞,分别记为低剂量组、中剂量组、高剂量组,以正常培养SW1088细胞作为对照组;按照脂质体法将miR-NC、miR-526b-3p转染至SW1088细胞中分别记为miR-NC组、miR-526b-3p组;将anti-miR-NC、anti-miR-526b-3p转染至SW1088细胞中,并加入高剂量山茶花提取物分别记为anti-miR-NC+高剂量组、anti-miR-526b-3p+高剂量组。MTT、Transwell分别检测细胞增殖活性和细胞迁移、侵袭能力;Western blot检测细胞周期素D1（CyclinD1）、基质金属蛋白酶2（MMP2）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、磷酸化的PI3K（p-PI3K）、磷酸化的AKT（p-AKT）蛋白表达水平;qRT-PCR检测miR-526b-3p相对表达量。结果 山茶花提取物或过表达miR-526b-3p可降低胶质瘤细胞SW1088增殖活性,同时降低细胞迁移数量、侵袭数量,以及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平,增加miR-526b-3p相对表达量。此外,高剂量组可降低SW1088细胞中p-PI3K、p-AKT蛋白水平。抑制miR-526b-3p可减弱山茶花提取物对胶质瘤细胞SW1088增殖、迁移和侵袭以及PI3K/AKT信号通路的影响。结论 山茶花提取物可能通过调控miR-526b-3p/PI3K/AKT信号通路抑制胶质瘤细胞SW1088增殖、迁移和侵袭     

Ripasudil对PDGF-BB诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的：研究ripasudil对血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）-BB诱导人肺动脉平滑肌细胞（human pulmonary arterial smooth cells,HPASMCs）增殖和迁移的影响及其相关机制。方法：培养HPASMCs,随机分为control组、PDGF-BB组、PDGF+ripasudil组、ripasudil组。采用CCK-8法检测细胞活力;EdU掺入法检测HPASMCs增殖;Transwell实验检测HPASMCs迁移;Real Time PCR检测基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-2 mRNA表达;Western blot检测MMP-2蛋白表达以及肌球蛋白磷酸酶目标亚基1（myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1）、细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellar regulated protein kinases 1/2,ERK1/2）、p38激酶和蛋白激酶B（protein kinase B,PKB/Akt）的磷酸化。结果：与control组相比,ripasudil能显著抑制PDGF诱导HPASMCs增殖及迁移（P＜0.01）,降低MMP-2 mRNA及蛋白的表达（P＜0.05）,下调MYPT1、ERK1/2、p38及Akt的磷酸化（P＜0.05）。结论：Ripasudil抑制PDGF-BB诱导的HPASMCs增殖和迁移,可能与下调MYPT1、ERK1/2、p38及Akt的磷酸化有关。Rho激酶抑制剂ripasudil可能是治疗肺动脉高压的潜在药物。     

Wortmannin对表皮生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响

目的:研究PI3K抑制剂Wortmannin对表皮生长因子(EGF)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移及磷酸化Akt蛋白表达的影响,旨在探讨EGF诱导的VSMCs增殖和迁移的信号通路。方法:以低血清培养的VSMCs作为对照,采用细胞计数、划痕损伤实验和WesternBlotting技术,观察Wortmannin对EGF诱导的VSMCs增殖、迁移及磷酸化Akt蛋白表达的影响。结果:干预后24h,EGF组VSMCs增殖、迁移较对照组明显增强,同时磷酸化Akt蛋白的表达平行增高。而Wortmannin则明显抑制了VSMCs的增殖、迁移和磷酸化Akt蛋白的表达。结论:PI3K/Akt信号通路参与了EGF诱导的VSMCs增殖和迁移。     

醛糖还原酶抑制剂影响PDGF-BB促系膜细胞增殖作用的机制研究

目的探讨醛糖还原酶抑制剂（ARI）影响血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）促体外培养大鼠系膜细胞（MsC）增殖作用的机制。方法用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,对比PDGF-BB刺激MsC生长速度与MAPK3条信号通路（ERK、JNK及p38）抑制剂及PI3K信号通路抑制剂对PDGF促MsC增殖作用的影响。用半定量RT-PCR检测醛糖还原酶抑制剂（ARI）对MsC合成内源性PDGF-B链的影响。蛋白印迹法观察ARI对PDGF引起的信号通路磷酸化的影响。结果（1）ERK抑制剂U0126、JNK抑制剂SP600125及PI3K抑制剂LY294002能明显抑制PDGF对MsC的促增殖作用（P〈0.05）,而p38抑制剂SB203580不能抑制PDGF的促MsC增殖作用;（2）ARI在转录水平对MsC合成内源性PDGF-B链没有明显影响。（3）PDGF刺激MsC后引起ERK、JNK及PI3K/Akt信号通路的磷酸化,而ARI仅能抑制JNK及PI3K/Akt两条信号通路的磷酸化（P〈0.05）,对ERK信号通路的磷酸化没有明显影响。结论ARI部分抑制PDGF促MsC增殖作用可能与其影响JNK和PI3K/Akt信号通路活化有关。     

粉防己碱对人结直肠癌HCT116细胞株生物功能的影响及其机制

目的: 探究粉防己碱对人结直肠癌HCT116细胞株生物功能的影响及其可能机制。方法: 采用CCK-8检测粉防己碱对HCT116细胞活力的影响及其半数抑制浓度;用不同浓度粉防己碱(0、2.5、5和10 μmol/L)处理细胞,细胞集落形成实验检测细胞增殖;流式细胞术、线粒体膜电位检测技术和Hoechst 33342细胞核染色技术检测细胞凋亡;细胞迁移实验和划痕实验检测细胞迁移能力;蛋白印迹技术检测细胞上皮间质转化标志蛋白表达水平及PI3K/AKT/NF-κB信号通路中关键分子活化程度。结果： HCT116细胞活力随粉防己碱处理浓度增加而降低,粉防己碱半数抑制浓度为9.441 μmol/L;与0 μmol/L组相比,2.5、5和10 μmol/L粉防己碱组细胞形成集落数明显减少(P均<0.05);5、10 μmol/L粉防己碱组G0/G1期细胞比例增加,S期和G2/M期细胞比例下降,凋亡细胞比例增加(P均<0.05);2.5、5、10 μmol/L粉防己碱组细胞线粒体膜电位降低,细胞核荧光增强,迁移能力降低(P均<0.05);与0 μmol/L组相比,10 μmol/L粉防己碱组细胞多呈圆形,有更多上皮细胞形态;2.5、5和10 μmol/L粉防己碱组细胞上皮标志蛋白E-钙黏蛋白表达增加,而间充质标志物N-钙黏蛋白和波形蛋白表达减少,且PI3K/AKT/NF-κB信号通路中关键分子AKT和NF κB 的磷酸化水平降低(P均<0.05)。结论： 粉防己碱可能通过抑制PI3K/AKT/NF-κB 信号途径逆转HCT116细胞上皮间质转化,进而降低细胞增殖迁移能力,诱导其凋亡。     

基质细胞衍生因子-1α对间充质干细胞迁移的影响

［摘要］目的: 研究基质细胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α）对间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）迁移的影响及可能的机制。方法: 采用全骨髓法体外分离培养并扩增大鼠骨髓来源的MSCs,应用Boyden 趋化小室实验观察不同质量浓度（0,5,25,50和100 ng/mL）的SDF 1α对MSCs定向迁移的影响,通过蛋白质印迹法和Boyden趋化小室实验观察细胞内PI3K/Akt和MAPKs信号通路在MSCs向SDF-1α迁移过程中的变化。结果： 不同质量浓度的SDF-1α通过调节PI3K/Akt和MAPKs信号通路,不同程度上影响MSCs的趋化性迁移,低质量浓度的SDF-1α促进细胞迁移,而高质量浓度对细胞迁移起到抑制作用;阻断MSCs中基底水平PI3K/Akt和MAPKs信号通路在不同程度上抑制了MSCs趋向SDF-1α迁移作用。结论：MSCs向SDF 1α迁移能力随着PI3K/Akt信号的强弱而增减;JNK/SAPK信号的减弱显著抑制了SDF-1α诱导的MSCs定向迁移;SDF-1α可以促进细胞内ERK1/2和p38MAPK两条信号通路,而ERK1/2和p38MAPK信号对SDF-1α促进的细胞迁移影响并不显著。     

PD、SB对表皮生长因子诱导的大鼠VSMCS增殖及迁移的影响

目的:探讨ERK1/2抑制剂PD98059、p38MAPK抑制剂SB202190对表皮生长因子(EGF)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及迁移的影响。方法:实验分为对照组、EGF组、PD98059(PD)组、SB202190(SB)组。以低血清培养的VSMCs作为对照,采用细胞计数、划痕损伤实验,观察PD98059和SB202190对EGF诱导的VSMCs增殖及迁移的影响。结果:干预后24h,EGF组VSMCs增殖、迁移较对照组明显增强,加用PD98059和SB202190后,明显抑制了VSMCs的增殖和迁移。结论:EGF诱导的VSMCs增殖和迁移可能是通过p38MAPK和ERK1/2信号通路发挥作用。