大鼠肝纤维化进程中内质网应激相关蛋白的动态变化研究

目的探讨内质网应激(ERS)相关蛋白在大鼠肝纤维化形成与自发逆转过程中的作用。方法建立CCl4诱导大鼠肝纤维化模型,免疫组化法检测各组ERS标志性蛋白CHOP、GRP78的表达;RT-PCR法检测CHOP、GRP78 mRNA的表达;Western blot检测CHOP蛋白表达变化。结果与正常组大鼠相比,模型组大鼠CHOP、GRP78的表达显著升高(P<0.05)。与模型组相比,停止CCl4诱导4周和8周后CHOP、GRP78表达降低(P<0.05)。结论 ERS存在于大鼠肝纤维化进程中,可能与肝纤维化的发生、发展和逆转存在密切联系。     

糖脂清对糖尿病大鼠海马内质网应激相关因子GRP78、CHOP、Caspase-12表达的影响

目的 通过观察糖脂清对糖尿病大鼠海马组织的内质网应激相关因子GPR78、CHOP、Caspase-12的影响,探讨其在改善糖尿病大鼠认知功能的作用机制。方法 采用高糖高脂饲料联合小剂量链脲佐菌素腹腔注射复制2型糖尿病大鼠模型,并给予糖脂清高、中、低剂量组干预8周后,采用ELISA法检测血清空腹葡萄糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS）,计算稳态模型的胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、胰岛素敏感指数（ISI）;qPCR和Western blot法检测海马组织内质网应激相关因子GPR78、CHOP、Caspase-12的mRNA及蛋白表达水平。结果 糖脂清各剂量组均能够显著降低FPG及HOMA-IR（ P <0.01）,除低剂量组外,糖脂清均可显著提高ISI（ P <0.01）,3组FINS水平无显著性差异（ P >0.05）。与模型组比较,糖脂清低、中、高3个剂量组GRP78 mRNA和蛋白相对表达均显著增加,CHOP、Caspase-12 mRNA表达均减少（ P <0.01）,中、高剂量组CHOP、Caspase-12蛋白表达显著减少（ P <0.01）。结论 糖脂清能够控制血糖,改善胰岛素抵抗,增加胰岛素敏感性,同时能够调节海马内质网应激相关因子GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA和蛋白的表达。      

白藜芦醇通过内质网应激抑制心肌细胞肥大及凋亡

目的探讨白藜芦醇（resveratrol,Res）通过内质网应激介导心肌细胞肥大的作用机制。方法利用异丙肾上腺素（isoproterenol,ISO）建立心肌细胞肥大模型,Res干预后通过检测心肌细胞表面积和ANP基因表达评价心肌细胞肥大程度;检测各组心肌细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性和丙二醛（MDA）含量变化和心肌细胞凋亡率,Real time-PCR检测心肌细胞ERS相关基因GRP 78和CHOP表达。结果与ISO组比较,Res显著抑制ISO诱导的心肌细胞肥大（P〈0.05）,降低肥大心肌细胞LDH和MDA释放量（P〈0.05）;下调GRP78和CHOP基因表达（P〈0.05）,并抑制心肌细胞凋亡率（P〈0.05）。结论 Res对ISO诱导的心肌细胞肥大和凋亡具有保护作用,其机制是通过抑制内质网应激和CHOP介导的凋亡通路实现的。     

内质网应激在急性缺血性大鼠肾损伤中的作用

目的 研究大鼠肾脏内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)与急性缺血性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的关系.方法 30只雄性SD大鼠采用随机数字表法分为假手术组(n=6)和模型组(n=24),模型组下设缺血40 min再灌注1、6、12、24 h 4个时相点,每个时相点6只.采用自动生化分析仪检测大鼠血肌酐、尿素氮水平.采用PAS染色检测肾小管损伤情况,免疫组化技术检测肾组织ERS标志物GRP78蛋白表达.结果 ①血肌酐在缺血再灌注(ischemic/reperfusion,I/R)后1 h明显升高,12 h达高峰,24 h下降(P＜0.05).肾小管损伤评分在I/R后1 h升高,12 h达高峰,24 h下降(P＜0.05).②肾组织中GRP78蛋白表达在I/R后6 h升高达高峰,至12 h仍持续较高水平(P＜0.05),24 h时下降.③GRP78表达与肾小管损伤呈显著正相关性(r=0.671,P＜0.05),也与血肌酐水平呈显著正相关性(r=0.559,P＜0.05).结论 肾I/R启动了ERS,并且ERS与肾小管损伤、血肌酐水平呈正相关关系.ERS可能在AKI中起重要作用.     

内质网应激在脓毒症大鼠心肌损伤中的作用*

目的:研究内质网应激与脓毒症大鼠心肌损伤的关系.方法:35只雄性SD大鼠采用随机数字表法分为假手术组(n=7)和模型组(n=28),模型组下设2、6、12、24 h 四个时相点,每个时相点7只.采用自动生化分析仪检测大鼠血CK-MB及cTnI水平.采用HE染色检测心肌损伤情况,免疫组化技术检测心肌组织ERS标志物GRP78蛋白表达.结果:(1)模型组大鼠6、12、24 h血清CK-MB及cTnI均较对照组显著升高(P<0.05);各时相点病理改变明显;(2)心肌组织中GRP78蛋白表达在2 h即较对照组升高,并呈逐渐增加趋势(P<0.05);(3)GRP78表达与心肌损伤具有显著正相关(r=0.711,P<0.05).也与血清cTnI水平呈显著正相关(r=0.612,P<0.05).结论:脓毒症启动了ERS,并且ERS与心肌损伤、血cTnI水平呈正相关关系.ERS可能在脓毒症大鼠心肌损伤中起重要作用.     

小鼠卵巢内质网应激模型的建立及诱导凋亡的研究

目的通过观察内质网应激(ERS)诱导剂衣霉素(TM)及ERS抑制剂牛磺熊去氧胆酸钠(TUDCA)对ERS相关标识性蛋白表达水平的影响,建立小鼠卵巢ERS模型。方法取4周龄昆明白小鼠卵巢,进行半卵巢培养。实验分组:新鲜对照组,不同浓度TM诱导组(1、5、10、20、30μg·mL-1),TUDCA+TM组、不同浓度TUDCA(1、2、5、10mM)+TM组。通过免疫组织化学技术观测培养1h卵巢内内质网应激伴侣蛋白GRP78、培养3h后ERS凋亡相关蛋白CHOP的表达水平;TUNEL法检测培养3、6、12、24、36、48h后卵巢细胞凋亡情况。结果与新鲜组相比,TM诱导1h后卵巢发生内质网应激反应,TM浓度为5-10μg·mL-1时GRP78表达水平达到最高(P<0.05),之后随TM浓度增加缓慢递减;TM诱导3h后卵巢内ERS凋亡相关蛋白CHOP表达水平在TM 10μg·mL-1处达到最高(P<0.05),凋亡细胞数随着培养时间的延长增加。TUDCA抑制ERS实验显示,随着TUDCA浓度的增大,10μg·mL-1TM诱导的GRP78蛋白表达呈递减趋势,其中TUDCA 10mM组GRP78表达水平基本恢复到新鲜组水平。结论 TM可诱导小鼠卵巢ERS,5μg·mL-1为诱导ERS保护作用浓度,而10μg·mL-1以上则产生ERS途径介导的凋亡。TUDCA可抑制TM诱导的卵巢ERS。     

百草枯致大鼠肺纤维化肺组织内质网相关凋亡基因Caspase-12的表达

目的 观察内质网相关凋亡基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（ Caspase-12） 在百草枯诱导肺纤维化模型大鼠肺组织中的表达。方法 30 只Spragne-Dawley（ SD） 大鼠随机分为对照组、14 d模型组和28 d 模型组。采用百草枯灌胃法复制肺纤维化模型。逆转录-聚合酶链反应（ RT-PCR）检测肺内Caspase-12 mRNA 表达, 免疫组化检测其蛋白表达。HE 和Masson 染色判断肺组织肺泡炎及肺纤维化程度。结果 HE 和Masson 染色结果证实成功复制肺纤维化模型。模型组大鼠肺泡炎和肺纤维化程度较对照组严重（ P 〈0. 01） 。与对照组比较, Caspase-12 表达在14 d 模型组中明显升高（ P 〈0. 01） , 在28 d 模型组中更高（ P 〈 0. 01） 。结论 百草枯中毒大鼠肺内质网相关凋亡基因Caspase-12 表达增高, 提示内质网应激在百草枯中毒引起的肺纤维化中发挥重要作用。     

内质网应激与氧化应激在百草枯致大鼠肺纤维化中的作用

目的 探讨百草枯(PQ)中毒大鼠肺纤维化与内质网应激(ERS)的关系.方法 40只sprague-dawley(SD)大鼠按随机数字表法分为对照组(8只)和染毒组(32只),20％PQ溶液灌胃后分别于1、7、14、21 d处死大鼠取肺组织,每个时间点处死8只.苏木素-伊红(HE)染色和Masson染色观察肺组织病理变化;比色法检测肺组织丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)变化;免疫组织化学法检测肺组织中糖调节蛋白78(GRP78)表达情况.结果 HE和Masson染色结果证实成功复制肺纤维化模型;模型组大鼠肺泡炎和肺纤维化程度较对照组严重.染毒后ld肺组织MDA及GRP78蛋白表达均较对照组明显升高[MDA:(1.51±0.12) nmol/mg vs.(0.81±0.04) nmol/mg;GRP78:(14.25±6.36)vs.(3.18±1.02);P＜0.05,P＜0.01],GRP78蛋白表达于染毒后7d逐渐下降.而染毒组肺组织SOD活性在各时间点均较对照组降低(P＜0.05).结论 PQ中毒大鼠肺ERS标志性蛋白GRP78明显升高,表明ERS在PQ中毒后肺纤维中发挥一定的作用.     

子痫前期内质网应激相关蛋白CHOP/GADDl53的表达及其意义

目的:研究内质网应激相关蛋白CHOP/GADD153在子痫前期患者胎盘组织中的表达及其意义.方法:选择2009年6月～2010年6月在南京医科大学第一附属医院产科住院分娩的子痫前期患者30例(子痫前期组),以同期正常孕妇35例为对照组.采用RT-PCR技术、蛋向印迹(western-blot)法和免疫组化检测两组孕妇胎...     

硫化氢活化ERK抵抗内质网应激诱导的心肌细胞凋亡

目的探讨硫化氢(H2S)对心肌的保护作用是否通过激活细胞外信号调节激酶(ERK)通路来抵抗心肌缺血诱导的内质网应激所致的心肌细胞凋亡。方法 60只雄性SD大鼠随机分为对照组、ISO模型组、NaHS+ISO组及PD98059阻断组,每组各15只。对照组大鼠注射等体积生理盐水;ISO模型组大鼠第1、2天腹腔注射生理盐水,第3、4天注射完生理盐水30min后背部皮下分别注射10mg/kg和5mg/kg的ISO;NaHS+ISO组大鼠腹腔注射NaHS 14μmol/kg,1次/d,连续2d后,改为2次/d,连续2d,并在后2d的第1次注射30min后,于背部皮下分别注射10mg/kg和5mg/kg的ISO,1次/d;PD98059阻断组大鼠在上述NaHS+ISO组大鼠处理基础上,于注射ISO之前经尾静脉注射MEK/ERK抑制剂PD98059(4mg/kg),1次/d,连续2d。每组最后一次注射ISO并禁食12h后,检测心电图、心功能指标;测定血浆中H2S浓度变化;TTC染色测定心肌梗死面积;TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数(AI);免疫组织化学方法检测心肌中GRP78、CHOP及ERK磷酸化(p-ERK)蛋白的表达。结果 ISO模型组大鼠血浆的H2S含量明显低于对照组(P<0.01);14μmol/kg NaHS可以显著改善心肌缺血引起的心功能改变,而PD98059阻断组可以逆转NaHS的心肌保护作用;与ISO模型组相比,NaHS+ISO组大鼠心肌组织中GRP78、CHOP的表达明显减少(均P<0.05),pERK表达明显增多(P<0.01),AI、心肌梗死面积明显减小(均P<0.05);与NaHS+ISO组相比,PD98059阻断组大鼠心肌组织中GRP78、CHOP的表达、AI、梗死面积均显著增加(均P<0.05),心功能明显降低(P<0.05),而p-ERK无表达。相关分析显示大鼠心肌细胞CHOP表达、AI与p-ERK的表达呈负相关(P<0.01)。结论内源性H2S浓度的降低及内质网应激可能参与急性缺血心肌损伤的发生与发展,H2S对缺血损伤的心肌保护作用机制可能与其激活ERK进而抑制内质网应激诱导的心肌细胞凋亡有关。     

内质网应激标志性蛋白Caspase-12在四氯化碳诱导大鼠肝纤维化逆转恢复模型中的作用研究

目的：探讨内质网应激( ERS)标志性蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶12( Caspase-12)在大鼠肝纤维化形成与逆转恢复病程中的作用。方法建立四氯化碳( CCl4)诱导大鼠肝纤维化模型,苏木精-伊红染色和Masson胶原纤维染色观察肝脏病理组织学改变;免疫组化法检测肝组织肝纤维化标志性蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及钙激活蛋白酶( Calpain)的表达;Western blot检测不同时期肝脏组织中 Calpain、Cleaved-Caspase-12和 Cleaved-Caspase-3蛋白表达变化。结果肝脏病理组织学检测提示肝纤维化逆转恢复模型成功。免疫组化结果显示,与正常组比较,模型组大鼠肝脏组织中α-SMA和Calpain抗原阳性细胞明显增多、着色明显加深,且多分布在肝实质肝细胞区域。逆转恢复期,α-SMA抗原表达阳性细胞与模型组比较逐渐下降。Calpain抗原表达阳性细胞主要分布在肝脏的小叶中央静脉、汇管区、肝窦间隙等部位。 Western blot结果显示,模型组肝脏 Calpain、Cleaved-Caspase-12和 Cleaved-Caspase-3蛋白的表达与正常组相比显著升高。与模型组相比,逆转恢复2、4和8周组肝组织Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白的表达降低,但仍高于正常组。结论 ERS标志性蛋白Caspase-12诱导的细胞凋亡存在于大鼠肝纤维化病程中,可能与肝纤维化的发生、发展和恢复逆转密切相关。     

内质网应激与氧化应激在肺纤维化中的作用及中药丹芍化纤胶囊对它的影响

目的:观察内质网应激标志蛋白GRP78和氧化应激指标在博来霉素诱导的肺纤维化中的变化及中药丹芍化纤胶囊对它的影响。方法:选取SD大鼠30只,随机分为正常对照组(正常组)、肺纤维化模型组(模型组)和丹芍化纤胶囊治疗组(丹芍组),每组各10只。正常对照组气管内滴注生理盐水,模型组和丹芍组气管内一次性灌注博来霉素5 mg/kg诱导肺纤维化,丹芍组于造模第2天给予丹芍化纤胶囊混悬液灌胃0.8 g/(kg.d)治疗,正常组及模型组则给予等量生理盐水灌胃。实验第28天称大鼠体重,处死各组大鼠,称肺湿重并收集肺组织,行HE和Masson染色观察肺组织病理变化;比色法检测肺组织MDA及SOD变化;采用免疫组织化学方法检测肺组织中GRP78蛋白的表达情况。结果:①与正常组比较,模型组大鼠肺组织中MDA含量及GRP78表达明显升高,而SOD酶活性则显著下降。②与模型组比较,丹芍组大鼠肺组织中MDA含量及GRP78蛋白表达明显降低,但仍较正常组高;SOD酶活性显著回升,但未恢复正常水平。结论:丹芍化纤胶囊可在一定程度上减轻博来霉素诱导的肺泡炎症反应及肺纤维化进展,对肺纤维化具有一定的治疗作用。丹芍化纤胶囊对肺纤维化的干预机制可能与...     

小檗碱调控内质网应激水平影响UC结肠炎症反应的实验研究

目的从内质网应激（ERS）角度探讨小檗碱（BBR）缓解溃疡性结肠炎（UC）结肠炎症反应的作用机制。方法60只BALB/c小鼠按随机数字表法分为空白对照组、模型对照组和BBR低、中、高剂量组,每组12只。制备右旋葡聚糖硫酸钠诱导的UC小鼠模型,BBR低、中、高剂量组造模同时给予BBR混悬液灌胃7d。观察5组小鼠一般情况并评估疾病活动指数（DAI）;末次给药后取小鼠结肠病变部位标本,进行组织病理学评价;TUNEL法检测结肠组织肠上皮细胞（IECs）的凋亡情况;免疫组化法检测结肠组织中GRP78、Caspase-12和Caspase-3蛋白的表达水平;荧光定量PCR法检测结肠组织GRP78mRNA的表达水平。结果与模型对照组比较,BBR低、中、高剂量组小鼠结肠炎的临床症状和组织病理学损伤均有明显减轻。与空白对照组比较,模型对照组结肠组织IECs凋亡数明显增多,GRP78、Caspase-12和Caspase-3蛋白表达水平明显升高,GRP78mRNA的表达亦上调。而与模型对照组比较,BBR低、中、高剂量组小鼠结肠组织IECs凋亡数明显下降,BBR高剂量组小鼠结肠组织GRP78、Caspase-12、Caspase-3蛋白表达水平与GRP78mRNA的表达水平均下调。结论BBR能有效减轻UC小鼠的结肠炎症,其机制可能与下调ERS水平,抑制ERS介导的Caspase-12/Caspase-3凋亡信号通路活化有关。     

内质网应激在肝细胞凋亡中的意义

目的:探讨内质网应激在肝细胞凋亡中的意义。方法:原位二步灌流法分离并培养BALBC小鼠原代肝细胞,化学合成法制备抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12小分子干扰RNA(caspase-12 siRNA),脂质体包裹转染小鼠原代肝细胞。毒胡萝卜内酯4μmol/L诱导肝细胞凋亡。RT-PCR、Western blot检测抑制效果;MTT比色试验检测细胞活力,反映细胞凋亡。结果:siRNA对小鼠原代肝细胞caspase-12 mRNA在浓度200nmol/L时抑制率为86.22%;对凋亡细胞procaspase-12抑制率为50.04%,与单纯诱导凋亡细胞差异有统计学意义(P<0.01);MTT比色试验检测发现,与单纯诱导凋亡细胞相比,转染siRNA后细胞活力增高51.65%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论:抑制内质网应激介导细胞凋亡的特异酶caspase-12,能在一定程度上阻抑小鼠原代肝细胞凋亡的发生,内质网应激在肝细胞凋亡中具有重要意义。     

离体大鼠心肌内质网应激模型构建条件的优化

目的： 探讨构建体外心肌内质网应激endoplasmic reticulum stress (ERS)模型的方法及实验条件。方法：应用Langendorrf 灌流装置制作大鼠心脏离体缺血/再灌注模型,采用PowerLab系统持续监测血流动力学参数,western-blot检测缺血（停止灌流）不同时间/再灌注120min后心肌ERS标志性分子糖调节蛋白（GRP）78的表达,并检测C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测二者mRNA的表达;体外孵育心肌组织切片,分别应用不同浓度的衣霉素(tunicamycin, Tm)和二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)处理3h和6h,western-blot检测心肌GRP78及CHOP的表达。结果：与对照组相比,离体灌注心脏缺血40min /再灌注120min时,心肌GRP78表达最高（P <0.01）,CHOP蛋白、GRP78mRNA及CHOPmRNA表达均明显升高（P <0.01,P <0.05和P <0.05）同时,各项血流动力学参数受损（均P < 0.01）;Tm10μg/mL和DTT 2mmol/L孵育心肌组织切片3h时,GRP78表达较对照组显著升高（均P <0.001）,CHOP表达亦均明显升高（P <0.05和P <0.01）。结论：使用离体大鼠心脏缺血/再灌注和孵育心肌组织切片的方法,均可成功构建体外心肌ERS模型。     

内质网应激相关因子PERK和ATF6在结肠癌中的表达及意义

目的 探讨内质网应激相关因子蛋白激酶R样内质网调节激酶(PERK)和活化转录因子6(ATF6)在结直肠癌组织中的表达情况,分析PERK和ATF6在结肠癌发生发展中的作用.方法 选择手术切除结肠癌组织及距离病变组织5 cm以上正常组织,采用实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)检测PERK和ATF6的mRNA表达情况,免疫组织化学法(IHC)、Western blot法检测PERK和ATF6蛋白的表达情况,并结合临床病理特征,分析其与结肠癌发生、发展之间的关系.结果 肿瘤组织ATF6和PERK mRNA表达均较正常组织下调(P＜0.05).IHC和Western blot结果显示PERK和ATF6在结肠癌中的表达均显著低于正常组织(P＜0.05).PERK和ATF6主要定位于上皮细胞中.结论 PERK和ATF6在结肠癌中的表达水平下降说明缺乏适当的内质网应激反应可能在肿瘤的发生机制中起作用.     

粉防己碱治疗肺纤维化作用机制及应用进展

肺纤维化(PF)是各种间质性肺疾病晚期的共同结局,目前尚没有有效的治疗方法。粉防己碱为汉防己的主要有效成分之一,在矽肺的治疗方面已经显示出良好的抗纤维化作用,且价格低廉、不良反应少。本文通过复习文献,总结了粉防己碱抗纤维化的主要作用机制包括:抑制炎症反应、改善氧化应激、影响细胞凋亡、干预转化生长因子β(TGF-β)的表达;并对近年来粉防己碱治疗特发性PF的临床报道进行介绍,为粉防己碱治疗特发性PF的临床应用提供理论依据。     

特发性肺间质纤维化合并肺癌25例临床分析

目的探讨特发性肺间质纤维化合并肺癌的临床特征。方法对我科2008—01～2013—03诊断的特发性肺间质纤维化合并肺癌患者25例的临床表现、胸部CT、病理等临床资料进行回顾性分析,总结其特征。结果25例患者中男23例,女2例,平均（65．6±5．2）岁。24例吸烟患者平均吸烟40．5包／年。25例患者均表现为非特异性呼吸道症状及肺部Vel—ero哕音和杵状指（趾）。胸部CT表现为在双肺网格、蜂窝样基础上出现肺部团块、结节影（22／25）,及肺纤维化基础上出现斑片状阴影（3／25）。病理上多为腺癌及鳞癌。肺功能及血气分析为限制性通气功能障碍、弥散功能减低及低氧血症。部分患者肿瘤标志增高。结论老年男性患者,有长期吸烟史,在原有肺间质纤维化基础上出现新症状或原有症状加重,肺部出现团块、结节影或斑片阴影,要高度警惕特发性肺间质纤维化合并肺癌的可能,积极行痰病理、经皮肺活检检查,明确诊断。