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1.
短干扰RNA对人β淀粉样前体蛋白裂解酶基因表达的影响   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的探讨β淀粉样前体蛋白裂解酶(β-site APP cleaving enzyme,BACE)的短干扰RNA(short interfering RNAs,siRNA)对BACE在神经母细胞瘤细胞中的表达的影响,为阿尔茨海默病(AD)的治疗提供新的手段。方法采用PCR分别扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、U6启动子和靶向BACE的特异性小干扰RNA(siBACE),随后将相应的序列片段克隆入真核表达载体pLXSN,通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体pLXSN/EGFP-U6-siBACE进行鉴定;制备稳定高表达BACE基因的神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株,用荧光显微镜和免疫组织化学的方法观察siRNA对BACE表达的影响。结果限制性内切酶酶切和测序结果均表明成功构建了靶向BACE的短干扰RNA的逆转录病毒载体pLXSN/EGFP-U6-siBACE;并能特异性地抑制BACE在神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株中的表达。结论成功构建了针对BACE的短干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siBACE,并能有效抑制哺乳动物BACE基因的表达,该研究将为利用RNA干扰技术作为治疗AD的新方法提供重要的实验基础。  相似文献   

2.
目的:探讨β淀粉样前体蛋白裂解酶(β-site APP cleaving enzyme,BACE)的短干扰RNA(short interfering RNAs,siRNA)是否能抑制BACE在哺乳动物细胞中的表达,为阿尔茨海默病(AD)的治疗提供新的手段。方法:采用PCR分别扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、U6启动子和靶向BACE的特异性小干扰RNA(siBACE),随后将相应的序列片段克隆入真核表达载体pLXSN,通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体pLXSN/EGFP-U6-siBACE进行鉴定;制备稳定高表达BACE基因的神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株,用荧光显微镜和免疫组织化学的方法观察siRNA对BACE表达的影响。结果:成功构建了靶向BACE的短干扰RNA的逆转录病毒载体pLXSN/EGFP-U6-siBACE,并能特异性地抑制BACE在神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株中的表达。结论:成功构建了针对BACE的短干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siBACE,并能有效抑制哺乳动物BACE基因的表达,为利用RNA干扰技术作为治疗AD的新方法提供了重要的实验基础。  相似文献   

3.
目的:探究天青B对淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)代谢及β淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)生成的影响.方法:用天青B处理能稳定表达APP695基因的Neuron-2a细胞(N2a-APP695).利用Western blot检测APP、可溶性APPα(soluble APPα,sAPPα)和β-分泌酶 1(β-site APP cleaving enzyme 1,BACE1)的水平,利用 ELISA 检测 Aβ 的水平.采用 BACE1酶活性检测试剂盒检测BACE1酶活性的抑制.采用t检验分析各组数据.结果:①天青B在5、10、15、20 μmol/L的终浓度下不会影响N2a-APP695细胞的活力.②ELISA检测结果显示天青B能够降低Aβ1-40(P=0.002)和Aβ1-42(P=0.036)的水平.③Western blot检测结果显示天青B能够降低全长APP(P=0.018)和sAPPα(P=0.006)蛋白的水平,但不影响BACE1蛋白的水平(P>0.05).④BACE1酶活性检测试剂盒检测结果显示天青B能降低BACE1的活性,其活性抑制率为66.0%(P=0.000).结论:天青B通过抑制APP的表达和BACE1的活性从而抑制Aβ的生成.  相似文献   

4.
目的:研究糖尿病小鼠胰腺组织中Netrin?1的表达并探讨其在糖尿病发生过程中的作用。方法:C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组和糖尿病模型组,应用RT?PCR和Western blot方法分别检测小鼠胰腺组织中Netrin?1 mRNA和蛋白的变化;在正常和异常葡萄糖浓度下培养大鼠胰岛细胞瘤细胞(ins?1),MTT检测细胞活性,RT?PCR和Western blot方法分别测定Netrin?1 mRNA和蛋白的表达情况。结果:糖尿病小鼠胰腺组织内Netrin?1的mRNA和蛋白表达增加,高浓度葡萄糖刺激ins?1细胞上调Netrin?1 mRNA和蛋白的表达。结论:糖尿病小鼠胰腺组织表达Netrin?1的水平增加,这与血糖异常相关,Netrin?1可能与糖尿病的发生发展相关。  相似文献   

5.
目的构建β位淀粉样前体蛋白裂解酶2(β-site APP-cleaving enzyme 2,BACE2)基因敲除斑马鱼动物模型并及其初步探索其应用。方法运用CRISPR/Cas9技术,在斑马鱼中设计针对靶点的gRNA,使之诱导靶点突变,经测序鉴定得到突变体。结果BACE2纯合突变体在早期部分无法存活,RT-PCR结果显示BACE2基因在斑马鱼的早期发育中持续表达。结论 BACE2基因敲除的斑马鱼动物模型将为进一步研究BACE2基因在斑马鱼胰腺发育中的作用和针对糖尿病的药物靶点筛选提供有效工具。  相似文献   

6.
目的: 观察血清尿酸水平对大鼠认知功能和海马组织中β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)表达的影响,并探讨其相关机制。方法: 将24只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、低剂量模型组、中剂量模型组和高剂量模型组,每组6只,后3组采用酵母膏饲料喂养联合不同浓度氧嗪酸钾腹腔注射的方法制备高尿酸血症动物模型,共4周。通过Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力;通过ELISA和蛋白免疫印迹法检测各组大鼠海马组织中Aβ及Aβ生成和清除途径中关键蛋白的表达水平。结果: 与对照组相比,各模型组尿酸水平均明显升高(P<0.01);4组大鼠穿越平台次数及在平台象限停留时间无明显差异。与对照组相比,各模型组大鼠海马组织中Aβ1 42、淀粉样肽前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)、β-分泌酶1(β-site APP cleaving enzyme 1,BACE1)、中性肽链内切酶(neprilysin,NEP)、胰岛素降解酶(insulin degrading enzyme,IDE)表达均增加,且随血清尿酸水平的增加而升高;而ATP结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-binding cassette transporter G2,ABCG2)表达则减少,且随血清尿酸水平的增加而逐渐降低。结论: 高尿酸血症能促进大鼠海马组织中Aβ沉积,可能通过APP-BACE1途径增加Aβ的生成或ABCG2途径减少Aβ清除,而不是通过NEP、IDE降解途径减少Aβ降解;高尿酸血症对大鼠认知功能无明显影响。  相似文献   

7.
目的 探讨核因子相关因子2 (Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)通路与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路相互作用对2型糖尿病(T2DM)大鼠胰岛细胞凋亡和半胱天冬酶-3(Caspase-3)蛋白表达的影响及其可能机制.方法 将60只雄性Wistar大鼠分为正常对照组(NC组,n=20)、糖尿病模型组(DM组,n=20)和叔丁基对苯二酚干预组(tBHQ组,n=20),干预8周后处死所有大鼠,TUNEL检测胰岛细胞凋亡,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清及胰腺组织中丙二醛(MDA)水平,Western blot检测AKT、p-AKT、总Nrf2、核Nrf2、血红素氧合酶1(HO-1)、Caspase-3在胰岛细胞中蛋白表达水平.结果 与NC组比较,DM组胰岛细胞凋亡率显著增加(P=0.000),而tBHQ组胰岛细胞凋亡率明显低于DM组(P=0.000).DM组血清及胰腺组织中MDA水平较NC组明显升高(P=0.000),而tBHQ组血清及胰腺组织中MDA水平明显低于DM组(P=0.000).DM组p-AKT、总Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表达水平均较NC组显著降低(P=0.000),Caspase-3蛋白表达水平较NC组明显升高(P=0.000);与DM组比较,tBHQ组p-AKT、总Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表达水平均明显增加(P=0.000),Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P=0.017);AKT蛋白表达水平在3组间差异无统计学意义(P>0.05).结论 Nrf2/ARE通路与PI3K/AKT通路相互作用对抑制胰岛细胞Caspase-3的表达及延缓胰岛细胞凋亡进程产生重要的保护作用.  相似文献   

8.
目的:探讨激活素A(Act A)及其结合蛋白follistatin(FS)在小鼠胰腺损伤过程中的表达,为胰腺损伤后组织修复与重建奠定基础。方法:雄性ICR小鼠21 只,随机分为对照组(n=6)与实验组(n=15)。应用一次性大剂量腹腔注射链脲菌素(STZ)制备小鼠胰岛损伤模型,免疫组织化学染色法检测Act A和 FS蛋白表达, 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Act A和FS mRNA相对转录水平。 结果:免疫组织化学染色显示,Act A主要分布在正常小鼠胰岛细胞,腺泡细胞也有表达;FS仅表达在小鼠胰岛细胞,在腺泡细胞不表达。RT-PCR检测结果显示,Act A和FS mRNA均在正常小鼠胰腺组织表达,与对照组比较,实验组小鼠Act mRNA表达随着诱导时间的延长表达量进行性减少(P<0.01),而FS mRNA在诱导的第7天表达明显增加,第14和21天下降(P<0.01)。结论:Act A及FS主要表达在小鼠胰岛组织,在STZ诱导胰腺损伤过程中Act-FS系统表达失平衡,可能与糖尿病的发生、发展有关。  相似文献   

9.
目的通过研究糖基化终末产物(AGEs-BSA)对培养的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)β-淀粉样蛋白(Aβ)的生成,以及淀粉样前体蛋白(APP)及相关酶—β-分泌酶(BACE1)、γ-分泌酶(PS1)的表达的影响,在体外水平探讨AGEs-BSA在阿尔茨海默病(AD)发病中的作用及其可能的机制。方法以培养的SH-SY5Y细胞为模型,将细胞随机分为4组。用MTT实验得到的AGEs-BSA最佳干预时间及浓度干预细胞,用免疫细胞化学方法及ELISA方法观察及检测各组细胞内Aβ1-40、Aβ1-42表达,用免疫印迹法检测各组细胞内APP、BACE1、PS1变化。结果 BSA组与空白对照组相比APP、BACE1、PS1、Aβ的表达无明显差异(P>0.05);AGEs-BSA组与BSA组相比APP、BACE1、PS1、Aβ的表达明显增加(P<0.05);AGEs-BSA+抗RAGE中和抗体组APP、BACE1、PS1、Aβ的表达较单纯AGEs-BSA组明显减少(P<0.05),但仍高于BSA组(P<0.05)。结论 糖基化终末产物能够促使SH-SY5Y细胞中APP的表达增加,并通过上调BACE1、PS1的活性使Aβ生成增加。通过阻断其与特异性受体RAGE的结合可以部分减少APP、BACE1、PS1及Aβ的表达和生成。  相似文献   

10.
目的:研究史他汀类药物通过其非胆固醇依赖性作用对抗β- 淀粉样蛋白(Aβ)的 过程中β- 淀粉样肽前体蛋白(APP)代谢、尼古丁型乙酰胆碱受体(nAChRs)表达以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的相互作用关系,探讨史他汀类药物对阿尔茨海默氏病(AD)的可能性干预途径。方法:选择原代培养神经细胞及过表达APP670/671 的SHSY-5Y 细胞,用史他汀类药物(包括洛伐他汀、阿托伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀)、Aβ、nAChR 拮抗剂或细胞外信号调节白白激酶(ERK)抑制剂分别或合并处理。用生化方法测定细胞存活率、胆固醇含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量;用蛋白印迹法检测nAChR 多种亚单位蛋白表达水平,APP 代谢途径中α分泌型淀粉样前体蛋白(αAPP)、β分泌型淀粉样前体蛋白(βAPP)、β淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)、β淀粉样前体蛋白裂解酶2(BACE2)及解聚素金属蛋白酶结构域蛋白10 (ADAM10)等的蛋白表达水平,MAPK 通路中ERK、c-Jun 氨基末端激酶(JNK)及p38 磷酸化水平;实时荧光定量PCR 测定nAChR 亚单位mRNA 表达水平。结果:用Aβ或Aβ寡聚体处理体外培养神经细胞48 小时后见细胞存活率下降、SOD 的活性降低和MDA含量增高等毒性作用,用史他汀类药物预处理细胞24 小时,均能减轻Aβ引起的神经毒性作用。用洛伐他汀处理培养细胞24 小时后,发现α7 nAChR 蛋白及mRNA 表达水平均升高,而α4、α3 和bβ2 未见明显改变;洛伐他汀处理引起αAPP 分泌增加、βAPP减少、BACE1 蛋白表达水平降低、而BACE2 和ADAM10 增高。洛伐他汀处理亦导致phospho-ERK1/2 蛋白表达水平升高,而phospho-JNK 和phospho-p38 未见明显改变。联合应用洛伐他汀与MAPK/ERK1/2 抑制剂U0126 或α7 nAChR 拮抗剂MLA 处理培养细胞,结果显示U0126 可以抑制细胞phospho-ERK1/2 的磷酸化,降低α7 nAChR 蛋白表达水平,减少αAPP 的分泌,同时阻断洛伐他汀引起的MAPK/ERK1/2 信号转导通路活化、α7 nAChR 蛋白表达水平升高以及αAPP 分泌增加等作用;MLA 处理神经细胞仅能减少αAPP 的分泌,对其自身的蛋白表达及phospho-ERK1/2 的磷酸化均无明显影响,MLA 与洛伐他汀共同处理细胞后仅见洛伐他汀诱导的αAPP 分泌增加作用被减弱,而MAPK/ERK1/2 的活化以及α7 nAChR 蛋白表达水平的上调均未被减弱。结论:采用不引起细胞胆固醇水平改变的史他汀类药物剂量处理培养细胞,能减轻Aβ引起神经细胞毒性作用,引起MAPK/ERK1/2 信号转导通路活化、α7 nAChR 蛋白表达水平升高以及αAPP 分泌增加;其作用机制可能是首先活化phosphor-ERK1/2 信号转导通路,该通路的活化刺激α7 nAChR 的表达,最终增强APP 的非淀粉样代谢过程,活化α- 分泌酶,从而促进αAPP 的分泌,产生对抗Aβ的神经保护作用。  相似文献   

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