ILK 介导 TGF-β／Smad 通路诱导肾小球内皮细胞-间充质细胞转分化的研究

目的：观察 TGF‐β1在肾小球内皮细胞‐间充质细胞转分化（EndM T ）中的作用,探讨 ILK 介导 TGF‐β／Smad 信号通路在 EndM T 过程中的作用。方法以体外培养人肾小球内皮细胞为研究对象,分为空白对照组、TGF‐β112．5、25．0、50．0 ng／mL 组、TGF‐β150．0 ng／mL ＋Ⅰ型受体抑制剂（LY364749）5．0μmol／L 组和 ILK 抑制剂（QLT‐0267）5．0μmol／L 组,各组细胞在上述处理因素下培养48、72 h ,以 RT‐PCR 测定 P‐Smad2／3和 ILK mRNA 的表达水平,以 Western blot 测定 P‐Smad2／3、ILK 及E‐cadherin 、CD31、α‐SMA 和 FSP‐1蛋白的表达水平。结果（1）TGF‐β1可剂量依赖性诱导 HGEnCP‐Smad2／3和 ILK mRNA 水平显著升高（P＜0．01）以及 P‐Smad2／3、ILK 、α‐SMA 和 FSP‐1蛋白水平显著升高（P＜0．01）,但是剂量依赖性诱导 E‐cadherin 和CD31蛋白水平显著降低（P＜0．01）;（2）TGF‐β1Ⅰ型受体抑制剂和 ILK 抑制剂可显著抑制 TGF‐β1诱导 ILK mRNA 水平的升高（P＜0．01）以及 ILK 、α‐SMA 和 FSP‐1蛋白水平的升高（P ＜0．01）,抑制 E‐cadherin 和 CD31蛋白水平的降低（P＜0．01）;（3） TGF‐β1Ⅰ型受体抑制剂可显著抑制 TGF‐β1诱导 P‐Smad2／3 mRNA 和蛋白水平的升高（P ＜0．01）,但是 ILK 抑制剂对 P‐Smad2／3 mRNA 和蛋白无显著影响（P＞0．05）。结论 TGF‐β1可促进肾小球内皮‐间充质细胞转分化,ILK 作为下游效应因子介导 TGF‐β／Smad 信号通路参与了该过程,可能在肾脏纤维化过程中发挥重要作用。     

骨形成蛋白-7对MCP-1诱导人肾小管上皮细胞转分化和TGF-β1-Smad 3信号转导的作用

目的探讨骨形成蛋白-7（BMP-7）对单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）诱导体外培养人肾小管上皮细胞转分化的作用,并初步探讨该作用与转化生长因子-β1（TGF-β1）、Smad3表达变化的关系。方法将体外培养HK-2细胞分为以下各组：阴性对照组;阳性对照组：TGF-β1（5ng／ml）处理;MCP-1（0．1,1,10及50ng／ml）组,BMP-7组（0．1,1,10,50ng／ml）;MCP-1（1ng／ml）加BMP-7（50ng／ml）组;MCP-1（1ng／ml）加MCP-1中和抗体（5μg／ml）组。应用半定量RT—PCR方法检测HK-2细胞α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）mRNA表达,ELISA方法测定上清液中Ⅰ型胶原分泌,Western blot方法检测HK-2细胞TGF-β1及Smad3表达。结果MCP-1（0．1,1ng／ml）组HK-2细胞α—SMAmRNA表达较阴性对照组明显增强（P〈0．01）。ELISA方法测定MCP-1（0．1,1ng／ml）组上清液中I型胶原分泌明显高于阴性对照组（P〈0．01）。MCP-1中和抗体与MCP-1（1ng／ml）共同作用24h后。HKC细胞α—SMAmRNA表达几乎被完伞抑制（P〈0．001）,而BMP-7（50ng／ml）与MCP-1（1ng／ml）共同作用24h后HK-2细胞α—SMAmRNA表达仅部分被抑制（P〈0．01）;MCP-1中和抗体或BMP-7（50ng／ml）与MCP-1（1ng／ml）共同作用24h后Ⅰ型胶原分泌较MCP-1（1ng／ml）组明显降低（P〈0．05）。Western blot方法检测显示,MCP-1（1ng／ml）组HK-2细胞TGF-β1及Smad3表达水平均较阴性对照组明显上调（P〈0．01）。MCP-1中和抗体或BMP-7（50ng／ml）与MCP-1（1ng／ml）共同作用24h后,HK-2细胞TGF-β1表达均分别比MCP-1（1ng／mL）单独作用明显下调,以MCP-1中和抗体的作用更强（P〈0．01,P〈0．05）;在MCP-1中和抗体或BMP-7作用24h后,Smad3表达也有类似下调（P〈0．01,P〈0．05）。结论MCP-1能诱导体外培养的HK-2细胞发生转分化,该作用可能与TGF-β1及Smad3表达上调有关。BMP-7能部分抑制MCP-7诱导HK-2细胞转分化,该作用可能与TGF-β1及Smad3表达部分下调有关;间时提示MCP-1诱导的转分化可能涉及非TGF—β依赖的细胞信号传导途径,需进一步研究。     

CTGF反义寡核苷酸对人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的研究结缔组织生长因子（CTGF）反义寡核苷酸（ASODN）对人肾小管上皮细胞（HKC）转分化的影响。方法用巨噬细胞趋化因子-1（MCP-1）和马兜铃酸Ⅰ（AAⅠ）联合诱导HKC转分化模型。实验设空白对照组、模型对照组、PEI组、CTGFASODN10ng/mL组和CTGF ASODN100ng/mL组,分别采用WST-8法、流式细胞术、RT-PCR法、细胞免疫组织化学法检测不同浓度的CTGF ASODN对HKC转分化模型细胞增殖和细胞周期的影响,以及α-SMA mRNA表达和α-SMA、TGF-β1、Fibronectin（FN）蛋白表达的变化。结果 100ng/mL的CTGF ASODN对MCP-1和AAⅠ联合诱导HKC转分化细胞具有促进细胞增殖的作用,并可减少实验模型导致的细胞S期阻滞,降低α-SMA mRNA表达,减少α-SMA、TGF-β1和FN蛋白的表达。结论 CTGFASODN能够抑制MCP-1和AAⅠ导致的人HKC转分化。     

磷脂酰肌醇3激酶/Akt通路参与TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞间质转分化过程

目的：探讨磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）／Akt通路在转化生长因子β1（TGF-β1）体外诱导的人肾小管上皮细胞（HKC）间质转分化（EMT）过程中的作用及意义。方法：将HKC细胞株细胞分成正常对照组、TGF-β1组及TGF-β1＋PI3K特异性抑制剂Wortmannin组，选取不同时相，免疫印迹（Western blot）测定总．Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的变化；Akt磷酸化水平用磷酸化Akt和总Akt水平的比值表示。结果：正常体外培养的HKC有微量的p-Akt、α-SMA表达，加入10ng／ml TGF-β1刺激0．5h后p-Akt水平显著升高，1h升至顶峰后逐渐减弱；α-SMA在10ng／mlTGF-β1诱导48h后表达显著升高。同时加用Wortmannin 10nmol／L组p-Akt、α-SMA表达明显抑制。结论：PI3K／Akt信号系统参与TGF-β1介导的EMT过程，PI3K特异性抑制剂wo永mannin可有效抑制TGF-β1介导的HKC的EMT过程。     

结缔组织生长因子对肾小管上皮细胞转分化的调节机制

目的 观察结缔组织生长因子（CTGF）对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化的直接影响,并探讨阻断内源性CTGF表达对转化生长因子- β1（TGF-β）诱导人肾小管上皮细胞转分化的干预效果,以阐明CTGF在肾小管上皮细胞转分化中的作用。方法 体外培养人近曲小管上皮细胞（HKC）。在观察CTGF对HKC的直接作用时,将HKC细胞分为三组：（1）对照组;（2）小剂量CTGF组：培养液中加入重组人CTGF（rhCTGF）,终浓度为2．5μg／L;（3）大剂量CTGF组：rhCTGF终浓度为5．0μg／L。在探讨CTGF在TGF-β诱导HKC转分化中的作用时,将细胞分为4组：（1）正常对照组;（2）TGF-β刺激组（培养液加入重组人TGF-β1蛋白,浓度为10．0μg／L）;（3）TGF-β1＋CTGF正义寡核苷酸（ODN）组（先以CTGF正义ODN转染HKC,再加TGF-β1刺激）;（4）TGF-β1＋CTGF反义ODN组（先以CTGF反义ODN转染HKC,再加TGF-β1刺激）。用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定HKC α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）和Ⅳ型胶原（col Ⅳ）mRNA水平的变化;间接免疫荧光方法检测HKC胞浆内α—SMA的表达;流式细胞仪检测α—SMA阳性细胞百分率;ELISA方法测定培养液上清中col Ⅳ的浓度。结果 不同浓度rhCTGF作用于HKC24h后,α-SMAmRNA水平显著升高（P〈0．01）,而colⅣmRNA表达水平明显下降（均P〈0．01）;刺激48h后,胞浆α—SMA表达明显增强,流式细胞仪测得三组细胞α-SMA阳性百分率依次为：2．4％、38．9％、65．5％（P〈0．01）;ELISA结果表明,rhCTGF抑制了colⅣ的分泌（P〈0．01）。TGF-β1可诱导HKC高表达CTGF和α-SMA。转染后6h,CTGF反义ODN可显著抑制HKC表达CTGF和α-SMA mRNA（P〈0．01）。转染后48h,CTGF反义ODN可明显抑制胞内α-SMA蛋白合成。结论 CTGF在体外能刺激肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞（MyoF）转分化,而CTGF反义ODN的导人可有效抑制TGF-β1诱导的转分化过程。因此,CTGF可能是调节肾小管上皮细胞转分化的重要因子。     

CTGF反义寡核苷酸对人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 研究结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ASODN)对人肾小管上皮细胞(HKC)转分化的影响.方法 用巨噬细胞趋化因子-1(MCP-1)和马兜铃酸Ⅰ(AAⅠ)联合诱导HKC转分化模型.实验设空白对照组、模型对照组、PEI组、CTGF ASODN 10 ng/mL组和CTGF ASODN 100 ng/mL组,分别采用WST-8法、流式细胞术、RT-PCR法、细胞免疫组织化学法检测不同浓度的CTGF ASODN对HKC转分化模型细胞增殖和细胞周期的影响,以及α-SMA mRNA表达和α-SMA、TGF-β1、Fibronectin(FN)蛋白表达的变化.结果 100 ng/mL的CTGF ASODN对MCP-1和AAⅠ联合诱导HKC转分化细胞具有促进细胞增殖的作用,并可减少实验模型导致的细胞S期阻滞,降低α-SMA mRNA表达,减少α-SMA、TGF-β1和FN蛋白的表达.结论 CTGF ASODN能够抑制MCP-1和AAⅠ导致的人HKC转分化.     

红细胞生成素对肾小管上皮-间充质细胞转化的抑制作用及其与VEGF表达变化的关系

目的探讨红细胞生成素（rHuEPO）对人肾小管上皮细胞（HKC）上皮-间充质细胞转化（EMT）的作用及其与该细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达变化的关系。方法体外培养HKC,以未处理的HKC为阴性对照,以8ng/ml的转化生长因子-β1（TGF-β1）处理的HKC为阳性对照,以不同浓度（0.1、1.0、10、50、100IU/ml）的rHuEPO与8ng/ml的TGF-β1共同处理HKC,或在不同时间（-24、0、12、24、36h）用同一浓度rHuEPO（100IU/ml）对8ng/ml的TGF-β1处理的HKC进行干预。应用RT-PCR方法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和VEGFmRNA转录水平,应用免疫印迹方法检测α-SMA、E钙黏蛋白以及VEGF的蛋白表达水平。结果rHuEPO以剂量和时间依赖的方式抑制TGF-β1诱导的HKCα-SMAmRNA和蛋白的表达（P〈0.05或P〈0.01）,保护性上调TGF-β1抑制的HKC细胞E钙黏蛋白的表达（P〈0.05或P〈0.01）;同时上调TGF-β1抑制的HKC细胞VEGFmRNA和蛋白的表达（P〈0.05或P〈0.01）。结论rHuEPO对TGF-β1诱导的EMT具有一定的抑制作用,并具剂量-时间依赖性;该作用可能与rHuEPO上调肾小管上皮细胞VEGF的表达有关。     

骨形态形成蛋白-7对体外培养肾小管上皮细胞TGF-β1诱导转分化的作用

目的观察骨形态形成蛋白-7(BMP-7)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人类肾小管上皮细胞(HKC)转分化的作用,并探讨其作用机制.方法将体外培养的HKC分为5组:(1)无血清培养基阴性对照组;(2)TGF-β1阳性对照组;(3)BMP-7单独作用组;(4)BMP-7与TGF-β1共同作用组;(5)BMP-7预处理后加入TGF-β1组.间接免疫荧光法测定HKC角蛋白(keratin)的表达;免疫组织化学方法测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及E-钙粘素(E-cadherin)表达;流式细胞技术测定α-SMA阳性HKC的百分数;半定量反转录PCR(RT-PCR)方法测定HKC细胞α-SMA、TGF-β1及其Ⅱ型受体mRNA的表达.结果TGF-β1与BMP-7共同作用HKC细胞48 h,α-SMA表达较阳性对照组减弱,而E-钙粘素及角蛋白表达较阳性对照组增强,与阴性对照组相比差异无显著性;BMP-7预处理后再加入TGF-β1作用HKC细胞48 h,α-SMA表达较阳性对照组减弱,而E-钙粘素及角蛋白表达较阳性对照组增强,与阴性对照组相比差异无显著性;流式细胞技术测定α-SMA阳性HKC的百分数,在BMP-7与TGF-β1共同作用组明显低于阳性对照组(9.7% vs 19.8%,5.8% vs 19.8%,P＜0.05).BMP-7组预处理组亦明显低于阳性对照组(8.7% vs 19.8%,P＜0.05).RT-PCR显示BMP-7与TGF-β1共同或者预处理HKC细胞,α-SMA mRNA表达分别为阳性对照组的15%和12%,而TGF-β1及其Ⅱ型受体mRNA表达水平分别为阳性对照的28%和19%及47%和36%.结论一定浓度的BMP-7与TGF-β1同时培养或预处理,都能抑制TGF-β1诱导的HKC细胞转分化;BMP-7可以预防和抑制HKC细胞TGF-β1及其Ⅱ型受体mRNA表达,这很可能是BMP-7抑制HKC细胞转分化的重要机制之一.     

红细胞生成素对高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响及其可能机制

目的：肾间质纤维化（ renal interstital fibrosia , RIF）的核心是肾小管上皮细胞转分化。探讨促红细胞生成素（Erythropoietin, EPO）对高糖诱导的正常人肾小管上皮细胞（human kidney cells, HK-2）转分化的影响及其可能机制。方法体外培养HK-2细胞,按随机数字表法分为空白对照组、高糖诱导组（高糖终浓度30 mmol/L）、甘露醇对照组（甘露醇浓度24．5 mmol/L）、EPO对照组（ EPO终浓度为20 U/mL）、5 U/mL EPO干预组、10 U/mL EPO干预组、20 U/mL EPO干预组及ROCK抑制剂（ Y27632）组（ Y27632终浓度为30μmol/L,加入Y2763230 min后加高糖,高糖终浓度为30 mmol/L）,各组均刺激24 h。应用RT-PCR法检测细胞 RhoA mRNA、ROCK1 mRNA 的水平;细胞免疫荧光法检测细胞 E-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（αsmoothmuscleactin,α-SMA）的表达;ELISA法检测上清液纤维连接蛋白（fibronectin, FN）的表达。结果 RT-PCR结果显示高糖诱导组RhoA mRNA及ROCK1 mRNA表达较空白对照组显著升高（1．400±0．022 vs 0．945±0．132,1．913±0．011 vs 1．007±0．002,P＜0．05）;5、10、20 U/mL EPO干预组,RhoA mRNA的表达水平（0．278±0．006、0．770±0．005、0．334±0．009）均较空白对照组（0．945±0．131）减少（P＜0．05）,ROCK1 mRNA的表达水平（1．418±0．006、0．919±0．004、0．477±0．002）较空白对照组（51．007±0．002）减少（P＜0．05）;ELISA及细胞免疫荧光结果显示高糖诱导组FN、α-SMA蛋白的表达较空白对照组明显增加[（14545．53±317．27）ng/mL vs （2582．50±87．20）ng/mL,0．335±0．006 vs 0．224±0．006,P＜0．05];直线相关性分析,高糖诱导组,5、10、20 U/mL EPO干预组RhoA mRNA与ROCK1 mRNA表达均呈正相关（P＜0．05）。高糖诱导组α-SMA较空白对照组上升,E-钙黏蛋白较空白对照组下降（P＜0．05）;EPO干预组及ROCK抑制剂组E-钙黏蛋白表达较高糖诱导组增加,而α-SMA表达下降（P＜0．05）;ELISA结果显示,EPO干预组ROCK抑制剂组FN表达较高糖诱导组下降（P＜0．05）,且下降程度与EPO浓度相关。结论 EPO可抑制高糖诱导的HK-2细胞转分化,从而延缓肾间质纤维化,其机制可能与RhoA/ROCK信号通路有关。     

肝细胞生长因子对IL-1α刺激肾小管上皮细胞肌纤维母细胞转分化的作用

目的研究肝细胞生长因子(HGF)对IL-1α诱导的肾小管上皮细胞肌纤维母细胞转分化(TEMT)及细胞分泌功能的影响。方法在体外培养的正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)中加入IL-1α 20ng／ml诱导．并加入大(1600ng／ml)、中(1200ng／ml)、小(800ng／ml)剂量HGF阻断，流式细胞仪和免疫组化法检测α-平滑肌肌动蛋白的表达；倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞形态变化；ELISA法测定培养细胞上清液分泌的粘连蛋白(FN)含量。结果IL-1α刺激后细胞转变为类似成纤维细胞形态；α-SMA阳性细胞百分数及α-SMA表达的平均荧光强度明显增加(P＜0．05)；培养上清液中FN含量增加(P＜0．05)。HGF可剂量依赖性地抑制IL-1α诱导NRK52E细胞形态学改变及α-SMA的表达(P＜0．05)，不同程度地抑制IL-1α的促FN分泌作用(P＜0．05)。单独加入不同剂量HGF对肾小管细胞无影响。结论HGF可抑制IL-1α诱导的TEMT作用，减少FN的分泌，对肾间质纤维化具有负性调节作用。     

地塞米松对马兜铃酸诱导的人肾小管上皮-间充质转化的作用及可能机制

目的探讨地塞米松(Dex)对马兜铃酸诱导的肾小管上皮-间充质转化(EMT)的影响及可能机制。方法体外培养的人肾小管上皮细胞(HKC)分为阴性对照组、马兜铃酸(AA,10μg/ml)作用组、Dex(100μmol/L)作用组、AA(10μg/ml)+无水乙醇(100μmol/L)组、AA(10μg/ml)+Dex(100、10、1、0.1、0.01μmol/L)共同作用组,培养细胞48h,应用激光共聚焦显微镜(CFMS)观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-cadherin)的表达,采用Real-timePCR和WesternBlot方法检测α-SMA、E-cadherin、p-Smad3、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad7mRNA和蛋白的表达。结果 AA作用48h后,CFMS观察发现HKC细胞E-cadherin表达减弱而α-SMA表达增强;地塞米松干预后,E-cadherin表达逐渐增强而α-SMA表达减弱,且呈剂量依赖性。Real-timePCR、WesternBlot结果均显示,与阴性对照组相比,AA组α-SMA、p-Smad3、TGF-β1mRNA和蛋白表达水平均显著增强,E-cadherin、Smad7mRNA和蛋白的表达均减弱(P0.05)。同AA作用组比较,AA+Dex共同作用组随Dex剂量增加,α-SMA、p-Smad3、TGF-β1mRNA和蛋白的表达逐渐减弱,E-cadherin、Smad7mRNA和蛋白的表达逐渐增强(P0.05),而无水乙醇却无此作用。结论 Dex可抑制AA诱导HKC细胞发生EMT,并同时下调EMT过程中TGF-β1和p-Smad3的表达、上调Smad7分子的表达,提示TGF-β1/Smad下调可能是Dex抑制EMT发生的机制之一。     

单核细胞趋化蛋白-1诱导肾小管上皮-肌成纤维细胞转化的作用及机制探讨

目的 探讨单核细胞趋化蛋白(MCP)-1诱导.肾小管上皮细胞发生上皮-肌成纤维细胞转化(EMT)的作用和细胞分子机制,主要是EMT过程中Erk1/2、P38MAPK、RhoA、RhoC、Snail表达水平的变化.方法 将HK-2细胞分为阴性对照组,阳性对照组(TGF-β1、5 μg/L),MCP-1作用组(0.1、1、10、100 μg/L),观察不同时间(12、24、48、72 h)MCP-1刺激与α-SMA表达水平之间的变化.用Western印迹方法检测肾小管上皮细胞PErk1/2、Erk1/2、P-P38MAPK、P38MAPK、RhoA蛋白水平的变化,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测RhoC、Snail基因水平的变化.此外,分别观察Erk、P38MAPK、Rho信号通路的阻断剂(PD98059、SB203580、Y27632)对MCP-1诱导EMT的影响.结果 在不同浓度MCP-1刺激下,HK-2细胞α-SMA mRNA及蛋白表达水平均明显增强,以1 μg/L刺激下表达最强;在1 μg/L MCP-1作用下,24、48、72 h α-SMA mRNA及蛋白表均达显著高于阴性对照组(均P＜0.05),48 h作用达到最高峰.在不同浓度(0.1、1、10、100 μg/L)MCP-1刺激5 min时,HK-2细胞(PErk1/2)/(Erk1/2)和(P-P38MAPK)/(P38MAPK)的比值均显著高于阴性对照组(均P＜0.05),并表现为剂量依赖性.不同浓度MCP-1刺激下RhoA蛋白水平和RhoC基因表达水平与阴性对照组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).PD98059可以部分阻断MCP-1诱导的肾小管上皮细胞α-SMA蛋白表达水平,与阳性对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);而SB203580及Y27632均不能阻断MCP-1诱导的α-SMA蛋白表达,与阳性对照组比较差异无统计学意义(均P＞0.05).MCP-1(10、100 μg/L)刺激下Snail基因表达水平明显升高,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 MCP-1诱导体外培养的HK-2细胞发生EMT与上调Erk1/2信号转导通路有关,并可能与上调Snail转录因子水平有关,本研究未能证实该机制与P38MAPK信号通路及Rho信号转导通路有关.     

促肝细胞生长素部分逆转巨噬细胞趋化因子和马兜铃酸Ⅰ诱导的人肾小管上皮细胞转分化

目的观察促肝细胞生长素(hepatocyte growth-promoting factor,pHGF)对巨噬细胞趋化因子(monocyte chemo-tatic protein-1,MCP-1)协同马兜铃酸Ⅰ(aristolochic acidⅠ,AAⅠ)诱导的人肾小管上皮细胞(HKC)凋亡及上皮细胞-间质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。方法体外培养的HKC随机分为:空白对照组、转分化模型组及不同浓度pHGF(0.15、1.5、15、150、1500ng/ml)处理组。转分化模型组采用MCP-1(0.1μg/ml)协同AAⅠ(10μg/ml)诱导HKC转分化模型;pHGF处理组采用不同浓度pHGF对转分化模型HKC进行处理;空白对照组常规培养。采用WST-8法和流式细胞术观察各组细胞增殖和凋亡情况;RT-PCR检测各组细胞α-SMA mRNA表达;免疫组化检测各组细胞α-SMA、TGF-β1、FN蛋白的表达。结果与空白对照组相比,转分化模型组、不同浓度pHGF处理组HKC细胞增殖抑制率,凋亡细胞所占比例,α-SMA mRNA表达均明显升高(P...     

上调整合素连接激酶可抑制肾小管上皮细胞E-cadherin 表达

目的 研究上调整合素连接激酶（integerin-linked kinase,ILK） 对肾小管上皮细胞（human kidney tubular cells,HKC）E- 钙黏素（E-Cadherin） 表达的影响。肾小管上皮细胞转分化（epithelial-mesenchymal transition,EMT） 在肾间质纤维化中发挥重要作用。E-Cadherin 是维持肾小管上皮细胞极性的关键蛋白。ILK 是调控上皮细胞转分化的重要蛋白,其作用机制目前还不清楚。方法 本研究中我们将ILK 转染到HKC 中过表达,然后用RT-PCR、Western blot 及免疫荧光方法观察了ILK 对E-Cadherin 表达及糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β） 活性的影响。进一步用磷酸化下游底物GSK-3β 抑制剂SB415286 观察对E-Cadherin 表达的影响。结果 ILK 过表达可以明显抑制E-Cadherin 表达, 增加GSK-3β 活性。用GSK-3β 抑制剂处理后可以下调E-Cadherin 的表达。免疫荧光显示ILK 过表达可使上皮细胞发生极性改变,E-Cadherin 表达下调。表明ILK 上调可通过激活GSK 抑制E-Cadherin 表达,进而诱导肾小管上皮细胞出现转分化表型。     

Rho在二氧化硅诱导的人支气管上皮细胞α平滑肌肌动蛋白表达中的作用（英文）

目的：探讨Rho在二氧化硅（SiO2）诱导人支气管上皮细胞（HBECs）α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达中的作用。方法：以SiO2处理的HBE细胞为研究对象,免疫细胞化学及Western印迹检测α-SMA表达;GST pull down分析Rho的活化情况;干预实验中用Rho抑制剂Y27632处理细胞后,West-ern印迹检测SiO2对α-SMA表达的影响。结果：SiO2（0,50,100,200,300μg/mL）分别作用HBECs细胞72h后,α-SMA表达增强,其中以200μg/mL SiO2组α-SMA表达最强,为对照组的（5.09±1.98）倍（P〈0.01）;用200μg/mL SiO2分别作用HBECs细胞1,2,6,12,24h后,Rho明显活化（P〈0.01）;Rho抑制剂Y27632明显抑制了SiO2诱导的α-SMA表达,20和30μmol/L的Y27632抑制率分别为68%和75%（P〈0.01）。结论：Rho参与介导SiO2诱导的HBECs中α-SMA的表达。     

TGF-β1/ILK/FSP1信号通路在环孢素诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的通过体外特异阻断试验,探讨转化生长因子-β1/整合素连接激酶/成纤维细胞特异蛋白1（TGF-β1/ILK/FSP1）信号通 路在环孢素A致肾小管上皮细胞转分化中的作用。方法构建并鉴定ILK-RNAi慢病毒表达载体ILKshRNA。将NRK52E细 胞培养分为5组,分别为空白对照组;环孢素诱导组：细胞培养液加环孢素A1 mg/L;TGF-β1干预组：阻断剂（SB431542）10 μmol/L 加环孢素A1 mg/L;ILK干预组：阳性转染ILKshRNA后加入环孢素A1 mg/L;阴性对照组：阴性转染ILKshRNA后加入环孢素 A1 mg/L。实时荧光定量PCR检测TGF-β1、ILK和FSP-1 mRNA的表达,Western blot检测TGF-β1、ILK、FSP-1的蛋白表达。免 疫组化检测细胞爬片α-SMA阳性表达细胞数。结果与空白对照组比较,环孢素诱导组细胞TGF-β1、ILK、FSP-1基因及蛋白表 达量均显著增加（P<0.05）;TGF-β1 干预组经SB431542 处理后,TGF-β1、ILK 和FSP1 水平较环孢素诱导组降低（P<0.05）;经 ILKshRNA沉默后,ILK和FSP1水平较环孢素诱导组降低（P<0.05）。α-SMA阳性细胞数经SB431542和ILKshRNA处理后较 环孢素诱导组降低（P<0.05）。结论TGF-β1/ILK/FSP1信号通路激活是环孢素A诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化的重要机制 之一,ILK参与环孢素A诱导大鼠肾小管上皮细胞间充质转分化过程。     

晚期糖基化终产物对大鼠血管平滑肌细胞分泌炎症性趋化因子的影响及机制

目的 观察晚期糖基化终产物(AGE)对血管平滑肌细胞(VSMC)分泌单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和白细胞介素8(IL-8)的影响并初步探讨可能的细胞内信号转导机制.方法 分离、培养原代大鼠VSMC并进行鉴定.采用糖基化血清白蛋白(GSA)模拟AGE,观察不同浓度GSA(10、100和500 μg/ml)对VSMC分泌MCP-1和IL-8的影响和时间曲线;并对其进行细胞增殖率校正以消除VSMC数量增加对测定的影响;p38MAPK抑制剂(SB203580)、ERK1/2抑制剂(PD98059)及NF-κB抑制剂(PDTC)、Proteasome抑制剂(MG132)预处理后观察GSA刺激VSMC分泌MCP-1和IL-8水平的改变.结果 与空白对照组相比,100 μg/ml GSA作用24 h VSMC分泌MCP-1(13.01ng/ml±0.12ng/ml比7.02 ng/ml±0.26 ng/ml,P＜0.05)和IL-8(12.6ng/ml±0.86 ng/ml比3.07 ng/ml±0.35ng/ml,P＜0.05)水平最高.经过细胞增殖校正后,GSA仍然能够促进VSMC表达MCP-1和IL-8.MAPK抑制剂和NF-κB抑制剂预处理后发现PDTC(10 μmol/L)、SB203580(5 μmol/L)以及MG132(10 μmol/L)可以抑制GSA刺激VSMC表达MCP-1和IL-8.结论 GSA可以促进VSMC分泌致炎性趋化因子MCP-1和IL-8,这种作用独立于细胞增殖,可能是通过激活细胞内p38MAPK信号转导通路,促进核因子NF-κB的活化而实现.

Abstract：

Objective To investigate the effects of advanced glycation end products (AGEs) on the secretion of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and interleukin-8 (IL-8) in vascular smooth muscle cells (VSMCs) and explore its possible intracellular signaling mechanism. Methods Primary rat VSMCs were isolated and identified. VSMCs were treated with glycation serum albumin (GSA), an important component of AGEs, in series of concentrations and time. The role of MAPK and NF-κB inhibitors was confirmed. The levels of MCP-1 and IL-8 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results VSMCs were treated with GSA at the doses of 10 μg/ml, 100 μg/ml and 500 μg/ml respectively. In comparison with the control group, the levels of MCP-1 ( 13.01 ng/ml ± 0.12 ng/ml vs 7. 02 ng/ml ±0. 26 ng/ml, P＜0.05) and IL-8 (12. 6 ng/ml ±0. 86 ng/ml vs 3. 07 ng/ml ±0.35 ng/ml,P＜0.05) increased in the GSA-treated group, especially at the concentration of 100 μg/ml. After adjustment for cells proliferation, the levels of MCP-1 and IL-8 were still higher in the GSA-treated group.After a pretreatment of PDTC ( 10 μmol/L), SB203580 (5 μmol/L) and MG132 ( 10 μmol/L), the levels of MCP-1 and IL-8 decreased. However, it had no change when pretreated with PD98059 (20 μmol/L).Conclusion GSA promotes the secretion of MCP-1 and IL-8 in VSMCs. Such an effect is not dependent on cellular proliferation. It may be realized through an activation of NF-κB by p38MAPK-sensitive intracellular signaling pathway.     

p38MAPK信号通路对矽肺患者人胚肺成纤维细胞中TGF-β1表达的影响

目的探讨p38MAPK信号通路是否通过对SiO2活化的矽肺患者AM介导的人胚肺成纤维细胞（HELF）中TGF-β1表达的调控作用,进而参与肺纤维化的发生发展。方法以支气管肺泡灌洗法收集矽肺患者AM,在体外用含有SiO2（50μg/ml）的DMEM培养基和不含SiO2的DMEM培养基培养18h,然后收集培养的AM上清液。用组织贴块法获取培养HELF,与AM上清液共同孵育,用免疫细胞化学法检测HELF中TGF-β1的表达,Western blot法检测HELF中p-p38MAPK蛋白表达。结果经SiO2刺激的矽肺患者AM介导的HELF中TGF-β1和p-p38MAPK的表达与其他组相比增加,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论在本实验条件下,经SiO2刺激的矽肺患者AM培养上清可促进HELF表达TGF-β1和p-p38MAPK,10μmol/LSB203580可以抑制HELF表达TGF-β1和p-p38MAPK。