卵细胞胞浆内单精子注射对胚胎冻融结果的影响

目的比较卵细胞胞浆内单精子注射(ICSI)和常规试管内授精(IVF)两种受精方式对胚胎冻融结果的影响。方法51对夫妇59个冻胚移植周期(ICSI组27周期,IVF组32周期),比较冻胚复苏后胚胎的存活率和临床妊娠率。结果59个冻胚移植周期,解冻胚胎235个,存活199个,存活率84.7%,临床妊娠率37.3%。其中IVF组32个周期,解冻胚胎132个,存活112个,存活率84.8%,临床妊娠率37.5%;ICSI组27个周期,解冻胚胎103个,存活87个,存活率84.4%,临床妊娠率37.0%。两组比较结果P>0.05,两组无显著差异。结论IVF组与ICSI组冻融胚胎存活率、妊娠率差异无显著性。结果表明ICSI技术是治疗男性因素引起不孕症的安全有效的方法。     

实施ICSI后对复苏胚胎的妊娠结局

目的 讨论卵泡浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection ICSI)与常规体外受精(in vitro fetrilizationⅣF)受精方式对冷冻胚胎的解冻和移植后对临床妊娠的影响.方法 慢速冷冻IVF或ICSI周期中剩余的优质胚胎,随后用快速融解法复苏后进行移植.观察各组胚胎冷冻解冻后的胚胎存活率及相关指标和临床妊娠率.结果 50例患者中,IVF组为30个周期,妊娠4例,妊娠率为13.33%,ICSI组为20个周期,妊娠5例,妊娠率为25%,ICSI组冷冻胚胎优胚率、复苏后胚胎存活率、存活胚胎累积细胞数与复苏胚胎的累积细胞数百分比(累积细胞存活率)和存活胚胎累积评分与复苏细胞累积评分的百分比(累积评分率)有显著差异.结论 冷冻胚胎的优胚率及复苏后获得高质量的胚胎是影响解冻胚胎移植的临床妊娠率重要因素.     

实施ICSI后对复苏胚胎的妊娠结局

目的 讨论卵泡浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection ICSI)与常规体外受精(in vitro fetrilizationⅣF)受精方式对冷冻胚胎的解冻和移植后对临床妊娠的影响.方法 慢速冷冻IVF或ICSI周期中剩余的优质胚胎,随后用快速融解法复苏后进行移植.观察各组胚胎冷冻解冻后的胚胎存活率及相关指标和临床妊娠率.结果 50例患者中,IVF组为30个周期,妊娠4例,妊娠率为13.33%,ICSI组为20个周期,妊娠5例,妊娠率为25%,ICSI组冷冻胚胎优胚率、复苏后胚胎存活率、存活胚胎累积细胞数与复苏胚胎的累积细胞数百分比(累积细胞存活率)和存活胚胎累积评分与复苏细胞累积评分的百分比(累积评分率)有显著差异.结论 冷冻胚胎的优胚率及复苏后获得高质量的胚胎是影响解冻胚胎移植的临床妊娠率重要因素.     

体外受精周期中注射hCG日雌激素水平对妊娠结局的影响

目的探讨体外受精周期中注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)日雌激素高水平对新鲜周期和随后的冻融周期妊娠结局的影响。方法收集采用长方案进行体外受精(IVF)/卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)的患者移植周期资料,根据注射hCG日血清雌二醇(E2)的质量浓度分为两组:A组(E2质量浓度≥5 000 pg/mL,n=154)和B组(E2质量浓度<5 000 pg/mL,n=294);其中A组患者根据首次移植时间又分为两个亚组:A1组(鲜胚移植组,n=78)和A2组(冻胚移植组,n=76)。比较各组周期特征和妊娠结局。结果 A、B两组受精率、卵裂率比较,差异无统计学意义(P>0.05);两组临床妊娠率和胚胎种植率的差异无统计学意义(P>0.05);A组的中重度卵巢过度刺激综合征(OHSS)的发生率(4.55%)显著高于B组(1.36%)(P<0.05)。A2组首次胚胎冻融移植周期的临床妊娠率(48.68%)和胚胎种植率(29.14%)显著高于A1组和B组(P<0.05)。结论 E2水平升高是卵巢高反应的表现,与IVF结局没有明显关系,但患者发生OHSS的风险随之升高;对E2高水平的患者采用全胚胎冻存的方法能够获得满意的妊...     

实验兔胞内单精子注射技术

目的 建立实验兔胞内单精子注射技术(intracytoplasmic sperm injection,ICSI).方法 实验1比较了hCG注射后不同取卵时间对ICSI胚体外发育的影响.实验 2 比较了不同的激活方式对ICSI胚体外发育的影响.实验 3 比较了不同状态的兔精子ICSI胚胎体外发育结果.结果 (1)hCG注射后14 h取卵,其卵裂率、桑椹胚率和囊胚率(82.2%、72.9%和62.2%)都比16 h(75.9%、70.0%和53.3%)的高,但是差异无显著性(P>0.05);18 h取的卵注射后不能卵裂.(2)机械刺激组和离子霉素 6-DMAP组,ICSI后其卵裂率分别为82.2%和81.1%(P>0.05),桑椹胚率分别为72.9%和66.2%(P>0.05),囊胚率分别为51.3%和62.3%(P<0.05),机械刺激组和离子霉素组之间卵裂率和桑椹胚率差异无显著性,但是囊胚率差异有显著性.(3)新鲜精子组和冻融活精子组卵裂率(81.1%和68.8%)和囊胚率(62.3%和40.4%)差异有显著性(P<0.05),而桑椹胚率(66.2%和61.9%)差异无显著性(P>0.05).结论 精子冷冻前后,通过ICSI所得的桑椹胚均能孵化,表明已初步建立了实验兔的ICSI技术.     

不同品系小鼠的体外受精、胚胎冷冻及移植的比较研究

目的　探讨不同品系小鼠的体外受精、胚胎和精子的低温保存效果。方法　本实验分别在中国科学院上海实验动物中心 (SLAC)和日本熊本大学动物资源开发中心 (CARD)对 13个品系小鼠 (C57BL 6J、BALB c、C3H HeJ、ICR、KM、FVB、MRL、NOD、CBA、DBA 2、CD 1、BDF1、B6C3F1)的体外受精 (IVF)率、胚胎培养及移植成绩进行了比较研究。结果　各品系小鼠新鲜精子的IVF率 15 1%～ 87 9% ,冻融精子的IVF率 8%～ 80 % ;冷冻胚胎的复苏率4 2 6 %～ 83 9% ;冻融胚胎移植后的产仔率在 17 8%～ 5 1 8%。结论　遗传背景不同的小鼠体外受精率、冷冻胚胎复苏率和胚胎移植的产仔率差异有显著性。但同一品系两个实验室间的新鲜精子的IVF率、冷冻胚胎的复苏率及移植产仔率差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;冻融精子的体外受精率CARD明显高于SLAC(P <0 0 1)。     

通过双原核显微注射提高转基因小鼠研制效率的实验研究

目的建立高效的转基因小鼠制备技术,为开展遗传工程动物模型研究奠定技术基础。方法通过向小鼠受精卵原核中注入不同浓度的DNA分子,筛选最适注射用DNA浓度;将K14/hCTLA4-Ig基因表达载体分子通过显微注射分别导入小鼠受精卵雌、雄原核,并设立单原核注射对照组;利用输卵管腹壶部穿刺移植法将注射后的小鼠受精卵移植于同期发情的受体母鼠;利用PCR对出生的转基因首建小鼠进行筛选。结果最适DNA分子浓度为10ng/μl;在单、双原核注射组胚胎2细胞卵裂率分别为52.3%(132/253)和45.0%(108/240),差异有显著性(P<0.05);注射胚胎移植后体内存活率分别为18.1%(24/132)和16.7%(18/108),差异无显著性;转基因首建小鼠阳性率分别为3/24和5/18,转基因阳性小鼠占总注射胚胎的比例为1.2%(3/253)和2.08%(5/240),差异有极显著性(P<0.01)。结论尽管双原核注射对胚胎的2细胞卵裂率有一定影响,但通过双原核注射可有效提高转基因小鼠的制备效率。     

早期胚胎原核形态与优胚的关系及原核评分对胚胎选择的临床意义

目的 分析早期胚胎不同原核形态与优胚的关系,评价原核评分对胚胎选择的临床意义.方法 对2009年10-12月在本中心接受体外受精(in vitro fertilization,.IVF)和卵胞浆内单精子显微注射-胚胎移植(intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer,ICSI-ET)治疗的263个周期所获的2 303枚胚胎进行回顾性分析,依据原核Z评分法把第1天胚胎分为4级(Z1、Z2、Z3、Z4),统计取卵后第3天各级的优胚数,分析各级之间优胚率的差异.结果 Z1、Z2、Z3、Z4各级优胚率依次为78.27%(490/626)、75.95%(420/553)、22.61%(135/597)、17.84%(94/527),其中Z1、Z2级的优胚率显著高于Z3、Z4级(P<0.01),但Z1、Z2级间以及Z3、Z4级间优胚率差异均无统计学意义(P>0.05).结论 早期胚胎不同形态原核与优胚密切相关,原核评分是早期胚胎选择的重要参考指标.     

两种玻璃化装载工具对人卵母细胞冻融效果的比较

目的 比较自制的Cryotop装载管与商用的Cryotop装载管对人卵母细胞玻璃化冻融效果.方法 冷冻时采用自制的Cryotop装载者为A组,采用商用的Cryotop装载者为B组.比较采用两种装载工具冻融体外受精胚胎移植(IVF-ET)中48 h后受精失败MⅡ(metaphase Ⅱ )卵子(A1、B1组)、获卵日MⅡ卵母细胞(A2 、B2组)及单精子显微注射(ICSI)患者的GV(germinal vesicle)卵子(A3、B3组).结果 冻融受精失败MⅡ卵母细胞部分: A1、B1组的回收率和存活率分别为93.9%、96.8%、82.9%和86.2%,相互比较差异无统计学意义(P>0.05);新鲜MⅡ卵母细胞部分: A2组的回收率、存活率、受精率、卵裂率和优胚率分别为100%、100%、80%、100%和25%; B2组的回收率、存活率、受精率、卵裂率和优胚率分别为100%、100%、60%、100%和33.3%;A2、B2组比较差异无统计学意义;GV期卵子, A3与B3组的回收率、存活率、GVBD率和MⅡ率分别为:100%与90%,81.3%与77.8%,92.3%与85.7%,83.3%与66.7%,与对照组比较差异均无统计学意义.结论 自制Cryotop装载管具有价格低廉的优点且并没有降低冻融效果,可以作为临床运用,特别是科研使用的一种玻璃化冷冻的装载工具.     

授精第三天4细胞及5细胞期胚胎的冷冻价值

目的 分析授精第3天为4细胞及5细胞期胚胎冻融及移植后对临床结局的影响,探讨其冷冻价值。方法 收集270个冻融胚胎移植（FET）周期,授精第3天胚胎采用程序化冷冻法冻存,快速解冻法复苏后移植,根据冷冻日胚胎所含细胞数比较各细胞数胚胎复苏存活率,并分为4、5细胞组与≥6细胞组,比较两组间的临床妊娠率、种植率及因胚胎因素取消周期率（简称周期取消率）。结果 （1）270个周期共解冻胚胎939枚,复苏存活率为65.3% (613/939);移植胚胎561枚,临床妊娠率27.2%(67/246),种植率15.2%（85/561）;（2）4、5细胞组周期取消率显著高于≥6细胞组（P＜0.01）,且移植胚胎数显著低于≥6细胞组（P＜0.05）,但胚胎复苏成功并移植后两组妊娠率、种植率及活产率均无显著性差异（P＞0.05）。结论 冻存4、5细胞期胚胎与≥6细胞期胚胎妊娠率无统计学差异,提示具有冷冻价值。     

小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育

[目的]观察小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育.[方法]昆明小鼠超排后获取体内成熟卵母细胞及卵丘细胞.成熟卵子去核后用将卵丘细胞核与精子直接注入,观察其受精和胚胎发育情况.[结果]卵子去核存活率为75.9%(362/477),注核存活率为39.8%(143/359),D1存活率为38.4%(138/359).39.9%(57/143)重构卵子成功排出一个极体并形成两原核,其卵裂率为80.7%(46/57).大部分重构胚发育到2～3细胞停滞,其中2个分裂至4细胞,无囊胚形成.[结论]将小鼠卵丘细胞核、精子同时移植到小鼠的体内成熟卵浆中,可以诱导极体排出,形成2原核 1极体的重构胚胎.重构胚胎大部分发育到2～3细胞即发生停滞,最多到达4细胞期,发育潜能差.     

利用CRISPR/Cas9敲除大鼠胰岛素受体底物1（Irs1）基因

目的为研究胰岛素受体底物1(Irs1)基因与代谢病之间的关系,我们利用CRISPR/Cas9系统敲除大鼠Irs1基因,为研究代谢病提供基因敲除大鼠。方法针对Irs1第一外显子,设计CRISPR/Cas9作用靶点,构建sgRNA表达质粒。利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9。将Cas9 mRNA和sgRNA混合物注射入SD大鼠的受精卵中,实现靶基因敲除。用T7EN1实验初步检测靶基因的修饰情况,再经过测序分析确定突变。结果获得了5个在Irs1基因突变的首建鼠,突变效率为83%。结论得到了稳定遗传的Irs1基因敲除大鼠。     

蛋白激酶Pkmyt1对小鼠1-细胞期受精卵发育的抑制作用

目的: 通过在小鼠1-细胞期受精卵内过表达Pkmyt1-wild type(WT) (野生型) mRNAs,研究蛋白激酶Pkmyt1对小鼠受精卵早期发育的影响,为进一步阐明Pkmyt1对哺乳动物受精卵早期发育调控的机制奠定基础。方法: 构建pcDNA3.1/myc- Pkmyt1-WT质粒。超排卵方法获得小鼠1-细胞期受精卵,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组和Pkmyt1-WT mRNAs注射组,收集各组卵细胞后采用Western blotting法检测Pkmyt1蛋白表达和Cdc2-pTyr15磷酸化状态;相差显微镜观察受精卵的形态变化并计数卵裂率。结果: pcDNA3.1/myc-Pkmyt1-WT质粒构建成功。与未注射组(0.414±0.016)和TE缓冲液注射组(0.441±0.013)比较,受精卵显微注射Pkmyt1-WT mRNAs 4 h后,Pkmyt1蛋白表达水平(1.112±0.025)增高(P<0.01)。与未注射组(60.81%±3.27%)和TE缓冲液注射组(61.79%±4.08%)比较,Pkmyt1-WT-mRNA注射组卵裂率(34.2%±3.25%)显著降低 (P<0.01)。Pkmyt1-WTmRNA注射组在注射hCG后29.0 h检测到微弱的磷酸化信号,29.5 h检测不到任何磷酸化信号。结论: Pkmyt1过表达后磷酸化Cdc2-pTyr15可抑制小鼠1-细胞期受精卵的卵裂率,提示Pkmyt1负调控小鼠受精卵有丝分裂的进程。     

利用超数排卵技术进行优化C57BL/6J小鼠生物净化体系的研究

目的以近交系C57BL/6J小鼠为实验对象,通过注射不同剂量的孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促进腺激素(hCG)对小鼠进行超数排卵、体外授精和胚胎移植,确定最佳超排剂量,从而完善以C57BL/6J小鼠为背景的转基因小鼠的生物净化体系。方法将5周龄的C57BL/6J雌鼠进行5 IU、10 IU、7.5 IU、15 IU四个剂量组的超数排卵,通过超数排卵与剖宫取胎、胚胎移植两种净化方法相结合,确定C57BL/6J小鼠的净化方法所需的最佳剂量。结果剖宫取胎方法中,注射5 IU剂量组的C57BL/6J小鼠超排后合笼见栓率最高,为(89.00±19.05)%,产仔数和见栓率与其它三组均差异不显著;胚胎移植方法中,10 IU剂量组平均卵母细胞数为30.33±0.89枚,平均体内2-细胞胚胎数为23.78±0.19枚,均显著高于其它三组。结论剖宫取胎法生物净化时,5 IU剂量组可以提高C57BL/6J小鼠的交配成功率;胚胎移植法生物净化时,10 IU剂量组可以获得最多的体内和体外2-细胞胚胎,为C57BL/6J小鼠最佳超排剂量。     

昆明小鼠体外受精胚冷冻保存的研究

在PBS 20?S 0.5mol/L蔗糖中加2.0和3.0mol/L甘油组的胚胎发育率分别为51.4%和44.4%,冷冻效果明显好于其它浓度甘油;在PBS 20?S十2.0mol/L甘油中,加0.5mol/L蔗糖组的胚胎发育率为47.7%,冷冻效果好于其它浓度蔗糖;慢速降温冷冻组的胚胎发育率为48.8%,效果明显好于快速冷冻法;在各期胚胎冷冻后的发育率中,2细胞胚最低,桑椹胚的存活率明显高于4细胞胚和早期囊胚;冷冻保存后体外受精胚的发育率显著低于体内受精胚:112枚经冷冻保存的体外受精胚移植给受体鼠,2/9妊娠。     

长爪沙鼠体外受精与早期胚胎体外培养体系的初步建立

目的 探讨自配的获能液和受精液用于长爪沙鼠体外受精的可行性,为长爪沙鼠的胚胎保种提供参考。方法 用自配的获能液和受精液对长爪沙鼠进行体外受精,并用改良后的KSOM培养液对长爪沙鼠的2细胞胚胎进行体外培养试验。结果 长爪沙鼠体外受精率在60%以上,沙鼠2细胞胚胎能够在体外进一步发育。结论 初步建立了长爪沙鼠体外受精和胚胎发育体系,但需要进一步优化。     

利用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠的研究

目的 应用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法 针对miRNA-29b1基因设计一段sgRNA,sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型,同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miRNA-29b1在这些脏器中的表达。结果 设计了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录,显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA-29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型,一种为10 bp的缺失突变;另一种为22 bp的缺失突变,同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比,基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA-29b1表达量下降明显。结论 应用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠

目的 应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法 根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25 bp左右的sgRNA并进行合成, sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞技术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果 成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10 bp和11 bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8 bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论 利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。     

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的 建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系，并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法 通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列，并构建Cas9-MAD2L1载体，将该载体转染到NIH/3T3细胞中，通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后，提取细胞转染后的基因组DNA，利用PCR方法，结合T7E1分析和桑格尔测序，鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况，并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果 将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后，荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞，PCR结合T7E1结果显示，以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物，可被酶切成166 bp和62 bp片段，测序结果显示，成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑，脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论 成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系，设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。     

应用TALEN技术敲除gata4基因建立斑马鱼先天性心脏病模型

目的人工构建TALEN靶向敲除载体敲除gata4基因,建立斑马鱼先天性心脏病动物模型。方法采用单元组装法构建靶向敲除gata4基因的载体,将其体外转录成TALEN mRNAs,通过显微注射的方式注入单细胞期受精卵中,胚胎检测TALEN的敲除效率,再通过剪尾、酶切、测序筛选发生基因突变的斑马鱼及突变的类型。结果酶切、测序结果证实成功构建出正确的gata4靶向敲除载体,注入斑马鱼受精卵中,发生基因敲除的效率为35.18%,通过剪尾、PCR、酶切检测成功地筛选出了发生基因突变的斑马鱼,测序结果显示出不同种类的gata4基因突变。结论成功构建gata4基因敲除的斑马鱼动物模型,为进一步研究人类gata4基因突变引起先天性心脏病的发病机制提供了良好的动物模型。