去甲斑蝥素体外抑制人胰腺癌细胞株PANC-1增殖的实验研究

目的 研究去甲斑蝥素(NCTD)体外抑制人胰腺癌细胞株PANC-1的增殖作用.方法 以不同浓度NCTD处理PANC-1细胞24 h后,采用MTT法检测其对PANC-1细胞的生长抑制作用;Hoechst 33258染色观察PANC-1细胞形态的变化;Western blot印迹法检测NF-κ B p65和AKT蛋白的表达.结果 NCTD可导致处理的细胞增殖速度减慢,且抑制效应随药物剂量的增加而增强,细胞出现典型凋亡形态学改变,NF-κB p65和AKT蛋白的表达均出现明显下降(P＜0.01).结论 去甲斑蝥素能明显抑制胰腺癌PANC-1细胞的生长并诱导其凋亡,其机制可能是通过下调NF-κB p65和AKT的表达来实现的.     

去甲斑蝥素对人黑色素瘤A375细胞周期、活性氧自由基及细胞凋亡的影响

［摘要］ 目的探讨去甲斑蝥素（Norcantharidin,NCTD）对人黑色素瘤A375细胞周期、ROS自由基及细胞凋亡的影响及其机制。 方法培养人A375黑素瘤细胞,分别采用10,20,40 μmol/L NCTD预处理,培养48 h后,采用流式细胞术测定NCTD对人A375黑素瘤细胞周期的影响,采用免疫印迹法检测NCTD对人A375黑素瘤细胞蛋白Cyclin D1和P21表达的影响,采用流式细胞术测定NCTD对人A375黑素瘤细胞ROS及凋亡水平的影响。 结果10,20,40 μmol/L NCTD组G1期细胞比例高于对照组,S期和G2期细胞比例低于对照组,20,40 μmol/L NCTD组G1期细胞比例高于10 μmol/L NCTD组,S期和G2期细胞比例低于10 μmol/L NCTD组,40 μmol/L NCTD组G1期细胞比例高于20 μmol/L NCTD组,S期和G2期细胞比例低于20 μmol/L NCTD组（P＜0.05）。40 μmol/L NCTD组处理人A375黑色素瘤细胞48 h后,细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin A和CDK2低于对照组,P21蛋白高于对照组（P＜0.05）。10,20,40 μmo/L NCTD组细胞内ROS水平高于对照组,20,40 μmol/L NCTD组细胞内ROS水平高于10 μmol/L NCTD组,40 μmol/L NCTD组细胞内ROS水平高于20 μmol/L NCTD组（P＜0.05）。10,20,40 μmol/L NCTD组细胞凋亡率高于对照组,20,40 μmol/L NCTD组细胞凋亡率高于10 μmol/L NCTD组,40 μmol/L NCTD组细胞凋亡率高于20 μmol/L NCTD组（P＜0.05）。NAC组细胞凋亡率低于对照组,NCTD组和NAC+NCTD组细胞凋亡率高于对照组,NAC+NCTD组细胞凋亡率低于NCTD组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结论NCTD通过阻滞细胞G1周期、减少S期抑制人A375黑色素瘤细胞的增殖,通过诱导ROS水平升高诱导细胞凋亡。     

去甲斑蝥素诱导HL60细胞凋亡的研究

探讨去甲斑蝥素 (NCTD)对人早幼粒白血病细胞株HL60细胞增殖的抑制作用。用流式细胞仪测定NCTD对HL60细胞体外培养过程中细胞毒性、细胞凋亡及细胞周期的影响。结果显示 :NCTD作用 4 8h对HL60细胞有较强生长抑制作用 ,作用 2 4h后达到凋亡高峰 ;1、5、10、50 μmol L的NCTD作用 2 4h后 ,G1期细胞百分数均减少 ,S期与G2 M期细胞百分数均增加 ,呈现G2 M期阻滞现象。说明NCTD可诱导HL60细胞凋亡 ,抑制瘤细胞分裂生长 ,且有明显的时间和剂量效应     

去甲斑蝥素诱导肝癌细胞凋亡的实验观察

目的 观察去甲斑蝥素(NCTD)诱导肝癌细胞凋亡的分子学机制,为合理应用NCTD治疗肝细胞肝癌提供理论基础.方法 对肝癌细胞株SMMC-7721,BEL-7402进行体外培养,应用不同浓度的NCTD(3、10、30μg/ml)处理肝癌细胞,采用MTT方法检测细胞生存率,锥虫蓝拒染法检测细胞的死亡率,流式细胞仪检测细胞的凋亡率,Western印迹检测半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶(caspase)和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白,以及Bcl-2家族蛋白的表达.结果 MTT检测显示NCTD处理24、48和72 h后SMMC-7721细胞IC50分别为12、6和1.6μg/ml,BEL-7402细胞IC50分别为10、4和2 μg/ml;锥虫蓝拒染法结果显示,浓度为3、10、30 μg/ml的NCTD处理24 h后,SMMC-7721细胞的死细胞率分别为16.89%、46.16%、72.13%,均显著高于未处理对照组的死细胞率3.34%(P＜0.01);BEL-7402细胞的死细胞率分别为19.59%、50.10%、90.31%,均显著高于未处理对照组的死细胞率2.88%(P＜0.01).流式细胞仪检测显示,NCTD 10 μg/ml处理12 h,SMMC-7721细胞凋亡率达到27%,较未处理对照组(7%)升高20%,BEL-7402细胞凋亡率达到30%,较未处理对照组(8%)升高22%;Western印迹结果显示,NCTD 10μg/ml处理8、14和24 h后,在两株肝癌细胞均检测到caspase-9,-3活化,PARP蛋白裂解,以及Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1蛋白的表达下调.结论 结果提示NCTD具有较强的抑制肝癌细胞生存和诱导肝癌细胞凋亡作用.NCTD的抗肝癌作用机理可能是通过诱导多个Bcl-2抑凋亡家族蛋白表达下调,激活内源性线粒体凋亡通路,诱导肝癌细胞发生凋亡.     

去甲斑蝥素诱导人直肠癌Colo320细胞凋亡作用研究

目的探讨去甲斑蝥素对人直肠癌Colo 320细胞的诱导凋亡作用.方法采用不同浓度的去甲斑蝥素(noncantharidin,NCTD)作用于人直肠癌Colo 320细胞24 h,应用光镜和透射电镜观察细胞形态学和细胞超微结构的变化,流式细胞的方法检测细胞生长周期,Western blot法检测细胞Bag-1和Bcl-2蛋白表达.结果光镜及透射电镜观察可见人直肠癌Colo 320细胞出现典型的凋亡形态学和超微结构的改变.流式细胞仪分析显示:经5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL浓度NCTD处理人直肠癌Colo320细胞24 h后,G0/G1期和S期细胞逐渐减少,G2/M期细胞逐渐增多,呈剂量依赖关系.Western blot检测显示,Bcl-2、Bag-1蛋白的表达均下降.结论 NCTD对人直肠癌Colo 320细胞具有促进凋亡、干扰细胞的有丝分裂、将细胞阻滞于G2/M分裂期和抑制Bag-1及Bcl-2蛋白表达的作用.     

去甲斑蝥素诱导人直肠癌Colo 320细胞凋亡作用研究

［摘要］目的　探讨去甲斑蝥素对人直肠癌Colo 320细胞的诱导凋亡作用．方法　采用不同浓度的去甲斑蝥素（noncantharidin,NCTD）作用于人直肠癌Colo 320细胞24 h,应用光镜和透射电镜观察细胞形态学和细胞超微结构的变化,流式细胞的方法检测细胞生长周期,Western blot 法检测细胞Bag-1和Bcl-2 蛋白表达．结果　光镜及透射电镜观察可见人直肠癌Colo 320细胞出现典型的凋亡形态学和超微结构的改变． 流式细胞仪分析显示:经5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL 浓度NCTD处理人直肠癌Colo320细胞24 h后, G0/G1期和S期细胞逐渐减少,G2/M期细胞逐渐增多,呈剂量依赖关系．Western blot检测显示,Bcl-2、Bag-1蛋白的表达均下降．结论　NCTD对人直肠癌Colo 320细胞具有促进凋亡、干扰细胞的有丝分裂、将细胞阻滞于G2/M分裂期和抑制Bag-1及Bcl-2蛋白表达的作用．     

去甲斑蝥素诱导人T淋巴细胞白血病细胞株凋亡的实验研究

目的：探讨去甲斑蝥素诱导人T淋巴细胞白血病细胞株6T－CEM的凋亡作用。方法：利用DNA断裂点标记法（TUNEL）、DNA凝胶电泳、活细胞拒染以及光镜方法研究有关细胞的凋亡。结果：UNEL标记及DNA凝胶电泳显示：10－40μg/ml剂量的去甲斑蝥素作用6T－CEM细胞24h及10μg/ml剂量的去甲斑蝥素作用6T－CEM细胞超过18h后即出现典型的细胞凋亡特征。结论：一定剂量范围内的去甲斑蝥素可在直接杀伤作用较小的情况下明显诱导6T－CEM细胞凋亡,不会因细胞坏死而引起炎症反应,这对于去甲斑蝥素应用于临床将有十分重要意义。     

去甲斑蝥素对原发性胆囊癌GBC-SD细胞系增殖和凋亡的影响

目的　研究去甲斑蝥素 (norcantharidin ,NCTD)对人胆囊癌GBC SD细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法　将NCTD作用于经体外培养的人胆囊癌GBC SD细胞 ,采用四氮唑盐比色 (MTT)法进行体外细胞杀伤实验 ,测定NCTD对GBC SD细胞生长的抑制率与剂量效应、时间效应的关系 ;采用流式细胞术测定NCTD处理后的GBC SD细胞的细胞周期及凋亡率 ;并通过光电显微镜观察其细胞形态学改变。结果　NCTD浓度为 10 μg/ml时 ,对GBC SD细胞的生长有抑制作用 ,且随药物浓度升高其抑制作用增强 ,呈剂量效应关系 ,NCTD对GBC SD细胞的半数抑制浓度 (IC50 )为 60 μg/ml;NCTD作用 6h后对GBC SD细胞生长具有抑制作用 ,48h时抑制作用最明显 ,呈时间效应关系。经NCTD作用后 ,流式细胞仪显示 :G2 M期的细胞明显增多 ,S期细胞明显减少 ,细胞凋亡率上升 ;光镜检查显示 :GBC SD细胞可出现细胞固缩 ,胞膜突出 ,核碎裂等现象 ,并出现凋亡小体 ;电镜显示 :细胞微绒毛卷缩、高尔基体、线粒体等细胞器衰退 ,并可见典型的凋亡细胞。结论　N...     

去甲斑蝥素和去甲斑蝥酸钠释放及影响

目的:以去甲斑蝥素和去甲斑蝥酸钠为模型药物,比较其从聚合物基质中的释放行为。方法:采用混合和压膜方法制备载药的聚己内酯片,然后剪切成小片后考察其在不同浓度的磷酸缓冲盐和含有不同浓度氯化钠的磷酸缓冲盐中的释药行为,并探讨其释药机制。结果:去甲斑蝥酸钠的释药行为受磷酸缓冲盐浓度以及磷酸缓冲盐中氯化纳浓度的影响,而去甲斑蝥素的释药行为则基本不受其影响。结论:去甲斑蝥素和去甲斑蝥酸钠从聚合物中释药行为差异主要由药物渗透压引起,渗透压是影响药物释放的重要因素。     

去甲斑蝥素对人真皮淋巴管内皮细胞的影响

目的探讨去甲斑蝥素（NCTD）对人真皮淋巴管内皮细胞（HDLEC）增殖、迁徙的抑制以及诱导凋亡的作用,以寻找一种安全、有效、实用的“抗淋巴管生成”制剂。方法通过HDLEC二维培养,应用MTT法计算NCTD对HDLEC的抑制率：应用Hoechst33258荧光染色、划线法和倒置显微镜、透射电镜检测、观察NCTD对HDLEC增殖、迁徙的抑制和诱导凋亡作用。结果MTT法测得不同浓度和时间的NCTD对HDLEC的增殖有明显抑制作用（P〈O．01）,其半数有效浓度（IC50）为0．0068mg／ml;应用Hoechst染色、倒置显微镜、透射电镜以及划线法,可观察到NCTD对HDLEC的形态和细胞的增殖具有显著的抑制和直接杀伤作用,并能促进、诱导HDLEC凋亡,其作用随NCTD浓度而加强（P〈0．01）,同时可见NCTD对HDLEC的迁徙亦有明显的抑制作用（P〈0．01）。结论NCTD对HDLEC的增殖和迁徙有明显的抑制作用,且有剂量依赖性。     

抗癌药物对人胰腺癌细胞小分子RNA 155及B细胞整合簇表达的影响

目的 了解抗癌药物对人胰腺癌细胞小分子RNA 155(miR-155)及其前体B细胞整合簇(BIC)RNA表达的影响.方法 人胰腺癌PANC-1细胞分别给予吉西他滨等抗癌药物处理后,实时定量RT-PCR测定BIC RNA和成熟的miR-155表达变化情况.应用磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)相关激酶抑制剂渥曼青霉素了解PI3K相关激酶是否与BIC RNA的调节有关.结果 经抗癌药物处理后,PANC-1细胞内BIC RNA表达显著上调,1.0、2.5、5.0、10.0 mg/L吉西他滨处理后48 h BIC RNA 的表达量分别是37.1 ±4.1、29.0±5.7、21.0±7.6、40.4.±9.0,均高于对照组(1.6±1.1,均P＜0.05);处理后72 h BIC RNA表达分别为27.7 ±3.1、43.1 ±1.2、31.8±5.4、23.1±1.4,均明显高于对照组(1.0±0.1,均P＜0.05),10 mg/L 5-氟尿嘧啶和100 mg/L博来霉素处理后48 h,BIC RNA表达分别为5.2±1.1和11.5±0.7,均高于对照组(1.7±0.7,均P＜0.05).各浓度吉西他滨处理后48h,PANC-1细胞内miR-155水平与对照组比差异无统计学意义(P＞0.05),但处理后72 h,miR-155水平高于对照组(2.21±0.40、1.86±0.03、2.47±0.04、3.24±0.05比1.11±0.09,P＜0.05).吉西他滨诱导的BIC RNA上调可以被渥曼青霉素抑制,1μmol/L渥曼青霉素+5 mg/L吉西他滨组和10μmol/L渥曼青霉素+5 mg/L吉西他滨组BIC RNA表达均低于5 mg/L吉西他滨组(5.34±1.11、1.26±0.07比11.82±3.11,均P＜0.05).结论 抗癌药物处理能明显诱导人胰腺癌PANC-1细胞BIC RNA上调,并引起成熟miR-155上调,吉西他滨诱导的BIC RNA上调与PI3K信号通路相关.     

PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2信号通路对胰腺癌PANC-1细胞VEGF表达的影响

目的:探讨PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2信号通路对人胰腺癌PANC-1血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:抑制剂LY294002和PD98095分别处理人胰腺癌PANC-1细胞,Western blotting检测细胞VEGF蛋白表达。结果:分析表明LY294002和PD98095处理后的PANC-1细胞的磷酸化AKT、磷酸化ERK1/2及VEGF蛋白表达水平均明显低于对照组VEGF(P<0.05)。结论:抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2细胞信号通路能够下调VEGF蛋白表达,进而抑制肿瘤新生血管的生成及浸润转移能力。     

健择诱导人胰腺癌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨健择(盐酸吉西他滨)诱导胰腺癌细胞凋亡可能的途径.方法 采用RT-PCR、Western-blot及激光密度扫描技术、Annexin Ⅴ-FITC/ PI双染法对健择诱导胰腺癌Panc-1细胞发生凋亡过程中caspase-3、bax和survivin基因表达及细胞凋亡率进行了检测分析.结果 健择可以诱导胰腺癌细胞发生凋亡,5 mg/L组24 h凋亡率达(18.83±0.78)%,凋亡率随健择浓度升高而升高,25 mg/L组在用药48 h后凋亡率高达(42.47±2.77)%.并且caspase-3、bax基因表达量随细胞凋亡的发生而升高, 与健择的浓度成正比关系;但survivin基因表达量随细胞凋亡的发生而降低,与健择的浓度成反比关系.结论 凋亡调节基因bax、caspase-3的上调及survivin的下调可能与健择诱导胰腺癌细胞凋亡有关系.     

鞘鞍醇激酶-1对胰腺癌SW1990细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨鞘鞍醇激酶-1(SPK1)对胰腺癌SWl990细胞增殖和凋亡的影响.方法 培养的胰腺癌SW1990细胞株,实验分为DMS组、PMA组和对照组,各组细胞接种于孔板中,每组设3个复孔,每个实验至少重复3次.DMS组加入N,N-二甲基鞘氨醇(DMS,50μmol/L),PMA组加入佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA,100 nmol/L),对照组按常规培养,采用MTT法和克隆形成实验检测细胞生长增殖的变化,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR检测SPK1 mRNA的表达,Western blot检测SPK1蛋白的表达.结果 PMA组细胞的增殖活力[OD值:(1.37±0.03),细胞克隆数目:(292.45±10.68)]较对照组[OD:(1.00±0.01),细胞克隆数目:(215.34±12.23)]显著增加,DMS组细胞的增殖活力[OD值:(0.65±0.02),细胞克隆数目:(130.56±15.6)]较对照组显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05).PMA组细胞凋亡率[(9.7±0.62)%]较对照组[(16.71±1.53)%]明显下降,DMS组细胞凋亡率[(31.7±1.32)%]较对照组明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01),PMA组SPK1 mRNA表达水平(0.202±0.013)及蛋白表达水平(0.258±0.015)较对照组[SPK1 mRNA:(0.148±0.006),蛋白:(0.182±0.044)]显著增加,而DMS组SPK1 mRNA表达水平(0.112±0.022)及SPK1蛋白表达水平(0.101±0.034)较对照组显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 SPK1与胰腺癌细胞的增殖和凋亡密切相关,SPK1的激活可促进胰腺癌细胞的增殖并抑制细胞的凋亡.     

蟾毒灵对CAPAN-2胰腺癌细胞增殖和细胞周期的影响

目的 研究蟾毒灵在胰腺癌CAPAN-2细胞系中的抗肿瘤作用,探讨其在胰腺癌中的抗肿瘤分子机制。方法 CCK-8法测定蟾毒灵对人胰腺癌CAPAN-2细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测蟾毒灵对细胞凋亡和细胞周期的影响;Western blotting法检测蟾毒灵作用于CAPAN-2细胞后Caspase-3酶原(pro-caspase-3)、Bcl-2、Bax、CDC25C、cyclinB1、CDC2蛋白表达水平的变化情况。结果 蟾毒灵对胰腺癌CAPAN-2细胞有抑制增殖的作用,并呈现出时间和浓度依赖性;蟾毒灵未能诱导CAPAN-2细胞凋亡,但经蟾毒灵处理后,CAPAN-2细胞周期被阻滞在G2/M期;经蟾毒灵处理后,CAPAN-2细胞中CDC25C、cyclinB1、CDC2等关键周期蛋白的表达量显著下降,但是pro-caspase-3、Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白的表达没有发生明显改变。结论 蟾毒灵可显著抑制胰腺癌CAPAN-2细胞增殖,通过诱导G2/M细胞周期阻滞而非诱导细胞凋亡,在CAPAN-2细胞中发挥抗肿瘤作用。     

Bcl-2和Beclin-1在胰腺癌中的表达及其相关性研究

目的探讨Bcl-2和Beclin-1在胰腺癌发生发展过程中的作用,分析胰腺癌组织中Bcl-2和Beclin-1的蛋白表达是否具有相关性。方法收集胰腺癌、胰腺外分泌良性肿瘤、慢性胰腺炎、正常胰腺组织各6例,分别标记为A组、B组、C组、D组。采用实时荧光定量PCR检测各组中Bcl-2mRNA和Beclin-1mRNA表达情况。采用免疫组织化学法检测各组中Bcl-2蛋白及Beclin-1蛋白的表达情况。结果 A、B、C 3组Bcl-2mRNA和蛋白表达水平均高于D组,其中A组表达水平最高,与其它各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。A组Beclin-1mRNA和蛋白表达水平低于D组,差异有统计学意义(P<0.05),但与C组比较差异无统计学意义(P>0.05);其中A组表达水平最低,D组表达水平最高。胰腺癌中Bcl-2和Beclin-1蛋白的表达呈负相关(r=-0.827,P=0.042)。结论胰腺癌组织中Bcl-2表达水平上调,抑制凋亡,Beclin-1表达水平下调,抑制自噬。Bcl-2和Beclin-1在胰腺癌中表达呈负相关,两者共同作用可促进胰腺癌的发生发展。     

敲低MSX2对胰腺癌PANC-1细胞上皮-间充质转化的影响

目的研究MSX2 基因在胰腺癌PANC-1 细胞的上皮-间充质转化（EMT）/间充质-上皮转化（MET）转变中的作用。方法
通过脂质体2000将含有MSX2干扰序列的质粒（共3种,分别命名为shMSX2-1、shMSX2-2和shMSX2-3,转染空质粒的阴性对
照组NC）转染PANC-1细胞,利用Real-time RT-PCR、Western blot等技术检测MSX2在基因和蛋白水平的表达,检测干扰效率,
并选取干扰效率最高的一组用于后续试验;进而检测EMT相关上皮标志分子E-cadherin、间质标志分子Vimentin在基因和蛋白
水平的表达变化;采用CCK-8法检测干扰前后细胞的增殖能力变化,Transwell和划痕试验比较细胞的侵袭转移能力变化。结
果3组干扰质粒中shMSX2-1的干扰效率最高,CCK-8试验结果显示敲低MSX2可明显抑制PANC-1细胞增殖能力,与对照组
相比差异有显著性（P<0.05）;敲低MSX2 可明显抑制PANC-1 细胞的侵袭转移,差异有统计学意义（P<0.05）;EMT相关分子
E-cadherin表达升高,而Vimentin表达降低,且与对照组相比均有统计学意义（P<0.05）;倒置显微镜下观察敲低MSX2后细胞形
态由松散的长梭形变成紧密连接的椭圆形。RT-PCR 发现敲低MSX2 后转录因子twist 和snail 表达降低（P<0.05）,而slug 和
zeb1 表达变化无差异（P>0.05）。结论敲低MSX2 可抑制胰腺癌PANC1 细胞的增殖、侵袭转移能力,并且上皮标志分子
E-cadherin表达升高,间质标志分子Vimentin表达降低,有发生MET的趋势,MSX2可能通过twist、snail发挥其抑制作用