大剂量重组HBsAg对HBV转基因小鼠细胞免疫调节作用

目的 利用免疫耐受HBV转基因小鼠动物模型研究大剂量基因重组HBsAg对其免疫调节作用，观察对HBV基因表达的影响。方法 比较不同免疫次数、免疫周期、免疫剂量对转基因小鼠所诱生的Th1类细胞因子和T细胞增殖的影响，同时检测血清中HBsAg和HBV DNA的含量。结果 多次免疫9个月后的IL一2，IFNγ，T细胞增殖的水平分别是免疫1周时的2，17，2倍，同时疫苗组的HBsAg的滴度在6个月时较对照组明显降低，9个月时显著降低，HBV DNA的检测结果是疫苗组下降10^2的有3只，而对照组没有。9周内免疫一次和两次，高、中、低剂量组与对照组所诱生的IL-2水平差异均无显著性。结论 大剂量的基因重组HBsAg可以诱导出高水平的Th1类细胞因子，抑制HBV的基因表达，打破免疫耐受，为乙肝疫苗的临床抗HBV治疗奠定了理论基础。     

参仙乙肝灵联合HBsAg基因修饰的树突状细胞对HBV转基因小鼠免疫应答及肝细胞损伤的影响

【目的】观察补肾解毒中药参仙乙肝灵联合乙肝表面抗原（HBsAg）基因修饰的树突状细胞（DC/HBsAg）诱导乙肝病毒（HBV）转基因小鼠的免疫应答及其对肝细胞损伤的影响。【方法】 HBV转基因（Tg）小鼠尾静脉注射DC/HBsAg免疫,使用参仙乙肝灵灌胃给药,共4周。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测HBV Tg小鼠脾脏T细胞内细胞因子白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）分泌水平及谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）值;采用乳酸脱氢酶释放法检测HBV Tg小鼠脾脏HBsAg特异性T淋巴细胞体外杀伤活性;采用ELISA检测HBV Tg小鼠血清HBsAg表达情况。【结果】联合治疗能显著增加小鼠脾脏T细胞内细胞因子IL-2、 IFN-γ水平(P<0.05或P<0.01),增加HBV Tg小鼠脾脏HBsAg特异性T淋巴细胞杀伤活性(P<0.05或P<0.01),增加HBsAg表达抑制率(P<0.05或P<0.01),作用均优于DC/HBsAg免疫给药,并能明显减少肝细胞损伤。【结论】参仙乙肝灵对DC/HBsAg诱导HBV Tg小鼠免疫应答具有一定的提升作用;同时能够减轻肝脏损害,在IFN-γ的抗HBV活性不受影响情况下,使HBV清除过程独立于肝脏损伤过程。     

HBV转基因小鼠CD4+CD25+调节性T细胞免疫抑制功能的研究

目的 通过对HBV转基因小鼠CD4+、CD4+CD25+调节性T细胞数量和免疫抑制功能的研究,探讨CD4+CD25+调节性T细胞在乙肝免疫耐受中的作用.方法 用流式细胞术对12只HBV转基因小鼠和12只正常小鼠外周血CD4+、CD4+CD25+调节性T细胞的频率进行检测;磁珠分选小鼠脾CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞,分为HBsAg刺激组和ConA刺激组体外单独和共培养,ELISA方法检测诱生的细胞因子IL-2.结果 与正常小鼠比较,HBV转基因小鼠外周血CD4+、CD4+CD25+调节性T细胞数量差异无统计学意义(P＞0.05).HBsAg刺激组,CD4+CD25-T细胞单独或共培养,HBV转基因小鼠CD4+CD25-T细胞诱生IL-2水平显著低于正常小鼠(P＜0.01);ConA刺激组,HBV转基因小鼠CD4+CD25-T细胞诱生IL-2水平与正常小鼠相比则差异无统计学意义(P＞0.05);两组小鼠CD4+CD25-T细胞单独培养时诱生IL-2水平均显著高于共培养(P＜0.01).结论 与正常小鼠比较,HBV转基因小鼠CD4+、CD4+CD25+调节性T细胞数量和免疫抑制功能差异无统计学意义,但T细胞水平对乙肝病毒存在特异性免疫耐受.CD4+CD25+调节性T细胞可抑制CD4+、CD8+T细胞.     

CpG ODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠和HBV转基因C57BL/6J小鼠

目的:探讨人工合成硫代修饰的含CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)作为佐剂对HBsAg诱导BALB/c和HBV转基因小鼠产生免疫应答的影响. 方法: 用人工合成CpG ODN与血源HBsAg联合免疫BALB/c和HBV转基因C57BL/6J小鼠,采用ELISA方法观察小鼠血清HBsAg及抗-HBs水平,用ELISPOT方法判断CpG ODN对HBsAg免疫小鼠脾T淋巴细胞分泌细胞因子的影响. 结果: CpG ODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠较HBsAg单独注射组同期抗-HBs滴度明显提高,尤其在首次免疫后6、8、12 wk,2组比较差异显著(P<0.05),联合免疫较CpG ODN单独免疫自首次免疫后4 ～16 wk差异显著(P<0.05).与HBsAg,CpG ODN 单独免疫比较,联合免疫能使HBsAg特异性分泌IFN- γ T细胞分别增加3或9倍;CpG ODN,HBsAg联合免疫可诱导转基因小鼠产生抗-HBs,随时间延长,抗体滴度逐渐升高,并能使更多小鼠产生抗体,而单用HBsAg组、CpG ODN组均不能诱导抗-HBs的产生,免疫后各组血清HBsAg浓度较免疫前明显下降(P <0.05),但组间无明显差别(P>0.05),与HBsAg,CpG ODN 单独免疫比较,联合免疫能使HBsAg特异性分泌IFN- γ T细胞分别增加3或11倍. 结论: CpG ODN作为佐剂可增强HBsAg诱导BALB/c小鼠产生体液及细胞免疫应答,CpG ODN ,HBsAg联合免疫可打破HBV转基因小鼠对HBsAg免疫耐受,可望成为慢性乙型肝炎的有效预防和治疗性疫苗.     

微囊化CEA转基因细胞疫苗对小鼠免疫功能的影响

目的：探讨微囊化癌胚抗原(CEA)转基因细胞疫苗免疫小鼠后,对小鼠免疫功能的影响。方法：采用³H-TdR掺入法,测定ConA诱导荷瘤小鼠脾淋巴细胞的增殖作用;采用³H-TdR后标记法,测定荷瘤小鼠脾淋巴细胞NK细胞毒;以ELISA法测定小鼠脾淋巴细胞IL-2和IFNγ细胞因子水平;利用流式细胞术检测CEA疫苗免疫对小鼠脾T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8百分率,CD4/CD8比值和NK细胞的影响;采用RT-PCR方法检测IL-2、IFNγ mRNA的表达水平。 结果：微囊化CEA疫苗免疫可以有效增强ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖能力,促进IL-2、IFNγ的产生以及增强NK细胞的细胞毒活性（P<0.05,P<0.01,P<0.05）;微囊化CEA疫苗能提高荷瘤小鼠CD4/CD8比值及NK细胞数（P<0.05,P<0.05）;促进脾细胞中细胞因子IL-2、INFγ mRNA的表达。 结论：微囊化CEA转基因细胞疫苗具有增强荷瘤小鼠免疫功能的作用,提示该疫苗可作为有效的抗CEA阳性肿瘤的治疗性疫苗。     

乙肝表面抗原疫苗对HBV转基因鼠细胞免疫和HBV影响的实验研究

目的：探讨不同剂量HBsAg疫苗，不同次数免疫对HBV转基因小鼠细胞免疫应答和HBV表达的影响。方法：不同剂量，不同次数HBsAg疫苗免疫小鼠后，用^1H-TdR掺入法，ELISA方法，免疫组化法和PCR法分别测定免疫鼠T淋巴细胞增殖能力，细胞培养上清中IL-2，IFN-γ及血清中HBsAg和HBVDNA含量。结果：较大剂量HBsAg疫苗反复免疫后，IL-2、IFN-γ显著增高（P均〈0．01），T淋巴细胞增殖能力显著增强（P〈0．05），血清HBsAg含量显著降低（P〈0．01）。并能抑制血清HBV DNA表达．结论：较大剂量HBV疫苗反复免疫可增强HBV感染者特异性细胞免疫应答，抑制HBV复制、表达．     

HBV基因疫苗诱导正常及HBV转基因小鼠产生体液免疫应答

目的:用乙型肝炎病毒(HBV)蛋白基因真核表达载体诱导正常小鼠及HBV转基因小鼠产生特异性体液免疫应答,以探讨其预防及治疗HBV慢性感染的可行性.方法:将HBV S2.S基因的真核表达载体pCMV-S2.S(PS)和相应的空载体pcDNA3.0分别免疫正常C57BL/6小鼠及同一品系HBV转基因小鼠(n=5).每只小鼠肌内注射纯化质粒100 μg.用ELISA方法检测小鼠血清抗HBs和抗preS2效价及HBV转基因小鼠血清HBsAg和HBeAg的水平.注射基因疫苗后第8周,活检取转基因小鼠肝脏组织,制备石蜡切片并行H-E染色,光镜下观察其病理改变.结果:PS诱导正常及转基因小鼠产生了抗HBs及抗preS2,并且抗preS2的出现早于抗HBs约1～2周.PS免疫8 周后,转基因小鼠血清HBsAg和HBeAg为阴性.注射基因疫苗后第8周病理检查转基因小鼠肝脏组织,肝细胞出现程度不同的广泛浊肿和水样变性,而相应的对照组无明显改变.免疫前后肝组织内单个核淋巴细胞数量无显著变化.结论:研究表明HBV中蛋白基因疫苗能够有效诱导HBsAg特异性的体液免疫应答,能够清除转基因小鼠血清中的HBsAg和HBeAg;初步的实验结果为研制治疗HBV慢性感染的基因疫苗提供了依据.     

HPV16E6/E7重组体DNA免疫对小鼠脾细胞分泌活性的影响

目的研究人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E6/E7蛋白与结核杆菌热休克蛋白70(HSP70)表达重组体DNA免疫对小鼠活化脾细胞分泌活性的影响。方法采用肌肉注射DNA的方法免疫小鼠,分离脾细胞,用ELISA检测细胞因子的表达水平及抗体的水平,用RT-PCR的方法检测细胞中细胞因子mRNA的水平。结果以HPV16E6/E7为基础的DNA免疫小鼠后,检测到的细胞因子IL-2,IFNγ的含量明显升高;与结核杆菌HSP70重组后,IL-2,IFNγ的含量较重组前明显升高。与结核杆菌HSP70重组后,IL-10及抗体水平没有明显变化。结论以HPV16E6/E7为基础的DNA免疫能增强小鼠的细胞免疫反应。与结核杆菌HSP70重组后能提高细胞免疫的效果,但对体液免疫几乎没有影响。     

氧化苦参碱通过调节T淋巴细胞亚群抑制HBV转基因小鼠的病毒复制

目的 观察氧化苦参碱对HBV转基因小鼠病毒复制的作用,并探讨其是否与调节T淋巴细胞亚群有关.方法 选取SPF级HBV转基因雄性小鼠36只,按随机数字表法分为模型组、氧化苦参碱组及拉米夫定组,每组12只,另取12只非转基因BALB/c雄性小鼠作为对照组.各组分别给予相应的药物治疗.观察各组小鼠肝脏组织病理变化,并检测血清及肝脏乙肝表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒HBV-DNA水平、血液T淋巴细胞亚群水平以及血清细胞因子水平.结果 治疗后,与模型组比较,氧化苦参碱组与拉米夫定组血清及肝组织HBsAg、HBV-DNA水平较低(P＜0.05),而氧化苦参碱组与拉米夫定组血清及肝组织HBsAg、HBV-DNA水平差异无统计学意义(P＞0.05).与模型组比较,氧化苦参碱组与拉米夫定组血液CD3+、CD4+T淋巴细胞、CD4+/CD8+水平较高,且氧化苦参碱组＞拉米夫定组;CD8+T淋巴细胞水平较低,且氧化苦参碱组＜拉米夫定组(P＜0.05);氧化苦参碱组与拉米夫定组血清干扰素-y(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)水平较高,且氧化苦参碱组＞拉米夫定组;白细胞介素-4(IL-4)水平较低,且氧化苦参碱组＜拉米夫定组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 氧化苦参碱能有效抑制HBV转基因小鼠血清及肝组织HBsAg、HBV-DNA水平,该作用可能与调节T淋巴细胞亚群水平及Th1/Th2细胞因子水平、改善免疫功能有关.     

丝状真菌高分子量DNA的提取研究

为寻求一种简便高效的提取真菌基因组ＤＮＡ的方法，采用经改良的液氮研磨饱和酚抽提法及高盐沉淀法，从液体培养的鸡土从菌菌丝体中提取了高分子量的基因组ＤＮＡ。用紫外吸收光谱、限制酶切、ＲＡＰＤ—ＰＣＲ反应及琼脂糖凝胶电泳等方法进行了鉴定。结果显示，两种方法均可以获得分子量大、样品较纯的基因组ＤＮＡ，用限制酶均能有效地消化，并可有效地用于ＰＣＲ扩增。其中高盐沉淀法提取的ＤＮＡ产量高（每克菌丝体可获ＤＮＡ０．８３ｍｇ），方法简便，对人体无毒害，是较理想的提取真菌ＤＮＡ的方法     

大鼠肠内容物细菌基因组DNA提取方法的比较

目的 比较两种肠内容物前处理和两种提取方法对清洁级SD大鼠肠内容物细菌基因组DNA提取效率.方法 分别选用PBS多次离心漂洗、液氮破细胞两种前处理方法和酚/氯仿抽提、试剂盒过柱法两种提取方法进行组合分析,对4份肠内容物和16份含金黄色葡萄球菌肠内容物进行随机提取.结果 大鼠肠内容物细菌基因组DNA含量和纯度测定结果显示,与PBS反复离心相比,液氮研磨前处理能显著提高大鼠肠内容物基因组DNA.荧光定量PCR表明,液氮研磨前处理较PBS反复离心能更好地收集细菌基因组DNA,其Ct值最低.结论 研究结果表明,采用液氮研磨试剂盒法在大鼠肠内容物DNA提取中是较为优良的方法,该方法为建立实验动物中微生物的定量PCR检测方法打下了基础.     

磷酸三丁酯萃取酚类的机理性研究

测得磷酸三丁脂萃取苯酚和间甲酚的平衡等温线，表明ＴＢＰ具有很高的萃取分配比，探讨了盐析效应，采用双对数斜率法和连续变量法分别测得ＴＢＰ与苯酚，间甲酚的萃合物的组成比。     

快速提取临床标本中结核杆菌DNA方法的研究

介绍了二种快速、简便从临床结核性痰标本及体腔液标本中提取ＤＮＡ的方法，４０例结核性标本ＰＣＲ扩增结果：加热碱裂解法阳性率为６７．５％（２７／４０）；溶菌酶法阳性率是６０％（２４／４０）。二种方法经统计学处理，ＰＣＲ阳性率之间无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。这些方法中，我们省去了传统的酚抽提及蛋白酶Ｋ的作用步骤，使提取ＤＮＡ能在１小时内完成，适用于临床推广。     

两种恒河猴肠道腺病毒基因型分型方法的比较分析

目的通过对两种肠道腺病毒基因型分型方法进行比较,以寻找出简便快速的肠道腺病毒基因型分型方法。方法采集57例圈养的恒河猴粪便样本,方法一：将粪便悬液过滤上清感染BSC-1细胞,提取病变细胞的基因组DNA进行PCR扩增,然后克隆、测序,确定病毒基因型;方法二：从粪便悬液过滤上清中直接提取基因组DNA进行巢式PCR扩增,对PCR阳性者进行克隆、测序以及基因型分型。结果 57份样本中,两种方法均有12份样本检出腺病毒,阳性率为21.1%（12/57）。系统进化分析显示,两种方法检出的腺病毒型别一致。提示这些序列主要可分为两大组：类SAdV-6组（2个非重复序列）和类SAdV-7组（9个非重复序列）。此外,有三个克隆,其最相似序列分别为：SAdV-1、SAdV-3和HAdV-52。结论虽然两种方法的敏感性、特异性一样,但方法二是直接提取粪便悬液过滤上清基因组DNA进行巢式PCR扩增,而无需方法一进行3次体外细胞感染实验后从病变细胞中提取基因组DNA进行PCR扩增,节省了实验的时间及成本,特别是避免了体外细胞感染过程中可能出现的污染,因此值得推荐。     

一步及半巢式PCR检测石蜡包埋B细胞淋巴瘤组织克隆性IgH重排的比较

目的：建立一种简便有效的方法,来检测Ｂ细胞非霍奇金淋巴瘤（Ｂ－ＮＨＬ）石蜡包埋组织的免疫球蛋白重链（ＩｇＨ）基因重排。方法：以ＩｇＨ的第三互补决定簇区（ＩｇＨ－ＣＤＲ３）为标志,用消化煮沸法和酚－氯仿法提取３６例Ｂ－ＮＨＬ及１０例扁桃体炎的石蜡包埋组织的基因组ＤＮＡ,比较两进行一步及半巢式聚合酶链反应（ＳｎＰＣＲ）,聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染后检测克隆性ＩｇＨ重排的结果。结果：Ｂ－ＮＨＬ组,３４例经酚－氯仿法提取ＤＮＡ,其一步及ＳｎＰＣＲ检测克隆性ＩｇＨ－ＣＤＲ３重排的阳性率分别为２６．５％和７６．５％（Ｐ〈０．０５）;２７例经消化煮沸法提取ＤＮＡ,其一步及ＳｎＰＣＲ的阳性率分别为７．４％和６６．７％（Ｐ〈０．０５）;２５例同时用上述２种方法提取ＤＮＡ,ＳｎＰＣＲ的阳性率分别为７６％和６８％（Ｐ〉０．０５）。对     

四种微量石蜡组织DNA提取方法的比较

目的:探讨从微量福尔马林固定石蜡包埋组织(formalinfixation and paraffin embeddedtissues,FFPET)中提取DNA的简单而高效的方法。方法:采用Chelex-100提取法、酚氯仿抽提法、单纯消化法、水煮法4种方法提取组织DNA;应用聚合酶链反应扩增100~500bp长度DNA片段,然后进行电泳分析,1年后重复PCR电泳分析。结果:小于200bp长度DNA片段扩增,Chelex-100提取法、单纯消化法阳性率分别为88.8%、78.8%,明显优于酚氯仿抽提法(15.0%)(P<0.01)及水煮法(21.3%)(P<0.01)。随着扩增长度的增加,PCR扩增效率逐渐降低,Chelex-100提取法PCR反应总阳性率为82.5%,单纯消化法为66.5%,水煮法为13.4%,酚氯仿抽提法为13.4%。1年后重复PCR总阳性率分别为80.1%、31.7%、2.5%、9.2%。结论:Chelex-100提取法方便简单,适用于微量石蜡组织DNA扩增分析;单纯消化法及水煮法在一定条件下适用于微量石蜡组织短片段DNA的扩增。     

TKM──血液DNA快速提取法

在临床ＰＣＲ检验中，血卟啉对酶促反应的影响不容忽视，因此在纯化ＤＮＡ的过程中，常需将红细胞清除，以消除血卟啉对实验结果的干扰。用ＴＫＭ法提取血液ＤＮＡ，方便、经济、快捷且效果良好。该ＤＮＡ可用于ＰＣＲ的分析，结果极为理想，完全可以替代其他血液ＤＮＡ的提取方法。     

提取陈旧血液标本中DNA的三种方法比较

目的寻找适合从陈旧全血中提取基因组DNA建立基因组库的方法。方法分别用改良的酚-氯仿法、SDS法、试剂盒法从陈旧全血中提取基因组DNA,采用聚合酶链反应（PCR）对提取的基因组DNA进行评估。结果提取的基因组DNA经统计学分析,3种提取基因组DNA的方法之间差异有统计学意义（P〈0.01）,以改良的酚-氯仿法提取的基因组DNA效率最高,试剂盒法次之,SDS法较差。结论建基因组库推荐改良的酚-氯仿法。     

A novel approach for extracting DNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue using microwave

BackgroundFormalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue is the gold standard procedure for tissue preservation. However, the extraction of DNA is a cumbersome procedure as the extracted DNA is fragmented because of the cross-linking effect of formalin. Hence, the aim of the present study is to extract DNA from FFPE tissues using different techniques with a specific objective of comparing the extracted DNA, both quantitatively and qualitatively.MethodTen samples of FFPE tissues were retrieved from the archives of the Department of Oral Pathology. Total genomic DNA was extracted by different methods which included QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, Norgen DNA FFPE Tissue Kit, phenol–chloroform method, mineral oil–based extraction, M/10 NaOH solution method, and microwave method. A 280–base pair sequence was selected for evaluation of downstream amplification.ResultsThe statistical analysis was performed using unpaired student's t-test to compare the DNA yields and quality obtained by microwave methods with other methods using SPSS software. Total genomic DNA retrieved by the microwave method was superior to other methods both qualitatively and quantitatively.ConclusionDNA extraction from FFPE tissues is an onerous task as irreversible bonds form between the nucleic acid during fixation which are difficult to break during DNA retrieval. Hence, the microwave method provides good total genomic DNA which gives better downstream results when compared with other methods.