脐血CD34+细胞向内皮细胞定向诱导分化的实验研究

目的探讨人脐血CD34+细胞体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型.方法采集新鲜脐血经抗凝处理及无菌包装,Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,磁珠分选方法(MACS)分离出CD34+单个核细胞,M-199培养基中诱导分化,细胞形态学观察CD34+和CD34-细胞生长情况,流式细胞仪检测内皮细胞CD31表型,免疫组化验证蛋白水平表达.结果细胞形态学观察发现,刚分离的CD34+ 和CD34-单个核细胞呈圆形,形态小.CD34+细胞培养3 d后有明显集落形成,7 d后呈梭行细胞,出现典型线样排列结构.经诱导培养后,内皮细胞表型CD31阳性率为(70.03±10.27)%.免疫组化染色证实了内皮特异性成分ecNOS和flk-1/KDR蛋白水平的表达.而CD34-细胞单独培养,少部分细胞贴壁,呈现出不规则形态.结论 MACS法分离脐血CD34+细胞,体外诱导扩增和分化后贴壁细胞具有内皮细胞形态,通过流式细胞仪和免疫组化验证了贴壁细胞中大部分细胞具有内皮系标志物表达.     

脐血CD34+细胞向内皮细胞定向诱导分化的实验研究

目的探讨人脐血CD34 细胞体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型。方法采集新鲜脐血经抗凝处理及无菌包装,Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,磁珠分选方法(MACS)分离出CD34 单个核细胞,M-199培养基中诱导分化,细胞形态学观察CD34 和CD34-细胞生长情况,流式细胞仪检测内皮细胞CD31表型,免疫组化验证蛋白水平表达。结果细胞形态学观察发现,刚分离的CD34 和CD34-单个核细胞呈圆形,形态小。CD34 细胞培养3d后有明显集落形成,7d后呈梭行细胞,出现典型线样排列结构。经诱导培养后,内皮细胞表型CD31阳性率为(70.03±10.27)%。免疫组化染色证实了内皮特异性成分ecNOS和flk-1/KDR蛋白水平的表达。而CD34-细胞单独培养,少部分细胞贴壁,呈现出不规则形态。结论MACS法分离脐血CD34 细胞,体外诱导扩增和分化后贴壁细胞具有内皮细胞形态,通过流式细胞仪和免疫组化验证了贴壁细胞中大部分细胞具有内皮系标志物表达。     

小径聚氨酯人工血管内皮化种子细胞的体外诱导分化及种植

[目的]探讨体外诱导骨髓单个核细胞分化成为内皮祖细胞,为小径聚氨酯人工血管内皮化提供合适的种子细胞的可行性.[方法]收集健康成人骨髓单个核细胞,置于纤维连接蛋白预衬的DMEM培养基中,用血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor,bFGF)加以诱导,通过荧光显微镜和免疫组化分析等方法观察和鉴定诱导后的细胞.将诱导分化的内皮祖细胞种植到聚氨酯小径人工血管表面,用扫描电镜观察.[结果]在VEGF、bFGF等诱导因子存在的条件下,骨髓单个核细胞分化成为内皮祖细胞,倒置荧光显微镜下呈典形的"纺锤样"梭形细胞,单层细胞贴壁生长融合时呈铺路石样排列,免疫组化示VWF和CD34抗体染色阳性.扫描电镜下,未种植细胞的聚氨酯小径人工血管表面呈典型的多孔蜂窝状结构,孔径大小比较适合内皮祖细胞爬行.种植细胞后,聚氨酯小径人工血管表面有大量的内皮祖细胞黏附、爬行及铺展生长,有时可见内皮祖细胞长入蜂窝状孔径内.[结论]体外诱导骨髓单个核细胞分化为内皮祖细胞可作为小径聚氨酯人工血管内皮化的种子细胞.     

小径聚氨酯人工血管内皮化种子细胞的体外诱导分化及种植

[目的]探讨体外诱导骨髓单个核细胞分化成为内皮祖细胞，为小径聚氨酯人工血管内皮化提供合适的种子细胞的可行性。[方法]收集健康成人骨髓单个核细胞，置于纤维连接蛋白预衬的DMEM培养基中，用血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)加以诱导，通过荧光显微镜和免疫组化分析等方法观察和鉴定诱导后的细胞。将诱导分化的内皮祖细胞种植到聚氨酯小径人工血管表面，用扫描电镜观察。[结果]在VEGF、bFGF等诱导因子存在的条件下，骨髓单个核细胞分化成为内皮祖细胞，倒置荧光显微镜下呈典形的“纺锤样”梭形细胞，单层细胞贴壁生长融合时呈铺路石样排列，免疫组化示VWF和CD34抗体染色阳性。扫描电镜下，未种植细胞的聚氨酯小径人工血管表面呈典型的多孔蜂窝状结构，孔径大小比较适合内皮祖细胞爬行。种植细胞后，聚氨酯小径人工血管表面有大量的内皮祖细胞黏附、爬行及铺展生长，有时可见内皮祖细胞长入蜂窝状孔径内。[结论]体外诱导骨髓单个核细胞分化为内皮祖细胞可作为小径聚氨酯人工血管内皮化的种子细胞。     

VEGF121转染对诱导后血管内皮细胞增殖的影响

目的 探讨VEGF基因转染对VEGF诱导后血管内皮细胞生物学功能的影响,为组织工程血管构建提供血管内皮细胞的可能性.方法 应用VEGF体外诱导兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化成血管内皮细胞后,再通过脂质体介导的方法将pCDI/VEGF121转染分化后的血管内皮细胞,通过MTT及流式细胞仪检测转染前后细胞的增殖与凋亡能力.结果 诱导培养2周后兔骨髓基质细胞转化为血管内皮细胞,VEGF基因转染血管内皮细胞后表达VEGF蛋白,转染后细胞增殖能力增加,凋亡能力下降.结论 转染VEGF是促进VEGF诱导血管内皮细胞增殖的有效途径,可望为组织工程血管构建提供血管内皮细胞衬层,为人工血管内皮化开辟一种新的途径.     

人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向血管内皮细胞（ECs）诱导分化的可行性。方法：用贴壁法从成人骨髓中分离出间充质干细胞,培养扩增后,加入10ng／ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和人血管内皮生长因子（hVEGF）向ECs诱导分化,分别于0、24d流式细胞术检测细胞表型及荧光染色鉴定细胞。结果：hMSCs向ECs诱导分化24d,细胞CD34、KDR转为阳性,CD54、CD106、vWF表达增加。可摄取ac—LDL,并可结合UEA。结论：hMSCs经bFGF和VEGF作用,分化为具有ECs的表型和部分功能的细胞。     

冻存对血管内皮干细胞增殖和分化能力的影响

目的探讨冻存对人脐血来源血管内皮干细胞(EPCs)增殖、分化能力的影响。方法采用密度梯度离心法结合MACS分选法提取人脐血中CD133 细胞,进行流式细胞仪检测纯度;将EPCs冻存3,6,12,18个月后进行常规培养、诱导分化,利用细胞免疫组化进行鉴定,并比较不同冻存时间的EPCs的增殖能力。结果经流式细胞仪检测CD133 细胞平均占单核细胞的(1.13±0.10)%,磁珠分选所得CD133 细胞平均纯度为(91.45±1.04)%;CD133 细胞贴壁生长,可分化为梭形血管内皮细胞及形成集落,经免疫组化检测大部分表达CD34和Ⅷ因子;冻存3,6,12,18个月后,EPCs的增殖、分化能力有所下降。结论长时间的冻存可减弱EPCs的增殖、分化能力。     

间充质干细胞定向诱导为内皮细胞的体外研究

目的:为寻找心血管组织工程新的种子细胞来源,探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力.方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,并体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)的诱导分化培养液定向诱导传代使其向血管内皮细胞方向分化,观察细胞形态的变化,检测内皮细胞特异性标志物的表达.结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后细胞具有内皮细胞的形态学特征,并表达内皮细胞特异性标志物CD31.结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化.     

用骨髓基质干细胞分化的内皮细胞体外构建组织工程心脏瓣膜

目的:探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化产生的内皮细胞和去细胞异种天然瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性.方法:以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养绵羊原代BMSCs,并以VEGF诱导BMSCs向内皮细胞分化.采用去污剂和酶消化法制作去细胞猪主动脉瓣支架,通过静态种植方法构建TEHV.经H-E染色、免疫组化、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学和超微结构.结果:诱导分化产生的内皮细胞在去细胞瓣叶支架及整体瓣膜支架上呈单层生长,形成完整的内皮细胞单层.瓣叶表面细胞呈梭形, CD34及Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色阳性.结论:BMSCs诱导分化产生的内皮细胞具有与成熟内皮细胞相同的生物学特性.采用BMSCs诱导分化内皮细胞构建TEHV更为简便可行.     

骨髓间充质干细胞体外可定向诱导为内皮细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,免疫荧光及免疫组化检测内皮细胞特异性标志物鉴定。结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征可表达CD31及Ⅷ因子。结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。     

VEGF,b-FGF诱导人脐血单个核细胞向血管内皮祖细胞分化的研究

目的:研究VEGF, b-FGF诱导下人脐血单个核细胞向血管内皮祖细胞(EPCs)分化.方法:从新鲜脐血中用Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在加有VEGF,bFGF的M199培养基中培养,培养7 d,免疫组化(SABC法)和免疫荧光检测细胞表面抗原的表达.结果:人脐血血单个核细胞(MNCs)经体外VEGF, b-FGF的诱导分化,表达内皮祖细胞的表面标志KDR, CD1133和CD34.结论:人脐血单个核细胞在一定的培养条件下可诱导分化为内皮祖细胞.     

成人脂肪源间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用

目的：研究人脂肪间充质干细胞培养上清对人脐带血（HUCB）中所含有间充质干细胞（MSCs）的影响。方法：取脐带血,肝素抗凝,Percoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,低糖DMEM培养获得贴壁细胞层。与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育。流式细胞仪检测表面抗原。结果：脐带血的单个核细胞与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育经体外培养贴壁后出现形似纤维状细胞形态并表达与MSCs相关的抗原（CD13,CD44,CD71,CD166）,但不表达造血细胞抗原（CD34,CD45）,这与源于骨髓的MSCs一致。结论：人脐血间充质干细胞与脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。     

小鼠骨髓内皮细胞对脐血造血细胞体外扩增的作用

目的：观察骨髓内皮细胞对脐血造血细胞体外扩增的影响。方法：体外培养骨髓内皮细胞株细胞，收集无血清条件培养液（命名为ECM）。用MiniMACS磁珠法分离脐血CD34+细胞。检测CD34+细胞经ECM体外液体培养24 h后或与骨髓内皮细胞层(ECL)共培养24 h后脐血造血细胞的扩增倍数，并观察在加入bFGF的培养条件下收集的骨髓内皮细胞条件培养液（bFGF-ECM）是否能加强对脐血造血细胞的扩增作用。 结果：ECM，ECL 皆能显著扩增脐血早期或晚期造血细胞，且二者对早期造血细胞的扩增效果是类似的；bFGF-ECM对脐血造血细胞的扩增倍数明显高于用ECM扩增的倍数。结论：小鼠骨髓内皮细胞对脐血造血细胞有明显的体外扩增作用。     

中晚孕期与足月胎儿脐血干/祖细胞功能特性研究

目的　对比研究中、晚孕期和足月胎儿脐血造血干 /祖细胞的表型及功能特性 ,为造血干细胞宫内移植和基因治疗先天性疾病提供新的思路。方法　采用免疫磁珠分离法、流式细胞术、液体培养、半固体甲基纤维素培养等对中、晚妊期及足月胎儿脐血造血干 /祖细胞比例、对细胞因子的反应性、体外增殖及自我更新能力进行了测定。结果　未足月脐血中CD34+ 、CD34+ CD38- 细胞及CD34+ 细胞中CD34+ HLL DR+ 、CD34+ CD38- 细胞比例较足月脐血高 (平均 3 1 4 %、0 76 %比 0 78%、0 1 8%及 9 8%、2 0 4%比 3 9%、1 4 6 % ) ,产生的集落形成单位量 (CFU)较足月脐血高 ,且与CD34+ 细胞比例成正相关 (r =0 83) ,长期培养启动细胞 (LTC IC)约是足月脐血的 3倍 (5 7± 1 2 / 1 0 5细胞比1 7± 0 8/ 1 0 5细胞 ,P <0 0 5)。在短期液体培养体系中 ,不同胎龄脐血干 /祖细胞具有相似的扩增潜能 ,体外细胞因子支持下培养 7天 ,CFU C、细胞总数、CD34+ 细胞数、CD34+ CD38- 细胞数达高峰 ,之后逐渐下降 ,其中以SCF +FL +TPO +IL 3 +IL 6组合条件下效果最显著。结论　未足月胎儿 (尤其是中妊期 )脐血与足月胎儿脐血相比 ,含有较高的造血干 /祖细胞 ,有较强的集落形成能力 ,对细胞生长因子刺激敏感 ,在体外能有效地扩增和     

人脐血间充质干细胞的体外培养及生物学特性

目的:建立一种体外纯化增殖人脐血源性间充质干细胞(MSCs)的实验方法,并观察其生物学特性。方法:从正常分娩的足月胎儿脐血中分离出MSCs进行原代培养,培养瓶预先用自体血浆包被处理。72-96 h半量更换培养液,弃去未贴壁细胞,以后每3-5 d半量换液1次。待细胞达到80%-90%融合时,按1∶2的比例进行传代。倒置或相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况及形态学特征。取第3代脐血MSCs用流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45的表达。结果:脐血经分离、培养5-7 d后有间充质样细胞贴壁,3-4周后,细胞生长达80%-90%融合,形态学类似骨髓源性MSCs。连续传至5代以后,增殖能力未见明显减弱。脐血MSCs的大部分细胞(>90%)处于G0/G1期,且均一稳定地表达间充质干细胞表面抗原CD29、CD44,但不表达CD34、CD45。结论:脐带血内含有MSCs,并可在体外纯化增殖,该技术可为实验研究和临床应用提供足够的干细胞来源。     

不同来源的间充质干细胞线粒体结构及活性鉴定

目的 培养脂肪、骨髓、牙髓及脐带4种不同来源的间充质干细胞,并鉴定其线粒体结构和活性。方法通过流式细胞术、透射电子显微镜及细胞代谢分析仪等技术分别检测各种间充质干细胞的纯度、内部线粒体的超微结构及呼吸耗氧量。结果脂肪、骨髓、牙髓及脐带4种间充质细胞均成纤维状贴壁生长,同时表达CD73、CD90及CD105,不表达CD34、CD11b、CD19、CD45及HLA-DR;ASC与BMSC较DPSC与UCDSC线粒体结构成熟,代谢水平高。结论脂肪、骨髓、牙髓及脐带来源的细胞均具有间充质干细胞的特点,但其线粒体结构和活性等方面存在差异。     

人脐血内皮祖细胞的体外培养

目的从人脐带血中分离内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,建立人脐血内皮祖细胞体外培养的方法,为实现内皮祖细胞的移植及实验研究提供足量的细胞来源。方法采用密度梯度离心法分离人脐带血内皮祖细胞,在EGM-2培养基中培养,采用流式细胞仪、免疫组化和免疫荧光鉴定EPCs。结果脐带血单个核细胞在经EGM-2培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;1周后既分化成EPCs,细胞免疫荧光CD133染色率在培养第7天为（67.2±2.12）%,免疫组化CD34染色率为（89.67±2.05）%,流式细胞仪鉴定该种细胞CD133与KDR的双阳性率达87.8%。可确定该细胞为EPSc。结论采用本培养方法可获得良好的内皮祖细胞用于实验研究。     

A novel and feasible way to cultivate and purify endothelial progenitor cells from bone marrow of children with congenital heart diseases

Background  Endothelial progenitor cells (EPCs) are used in vascular tissue engineering and clinic therapy. Some investigators get EPCs from the peripheral blood for clinic treatment, but the number of EPCs is seldom enough. We have developed the cultivation and purification of EPCs from the bone marrow of children with congenital heart disease, to provide enough seed cells for a small calibre vascular tissue engineering study.

Methods  The 0.5-ml of bone marrow was separated from the sternum bone, and 5-ml of peripheral blood was collected from children with congenital heart diseases who had undergone open thoracic surgery. CD34+ and CD34+/VEGFR+ cells in the bone marrow and peripheral blood were quantified by flow cytometry. CD34+/VEGFR+ cells were defined as EPCs. Mononuclear cells in the bone marrow were isolated by Ficoll^® density gradient centrifugation and cultured by the EndoCult Liquid Medium Kit™. Colony forming endothelial cells was detected. Immunohistochemistry staining for Dil-ac-LDL and FITC-UEA-1 confirmed the endothelial lineage of these cells.

Results  CD34+ and CD34+/VEGFR+ cells in peripheral blood were (0.07±0.05)% and (0.05±0.02)%, respectively. The number of CD34+ and CD34+/VEGFR+ cells in bone marrow were significantly higher than in blood, (4.41±1.47)% and (0.98±0.65)%, respectively (P <0.0001). Many colony forming units formed in the culture. These cells also expressed high levels of Dil-ac-LDL and FITC-UEA-1.

Conclusion  This is a novel and feasible approach that can cultivate and purify EPCs from the bone marrow of children with congenital heart disease, and provide seed cells for small calibre vascular tissue engineering.

     

脐血T淋巴细胞亚群分布特点及其临床意义探讨

目的比较脐血、骨髓及外周血中T淋巴细胞亚群的分布特点,探讨脐血移植后免疫重建延迟的发生机制.方法应用流式细胞仪分别检测脐血、骨髓及外周血中CD3 、CD3 CD5 、CD4 、CD4 CD28 、CD8 和CD8 CD28 细胞的含量.结果 CD3 、CD4 及CD8 细胞数在脐血、骨髓及外周血中无显著差异,P> 0.05.脐血中CD3 CD5 、CD4 CD28 及CD8 CD28 细胞数显著低于骨髓及外周血,P<0.05.骨髓与外周血中各T淋巴细胞亚群测定无显著差异,P>0.05.结论脐血中成熟的T淋巴细胞(CD3 CD5 )及细胞毒T淋巴细胞(CD4 CD28 、CD8 CD28 )的数量显著低于骨髓及外周血,这可能是脐血移植后免疫重建延迟的主要原因.     

脐血CD34＋细胞向内皮细胞诱导分化的体外研究

目的：探讨从脐血中分离CD34＋细胞,并诱导、鉴定其分化为内皮细胞的方法。方法：羟乙基淀粉沉降、密度梯度离心两步法制备脐血单个核细胞,免疫磁珠分选法（MACS）获得CD34＋细胞,在含有细胞因子的M199培养基中诱导。观察细胞形态变化,摄取Dit标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil—AcLDL）的情况,流式鉴定细胞表面标志。结果：分选CD34＋细胞纯度在91％以上,培养3d有明显集落形成及部分细胞贴壁,14d贴壁细胞呈条索状,逐渐增多后呈铺路石样改变。流式检测贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志物CD144、vWF、CD31、CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达,与成熟的脐静脉内皮细胞表达率相近。免疫荧光发现贴壁细胞呈现红色荧光,提示细胞摄取Dil—AcLDL,证明CD34＋细胞分化为有功能的内皮细胞。结论：脐血中存在CD34＋细胞且用两步法和MACS可获得高纯度CD34＋细胞,在特定条件下可分化为内皮细胞。