抗体药物研究进展及临床应用

抗体作为药物用于治疗疾病已有很长历史,随着抗体立体结构的阐明和分子生物学技术的发展,抗体从最初的鼠单抗发展到鼠单抗人源化改造、基因工程抗体,人源化抗体。同时人们利用分子生物学技术改良抗体性能,使之有效到达靶部位,提高抗体效应功能。因此,抗体药物具有广阔应用前景,将在人类疾病治疗中发挥重要作用。     

治疗性单克隆抗体研究进展及临床应用现状

19世纪末,动物来源的抗血清用于肺炎、白喉、麻疹等传染病的早期治疗,显示了一定效果,但毒副作用大,特别是异源蛋白易产生过敏反应.1975年杂交瘤技术问世,开创了抗体技术的新时代.单克隆抗体(以下称单抗)高度的特异性和均一性使其在实验研究和临床检测中得到了广泛应用.自1982年单抗首次应用于人体治疗以来,应用单抗治疗肿瘤、自身免疫疾病,组织器官移植排斥反应等疾病的报道渐多,同时鼠单抗用于人体的毒副作用也越来越明显,使单抗在人体治疗中的应用受到很大限制.随着分子生物学技术的发展,尤其是抗体库技术、鼠抗体人源化改造技术以及近年利用转基因技术研制完全人抗体的突破,为单抗进入临床治疗提供了良好的应用前景.本文就单克隆抗体人源化改造、抗体库技术、转基因小鼠技术研究进展及目前单抗在临床治疗中的应用现状予以综述.     

利用噬菌体展示技术筛选人源抗肝癌单链抗体

目的:利用噬菌体展示技术,从Griffinl Library人源噬菌体单链抗体库中筛选出人源抗肝癌单链抗体.方法:扩增Griffinl Library人源噬菌体单链抗体库后,以甲胎蛋白(AFP)为包被抗原,用免疫试管法富集筛选人源抗肝癌单链抗体,用ELISA法鉴定获得的阳性克隆,对其基因进行测序.将淘选出的阳性单链抗体...     

从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白scFv

目的从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白单链抗体(scFv),测定其特异性结合活性并进行基因序列分析。方法以混合分子量人表皮角蛋白包被固相,对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,经4轮“吸附洗脱扩增”后,挑取单克隆,用ELISA法测定特异性结合活性,并对阳性克隆抗体基因进行DNA指纹分析及序列同源性分析。结果经4轮筛选,获得9株可表达抗人角蛋白单链抗体的克隆,酶切鉴定正确后,经DNA指纹分析及序列同源性分析证明为不同的抗体基因。结论利用噬菌体抗体库技术获得了人源性抗角蛋白单链抗体,为临床应用研究提供了具有更广阔应用前景的人源小分子抗体。     

人源抗狂犬病毒免疫型抗体库的构建及特异性抗体筛选与鉴定

目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。     

抗体工程与病理学

结合抗肝癌基因工程抗体的制备，概述了抗体工程的工作内容及其与病理学的关系，抗体工程的主要目的之一是制备人的或接近人的，而能在病人体内应用的抗体，一方面它可以来源于单克隆抗体的改造，首先克隆出鼠抗体可变区的轻链及重链成为小抗体或重组成单链抗体及人鼠嵌合抗体等基因工程抗体。另一方面，也可以用免疫过的小鼠脾细胞或者人的淋巴细胞建立鼠、人抗体库，然后抗原从抗体库中筛选出鼠或人的各种类型抗体。鉴于抗体对靶细胞一般只起导向作用，要携带效应分子才发挥杀伤肿瘤细胞的作用或其它作用。常用的“弹头”有毒素及细胞因子等。所以必须将这种基因与抗体基因融合在一起才能表达有作用的融合蛋白。抗体工程还包括抗体的增效或抗体的成熟，以及对照人抗体的结构进行置换，使抗体人源化等。     

人源化Fab段噬菌体抗体库的构建

目的构建人源化Fab噬菌体抗体基因库。方法利用反转录PCR和PCR技术从B细胞淋巴瘤患者外周血淋巴细胞中扩增人IgG抗体重链Fd基因及κ、λ轻链基因,将之克隆入噬菌体载体pComb3,构建人源性Fab噬菌体抗体库,并进行鉴定。结果构建完成了库容量为6.0×108的噬菌体抗体库。结论成功地构建了人源化噬菌体抗体库,为下一步抗CD20抗体的筛选和表达奠定了基础。     

卵巢癌人源性核糖体展示抗体库的构建

目的构建库容量大、多样性好的卵巢癌人源性核糖体展示抗体库。方法从10名卵巢癌患者的外周血淋巴细胞中提取总RNA,通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增人全套重链可变区基因（variable region of heavychain,V_H）和轻链可变区基因（variable region of light chain,V_L）,用重叠PCR技术对它们进行拼接,构建卵巢癌人源单链抗体库,并连接T载体转化大肠杆菌,经蓝白筛选,挑选阳性克隆,测序鉴定。结果成功构建卵巢癌人源单链抗体库,库容6.5×10~（13）,经测序验证多样性良好。结论成功构建的卵巢癌人源单链抗体库可用于进一步筛选目标抗原,为开发治疗性人源抗体奠定了实验基础。     

从大容量人源噬菌体抗体库中筛选抗黑素瘤特异性抗体

目的：用黑素瘤（MM）细胞系筛选大容量人源噬菌体抗体库，获得能与MM细胞特异性结合的人源性单链抗体（scFv）．方法：用完整的MM细胞对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选，并通过细胞ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定，得到的阳性克隆进一步做DNA序列测定和免疫组化染色鉴定．结果：从80个随机挑选的克隆中，筛得1株抗MM细胞的抗体，该抗体对人的鳞癌细胞、角质形成细胞、黑素细胞、角蛋白、胰蛋白酶、转铁蛋白及小鼠igG等细胞或抗原的结合反应均呈阴性．免疫组化染色显示，该抗体与MM细胞系Libr的染色呈阳性，对黑素细胞和痣细胞的染色呈阴性．DNA测序结果表明，该抗体VH属于人IgG VH5亚群，VL属于人Vκ亚型．结论：通过筛选噬菌体抗体库获得到1株抗MM细胞的特异性抗体，为MM的靶向治疗研究奠定了基础．     

人源性抗地高辛单链抗体（scFv）及diabody的获取

目的：从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛单链抗体（scFv），并构建双价抗体（diabody）．方法：以固相化的Dig对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选，4轮后挑取集落，用ELISA法鉴定其特异性，并对抗Dig阳性抗体基因进行DNA指纹分析及测序分析，选取活性好的抗体基因进行改造，构建diabody．结果：在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象，获得4株可与Dig特异性结合的人源单链抗体，经DNA指纹分析及测序分析证明为不同抗体基因，