淡色库蚊抗性相关基因--NYD-GBE基因的克隆与分析

目的:获取淡色库蚊抗药性相关NYD-GBE基因cDNA全长序列并验证其在抗性品系和敏感品系中的表达差异。方法:根据抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片分离获得的淡色库蚊抗性相关NYD-GBE基因片段设计引物,采用快速扩增cDNA末端法(rapidamplificationofcDNAends,RACE)扩增糖原分支酶基因5′、3′端,经对位拼接获得全长序列,并用相应的软件进行生物信息学分析。结果:获得淡色库蚊NYD-GBEcDNA全长序列,开放阅读框为2070bp(GeneBank/NCBIDQ102393),编码689个氨基酸。蛋白质序列分析显示,NYD-GBE与冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)和拟暗果蝇(Drosophilapseudoobscura)一个未知功能的蛋白同源性最高,为82%和72%,与人糖原分支酶的基因同源性次之为60%。荧光定量PCR结果显示,NYD-GBE在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中的表达量是敏感品系的19.7倍。结论:获得淡色库蚊抗药性相关NYD-GBE基因全长cDNA序列,并证实其在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中高表达,提示NYD-GBE与淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关,值得进一步研究。     

用荧光半定量RT-PCR检测蚊溴氰菊酯抗性

目的:建立蚊对菊酯类杀虫剂抗性的PCR检测方法。方法:应用荧光半定量RT鄄PCR,检测经SSH结合cDNA芯片分离鉴定的淡色库蚊对溴氰菊酯抗性相关基因NYD鄄Tr在抗性品系与敏感品系中的表达水平。结果:经荧光半定量RT鄄PCR检测,NYD鄄Tr进入指数期的循环数抗性品系早于敏感品系,抗性品系组比敏感品系组先进入指数增长期。结论:以NYD鄄Tr作为靶基因,荧光半定量RT鄄PCR可区分淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系与敏感品系,亦即可检测淡色库蚊溴氰菊酯抗性。     

转铁蛋白基因在三种淡色库蚊体内表达量的比较分析

目的进行不同品系蚊转铁蛋白基因表达量的分析。方法据二维电泳获得肽段序列设计引物扩增基因片段,荧光定量PCR检测在淡色库蚊抗性品系品系、敏感品系、现场采集品系蚊体内的表达水平差异。结果成功扩增淡色库蚊转铁蛋白基因片段,荧光定量PCR表明转铁蛋白基因在抗性品系蚊体内的表达量是敏感品系的13.52倍,现场品系是敏感品系的7.48倍。结论淡色库蚊转铁蛋白基因可做为新的抗性检测及治理基因靶标。     

铁反应元件结合蛋白2基因在抗性及敏感品系淡色库蚊中表达量的分析

目的 进行不同品系的蚊中铁反应元件结合蛋白2(IREBP2)基因表达量的分析.方法 根据二维电泳获得的肽段序列,设计引物扩增基因片段,荧光定量PCR检测在抗性及敏感品系蚊的表达水平差异.结果 成功扩增淡色库蚊IREBP2基因的片段,荧光定量PCR表明IREBP2基因在抗性品系中的表达量是敏感品系的10.27倍.结论 淡色库蚊的IREBP2基因可做为新的抗性检测及治理的基因靶标.     

IRE-BP 1基因在三种淡色库蚊体内表达量的比较分析

目的进行不同品系淡色库蚊铁离子应答元件结合蛋白1基因表达量的分析。方法据二维电泳获得肽段序列设计引物扩增基因片段,荧光定量PCR检测在淡色库蚊抗性品系、敏感品系、现场采集品系蚊体内的表达水平差异。结果成功扩增淡色库蚊铁离子应答元件结合蛋白1基因片段,荧光定量PCR表明该基因在抗性品系蚊体内的表达量是敏感品系的8.22倍,现场品系是敏感品系的5.17倍。结论淡色库蚊铁离子应答元件结合蛋白1基因可做为新的抗性检测及治理基因靶标。     

淡色库蚊抗药性相关新基因--视蛋白基因的克隆与分析

目的:获取淡色库蚊抗药性相关视蛋白基因(NYD鄄OP)全长cDNA序列。方法:根据抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片分离获得的淡色库蚊抗药性相关视蛋白基因的289bp片段,设计上、下游引物,分别以cDNA文库和反转录二链产物为模板,采用快速扩增cDNA末端法(rapidamplificationofcDNAend,RACE)扩增视蛋白基因5'、3'端,经对位拼接获得全长序列,并用相应的软件进行分析。结果:获得6个淡色库蚊视蛋白基因全长序列,开放阅读框分别为1116bp(GeneBank/NCBIAY297441,AY297442)及1119bp(GeneBank/NCBIAY297443,AY297444,AY299337,AY299338),以上序列经推导分别编码371及372个氨基酸。进行蛋白质序列分析,与烟草天蛾视蛋白的同源性是77%。结论:获得6个淡色库蚊抗药性相关视蛋白基因全长cDNA序列。     

抗药性相关糜蛋白酶基因真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建抗药性相关基因真核表达载体。方法：采用PCR方法，以淡色库蚊抗药性品系cDNA文库为模板，扩增出抗药性品系中高表达糜蛋白酶(chymotrypsin)基因，经T／A克隆测序鉴定后，扩增、纯化质粒，经双酶切后纯化目的片段，克隆到真核荧光表达载体pEGFP—C3中。结果：PCR和酶切鉴定表明，构建成功真核荧光表达载体pEGEP—C3／chymotrypsino结论：PCR加双酶切鉴定的方法构建表达质粒，迅速省时，结果可靠。     

淡色库蚊对溴氰菊酯抗性和敏感品系差异表达蛋白的研究

目的：获取淡色库蚊对溴氰菊酯敏感和抗性品系的差异表达蛋白,为蚊虫抗药性分子机理的深入研究奠定基础。方法：应用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）获取敏感和抗性蚊虫水溶性蛋白的电泳谱,并用Labworks^TM分析软件对电泳结果进行分析。结果：淡色库蚊对溴氰菊酯敏感和抗性品系表达蛋白间存在质和量的差异,其中,敏感品系4龄幼虫较抗性品系有1条分子质量为60．3ku的特异带。敏感品系雌性成蚊有1条分子质量为36．1ku的特异带,而抗性品系则有分子质量为97．2ku和36．9ku的2条特异带,在蛋白表达量的差异方面,共有8条蛋白带存在2倍以上的差异。结论：这些质和量的差异表达蛋白可能与淡色库蚊对溴氰菊酯的抗药性有关。     

糖原分支酶基因体外增强淡色库蚊抗药性的研究

目的构建淡色库蚊糖原分支酶基因(GBE)的昆虫表达载体,通过细胞转染法鉴定其与蚊虫抗药性相关的关系。方法用基因重组方法构建GBE的昆虫表达载体;通过脂质体转染法将昆虫表达载体转入伊蚊C6/36细胞,继而通过观察细胞形态及3H TdR掺入法检测稳定表达GBE基因的细胞对溴氰菊酯杀虫剂的敏感性。结果成功构建GBE基因的昆虫表达载体同时通过筛选获得稳定表达该基因的细胞株。3H TdR掺入法结果显示转染GBE基因能够提高细胞的存活率,并与对照组差异有显著性(P<0.05)。结论 GBE基因在与淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关,且其在细胞对抗溴氰菊酯的毒性作用中有保护作用。     

绍兴市淡色库蚊对5种杀虫剂的抗药性现状调查

采用浸渍法测定绍兴市淡色库蚊对常用杀虫剂的抗药性,结果显示:该市淡色库蚊对敌敌畏、三氯杀虫酯、仲丁威、二氯苯醚菊酯、溴氰菊酯已产生抗性,与敏感品系比较;抗性倍数分别为8.95倍、7.45倍、1.56倍、1.75倍、1.92倍,以敌敌畏的抗性最高。     

山东省城镇地区淡色库蚊抗药性的研究

目的:调查山东省城镇地区淡色库蚊对常用杀虫剂的抗性,研究抗性产生的规律。方法:用WHO生物测定法,测定敏感品系和现场淡色库蚊?V龄幼虫对杀虫剂的敏感性/抗性。结果:我省主要蚊虫抗药程度高,分布范围广。主要蚊虫对常用的杀虫剂均产生了不同程度的抗性,对DDVP的抗性在6.10～21.18倍之间,对溴氰菊酯抗性在8～42倍之间,对残杀威的抗性在3.46～6.64倍之间。部分地区的抗性水平有逐年增高的趋势。结论:加强抗性的监测和治理工作具有非常紧迫的意义。     

山东省城镇地区淡色库蚊抗药性的研究

目的:调查山东省城镇地区淡色库蚊对常用杀虫剂的抗性,研究抗性产生的规律。方法:用WHO生物测定法,测定敏感品系和现场淡色库蚊ⅠⅤ龄幼虫对杀虫剂的敏感性/抗性。结果:我省主要蚊虫抗药程度高,分布范围广。主要蚊虫对常用的杀虫剂均产生了不同程度的抗性,对DDVP的抗性在6.10-21.18倍之间,对溴氰菊酯抗性在8-42倍之间.对残杀威的抗性在3.46-6.64倍之间。部分地区的抗性水平有逐年增高的趋势。结论:加强抗性的监测和治理工作具有非常紧迫的意义。     

三种抗性品系淡色库蚊对五种杀虫剂的交互抗性

目的了解淡色库蚊对化学杀虫剂的交互抗性,为合理有效地进行蚊虫化学防治提供依据。方法采用WHO生物测定方法测定3种抗性品系淡色库蚊对5种杀虫剂的抗性。结果DDVP抗性品系淡色库蚊抗性水平为8．38倍,对氯氰菊酯、三氯杀虫酯、残杀威和溴氰菊酯的抗性分别为52．50倍、7．61倍、4．74倍和0．75倍;残杀威抗性品系淡色库蚊抗性水平为11．34倍,对氯氰菊酯、DDVP、三氯杀虫酯和溴氰菊酯的抗性分别为8．08倍、2．85倍、2．00倍和1．80倍;氯氰菊酯抗性品系淡色库蚊抗性水平为243．00倍,对溴氰菊酯、三氯杀虫酯、残杀威和DDVP的抗性分别为28．90倍、17．28倍、1．49倍和1．38倍。结论蚊虫对某种杀虫剂产生抗性后,可能对其它杀虫剂也产生不同的交互抗性,用药前应作抗性测定,注意选择药物品种和确定使用剂量。     

高通量测序筛选结核分枝杆菌耐药株差异基因

目的比较结核分枝杆菌中敏感株、多耐药株、广泛耐药株三者间基因表达的差异,为进一步针对耐药菌株的研究提供方向。方法从深圳市第三人民医院收集敏感株、多耐药株、广泛耐药株各1株,提取菌株RNA,然后构建cDNA文库,使用Genome Analyzer IIx高通量测序仪进行全基因组测序,经过筛选比对后得到测序结果 ,再比较3个菌株间的基因表达差异。结果高通量测序后共得到基因3 968个。将耐药株与敏感株的基因进行比较,选取表达差异高于10倍的基因,筛选得到多耐药株差异基因16个、广泛耐药株差异基因10个。这些表达差异基因大部分与毒素-抗毒素系统、PE/PPE家族蛋白、金属转运蛋白相关。还在多耐药株中发现了一系列高表达的前噬菌体基因及噬菌体整合相关的基因。结论通过高通量测序筛选得到一系列耐药株差异表达基因,为未来对耐药菌株的研究提供依据。     

上海市杨浦区淡色库蚊对4种常用杀虫剂的抗性调查

目的了解杨浦区淡色库蚊4种常用杀虫剂的抗性水平,制定科学的蚊虫控制策略。方法采用WHO推荐使用的生物测试法（浸渍法）测试Ⅲ龄末Ⅳ龄初幼虫的半数致死中浓度。结果杨浦区淡色库蚊对氯菊酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、双硫磷抗性倍数分别为60．14、6．49、5．29和3．59。结论杨浦区淡色库蚊对4种常用杀虫剂均产生了不同程度的抗性,其中对氯菊酯产生了高抗性,对其余3种为低抗性。加强抗性监测及治理,停用高抗性杀虫剂以及防止或延缓抗性产生和发展的一切措施均是杨浦区蚊虫防制的必要手段。     

单县淡色库蚊对常用杀虫剂的抗药性调查

目的了解山东省单县淡色库蚊对常用5种化学杀虫剂的抗性状况,为合理有效地进行蚊虫化学防制提供依据。方法采用WHO生物测定方法,测定2012~2013年淡色库蚊敏感品系和现场种群对5种杀虫剂的抗性及增效系数。结果现场淡色库蚊种群对氯氰菊酯、残杀威、溴氰菊酯、三氯杀虫酯、DDVP的抗性指数,2011年分别为395.60、3.20、238.33、4.24和8.27倍,2012年分别为339.30、2.70、254.00、4.01和7.19倍。DDVP+三氯杀虫酯、残杀威+三氯杀虫酯复配增效系数分别为160.27~173.82和190.22~230.47。结论单县境内淡色库蚊对5种常用化学杀虫剂均产生不同程度的抗药性,应采取多种杀虫剂复配和增效剂与杀虫剂合用措施,以克服或延缓蚊虫抗药性的产生和发展。