DMD基因第50号和第51号内含子的克隆和测序

用ＤＭＤｃＤＮＡ８探针从假肥大型肌营养不良（Ｄｕｃｈｅｎｎｅｍｕｓｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ＤＭＤ）基因的ＹＡＣ克隆的ｃｏｓｍｉｄ亚克隆库中筛选到９个阳性ｃｏｓｍｉｄ克隆，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定ｃｏｓｍｉｄＣ０４６１含ＤＭＤ基因的第５１号外显子，将该ｃｏｓｍｉｄ亚克隆于ｐＶＣ１１８中，获得含ＤＭＤ基因第５０和５１号内含子的３．１ｋｂ－ＨｉｎｄⅢ片段的亚克隆，将亚克隆的插入片段分别用Ｓａｕ３ＡⅡ完全和部分酶切克隆于ｐＵＣ１１８中，Ｓａｎｇｅｒ法双链测序测出质粒克隆的序列并重叠所测出的序列，确定该片段的长度为３１７９ｂｐ。与Ｓｐｅｅｒ测出的该段序列（３１５９ｂｐ）比较相差２０ｂｐ，有３３处不同。并发现有重复顺序存在，它们之间可能会发生重组并可能导致第５１号外显子的缺失。     

抗肌萎缩蛋白基因缺失热区50号和51号内含子的克隆和测序

抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因是迄今发现的人类最大基因，长约2300kb，含有75个外显子，编码14kb mRNAE。该基因的异常导致其蛋白产物抗肌萎缩蛋白异常，从而在临床上出现病情严重前假肥大型肌营养不良症(DMD)和病情缓和的Becker肌营养不良症(BMD)。60％以上的DMD／BMD是由于该基因部分外显子缺失所致，     

抗肌萎缩蛋白基因缺失热区50号和51号内含子的克隆和测序

抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因是迄今发现的人类最大基因,长约2300 kb,含有75个外显子,编码14 kb mRNA。该基因的异常导致其蛋白产物抗肌萎缩蛋白异常,从而在临床上出现病情严重的假肥大型肌营养不良症(DMD)和病情缓和的Becker肌营养不良症(BMD)。60％以上的DMD/BMD是由于该基因部分外显子缺失所致,其中位于缺失热     

DMD基因内含子的重复序列与内含子不稳定性和基因缺失的关联

【目的】为了研究DMD基因内含子的重复序列与内含子不稳定性和基因缺失的关联，我们分析了缺失型DMD病人的连接片段的断裂点并研究了DMD基因内含子结构与内含子不稳定性之间是否存在相关。【方法】多重引物PCR法鉴定缺失型DMD患者，分别克隆46和51号外显子缺失后形成的连接片段，测定连接片段的序列；并用计算机分析DMD基因可以获得的全部内含子的结构特点。【结果】对46号和51号外显子缺失后形成的连接片段的序列分析表明，5’和3’端的断裂点均位于重复顺序，断裂点附近无小插入、小缺失或点突变。对连接片段的二级结构分析表明，所有的断裂点均位于单链发夹结构的非匹配区。对DMD基因可以获得的全部内含子的结构分析表明，在DMD基因全长内含子中重复序列占大约34．8％。大量重复序列的存在是许多内含子的重要结构特征。【结论】重复序列是DMD基因多数内含子的关键结构，与内含子的不稳定性相关。在原有DNA序列的基础上，单链发夹结构的形成增加了DMD基因的不稳定性，形成了基因断裂的基础，单链发夹结构的形成导致两个断裂点的靠近，最终导致了基因缺失。     

假性肥大型肌营养不良症第50和51号内含子的结构特点及51号外…

探讨假性肥大型肌营养不良症基因第５０和５１号内含子的结构特点与第５１号外显子缺失的关系。用分子克隆技术，按Ｓａｎｇｅｒ法双链测序，克隆了含ＤＭＤ基因第５０和５１号内含子的人基因组ＤＮＡ３．１ｋｂ－ＨｉｎｇⅢ片段，测出了该片段的全部顺序，并用计算机分析了序列特点。     

DMD基因内含子的重复序列与内含子不稳定性和基因缺失的关联

[目的]为了研究DMD基因内含子的重复序列与内含子不稳定性和基因缺失的关联,我们分析了缺失型DMD病人的连接片段的断裂点并研究了DMD基因内含子结构与内含子不稳定性之间是否存在相关.[方法]多重引物PCR法鉴定缺失型DMD患者,分别克隆46和51号外显子缺失后形成的连接片段,测定连接片段的序列;并用计算机分析DMD基因可以获得的全部内含子的结构特点.[结果]对46号和51号外显子缺失后形成的连接片段的序列分析表明,5'和3'端的断裂点均位于重复顺序,断裂点附近无小插入、小缺失或点突变.对连接片段的二级结构分析表明,所有的断裂点均位于单链发夹结构的非匹配区.对DMD基因可以获得的全部内含子的结构分析表明,在DMD基因全长内含子中重复序列占大约34.8%.大量重复序列的存在是许多内含子的重要结构特征.[结论]重复序列是DMD基因多数内含子的关键结构,与内含子的不稳定性相关.在原有DNA序列的基础上,单链发夹结构的形成增加了DMD基因的不稳定性,形成了基因断裂的基础,单链发夹结构的形成导致两个断裂点的靠近,最终导致了基因缺失.     

人内皮抑素基因的克隆与测序

目的　获得人内皮抑素 (endostatin)功能区段基因片段 .方法　从人肝组织提取 m RNA,用反转录聚合酶链反应技术克隆 endostatin基因 ,2 0 g· L- 1 脂糖凝胶电泳后将其重组入 p UC19载体 ,双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列 .结果　经 Genbank分析证实 ,所获得的 5 5 2 bp基因片段属于endostatin功能区段基因 ,序列正确 .结论　本研究为应用endostatin基因进行实体瘤抗血管生成治疗奠定了基础     

Dystrophin基因3～5号外显子缺失连接片段的克隆和测序

目的 通过对抗肌萎缩蛋白（dystrophin）因3～5号外显子缺失后连接片段的克隆和测序分析,探讨dystrophin基因缺失的发生机制。方法 先以外显子PCR反应检测证实1例杜氏肌营养不良症患者3～5号外显子缺失,然后在2、5号内含子上用PCR步移方法寻找断裂位点,最后用靠近断裂位点处设计的引物,以PCR法直接扩增dystrophin基因的缺失连接片段并测序,测序结果和正常内含子序列作对比分析。结果 获得2113bp PCR产物,本例基因缺失片段长约49000bp。5’端断裂点位于2号内含子短散在元件Alu序列内,3’端断裂点在单一序列,附近有TTTAAA序列。断裂点附近有较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点。连接片段插入了26bp序列并在断裂点周围形成3个13bp的短序列重复（GGCTTATATTTAA）连接断裂点两端。结论 推测重复序列、断裂点附近较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点关联易引起基因的断裂重组,加上非同源末端连接修复机制等综合因素可能是导致基因缺失的重要原因。     

外显子组测序在抗肌萎缩蛋白基因检测到一个新的剪接供体位点突变

目的应用外显子组捕获和第2代测序技术检测抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin)中的微小突变。方法通过外显子组捕获和第2代测序技术对1例具有典型杜氏肌营养不良症(DMD)临床表现但没有外显子缺失或重复的患者进行dtstriogub基因突变检测,并用Sanger测序证实检测结果。以生物信息学预测基因突变所致该基因编码情况的改变。以患者母亲和100名体检正常者作为对照。结果在患者dystrophin基因内含子50的第1个碱基检测到1个碱基改变:G>C,其母亲在相同的位置发生了杂合改变。生物信息学预测此改变将使内含子50原有的5’剪接位点消失,导致其相应肽链C端氨基酸序列改变、终止密码提前出现。Sanger测序进一步证实了该突变的存在,且在正常对照未检测到该突变。这是在dystrophin基因上新发现的致病性剪接供体位点突变。结论外显子组测序技术可有效检测dystrophin基因微小突变,其应用可进一步完善DMD分子诊断体系。     

抗肌萎缩蛋白基因51号外显子的筛选及其两侧内含子的亚克隆

用ｃＤＭＤｓ探针，从人Ｘ染色体噬菌体文库中筛选并作ＤＮＡ印迹杂交鉴定出含有抗肌萎缩蛋白基因５１号外显子的克隆。经限制酶切图谱分析，确定ＫｐｎⅠ和ＨｉｎｄⅡ为亚克隆位点，从而获得了与抗肌萎缩蛋白基因５１号外显子相连的５０和５１号内含子亚克隆，为该区段的核苷酸顺序分析打下了基础。     

IgA肾病J链基因cDNA的克隆和测序

目的：对IgA肾病（IgA nephropathy,IgAN）的J链基因cDNA进行克隆和测序，探讨J链基因在IgAN发病机理中的作用。方法：用PLS刺激体外培养的IgAN患的外周血淋巴细胞，RT－PCR扩增J链基因cDNA，并进行克隆测序。结果：J链基因cDNA序列与正常人一样，结论：未能在IgAN的J链基因表达水平上发现异常，但不能排排除J链基因修饰化或假J链基因在IgAN的病中的作用。     

猴附睾特异性表达基因LCN6第5号内含子的克隆及分析

用PCR法扩增了猴LCN6基因第5号内含子区的基因组DNA片断，并将该片断克隆到T-载体中，用Southern Blot的方法鉴定阳性克隆。经测序后与人LCN6基因的第5号内含子相比较，两者的同源性达到了87％。根据对已有小鼠，大鼠，猴及人LCN6基因第5号内含子DNA序列比较，可知在LCN6基因的进化中由于基因组DNA序列，特别是剪切位点的改变使得原本在小鼠中转录的一个转录子mLCN6β在大鼠、猴及人中不被转录。     

鸟分枝杆菌pncB基因的克隆及测序分析

目的：研究鸟分枝杆菌烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的代谢。方法：筛选基因库和亚克隆。结果：得到了鸟分枝杆菌的编码烟酸磷酸核糖转移酶的基因pncB的全序列。结论：用筛选基因库的方法寻找新基因的方法是可行的。     

贲门癌和其癌旁组织核黄素转运基因全基因外显子测序

贲门癌显著的流行病学特征与食管癌流行地域分布一致[1-3],且贲门癌与食管癌有着相似的发病风险因素如营养缺乏、蔬菜水果的低摄入量等[4-5]。研究[6]发现C20orf54是贲门癌和食管癌的高易感基因。C20orf54位于常染色体20p13,共有5个外显子,编码的蛋白为核黄素转运蛋白[1,5],其主要功能是将核黄素由细胞外转入细胞内[7]。研究[8]证实核黄素缺乏与食管癌和贲门癌的发生密切相关,补充核黄素能够降低发病风险。作者采用外显子测序     

恶性疟原虫MESA基因的克隆和测序

目的克隆、测定恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)成熟疟原虫感染红细胞表面抗原(MESA)基因序列，并进行序列分析。方法根据恶性疟原虫palo-alto株MESA基因已知序列，设计合成四对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出4个部分序列重叠的MESA基因片段，分别克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定这4个基因片段的序列，拼接得到全长MESA基因序列。应用DNAstar、AnthProt软件辅助进行序列同源性比较和抗原表位区预测。结果PCR扩增得到特异的恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因片段，酶切及PCR鉴定获得了包含MESA基因片段的重组质粒。测序结果表明，FCC1／HN株MESA全基因编码区长4102bp，A T含量为72．11％，G C含量为27．89％，有1个内含子；编码1323个氨基酸残基，分子量为154470u。序列分析表明，FCC1／HN株与Palo-aho、D10株MESA蛋白在长度和序列组成上呈多态性，序列差异较大区域位于MESA蛋白的氨基酸重复区1、3、4、5和7。经多参数综合分析，有7个潜在的抗原表位区。结论测定、分析了恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因序列。FCC1／HN株MESA基因与其它分离株的MESA基因编码的氨基酸序列存在一定差异。     

PCR扩增法检测DMD患者的基因缺失

目的 探讨Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型肌营养不良症（ＤＭＤ）患者基因缺失的突变特点并进行基因诊断。方法 用一对特异引物进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因ｅｘｏｎ４８附近的ＤＮＡ片段。结果 在２１例ＤＭＤ患者中，检出１６例患者的ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因在该处存在缺失突变。ｅｘｏｎ４８是ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因发生缺失突变“热点”区的观点。结论 该方法可用于ＤＭＤ的遗传咨询、基因诊断及产前基     

假肥大型肌营养不良一个核心家系DMD基因分析

目的 对临床诊断的假肥大型肌营养不良1例患儿进行基因诊断,同时进行携带者筛查.方法 采用目标区序列捕获及第2代高通量测序技术对假肥大型肌营养不良患儿进行检测,同时采用Sanger测序技术对患者及其父母的基因型进行验证.结果 发现患儿DMD基因第45外显子存在1个纯合无义突变c.6589A＞T（P.Lys2197X）,患儿母亲为杂合突变携带者.结论 本研究发现了一个尚未报道的致病性基因突变位点,同时发现第2代测序技术可以快速准确检测出DMD基因的点突变,具有一定的临床应用价值,为遗传咨询提供准确信息.     

Bethlem肌病和Ullrich肌营养不良患者的COL6A1基因组缺失

在2例U llrich先天性肌营养不良和轻度Bethlem肌病患者中发现了高度相似的杂合子CO L6A1基因组缺失,位于第8内含子到第13外显子或第13内含子间区域。两例缺失患者的5'末端均位于第8内含子的1个小卫星序列内,突变导致三螺旋区域的氨基末端第66和第84氨基酸框内缺失,引起细胞内突     

人载脂蛋白CⅡ成熟肽编码基因的克隆

目的：克隆人载脂蛋白CⅡ（ApoCⅡ）成熟肽编码基因。方法：以人基因组DNA为模板，利用聚合酶链反应（PCR）分别扩增ApoCⅡ成熟肽的编码基因外显子3和外显子4，继而采用外显子拼接法。以两种扩增产物为模板再次进行PCR，得到246bp的人ApoCⅡ基因编码片段。将ApoCⅡ基因编码片段重组入载体pUC18，并进行序列测定。结果：PCR扩增得到ApoCⅡ基因编码片段．经测序证实重组人载体pUC18中的ApoCⅡ编码片段的序列与Genbank中所检索到的编码序列完全一致。结论：利用外显子拼接法完成人ApoCⅡ成熟肽基因编码片段的克隆，为基因工程研制有生物活性蛋白提供了可行的技术手段。