异种黑色素细胞疫苗诱导小鼠抗恶性黑色素瘤免疫反应的机理研究

目的　研究异种黑色素细胞疫苗诱导小鼠抗恶性黑色素瘤免疫反应的机理。方法　制备异种黑色素细胞疫苗 ,免疫小鼠。采用间接 EL ISA法检测小鼠抗肿瘤抗体滴度及抗体亚型 ,纯化免疫球蛋白及进行体外抗肿瘤增殖 ,采用 Western blot法分析交叉抗原蛋白质。接种恶性黑色素瘤 ,观察肿瘤生长 ,采用免疫细胞去除法分析NK细胞及 T细胞亚群对疫苗抑瘤效应的影响。结果　异种疫苗免疫后 2周小鼠体内出现抗自身肿瘤抗体 ,产生的抗体以 Ig G为主 ,抗体认别的猪眼黑色素细胞及恶性黑色素瘤细胞交叉抗原为相对分子质量达 180× 10 3的蛋白质 ,纯化的免疫球蛋白在体外能抑制恶性黑色素瘤细胞增殖。异种疫苗诱导特异性保护性免疫反应使 90 %小鼠恶性黑色素瘤生长受到抑制 ,去除 NK细胞不影响疫苗抑瘤效应 ,去除 CD4 + T细胞使疫苗抑瘤效应消失 ,去除CD8+ T细胞 70 %小鼠恶性黑色素瘤生长仍受到抑制。结论　异种黑色素细胞疫苗诱导特异性体液免疫及细胞免疫反应 ,抑制恶性黑色素瘤的生长 ,CD4 + T细胞在这一过程中发挥了关键性作用。     

赤芍总苷对人黑色素瘤细胞A375血管生成因子VEGF和Ang-2的影响

目的探讨赤芍总苷(TPG)对人黑色素瘤A375细胞血管内皮生长因子(VEGF)和促血管生成素-2(Ang-2)表达的影响。方法体外培养人黑色素瘤A375细胞,分别加入12.5、25、50、100、200mg/LTPG,对照组加入等量生理盐水,孵育24h、48h后,MTT方法测定生长抑制率;RT-PCR、Western blot分别测定TPG处理48h后VEGF和Ang-2 mRNA和蛋白的表达。结果 MTT结果显示TPG对黑色素瘤细胞增殖有显著抑制作用;RT-PCR、Western blot结果显示,TPG可显著抑制人黑色素瘤细胞VEGF、Ang-2 mRNA水平及蛋白水平的表达。结论 TPG具有显著的抗黑色素瘤瘤血管生成的作用,其机制可能与下调VEGF、Ang-2的表达有关。     

MHSP65-TCL抗黑色素瘤疫苗对免疫细胞活性的影响

目的研究B16黑色素瘤来源的MHSP65-TCL疫苗对黑色素瘤的治疗作用,以及该疫苗在疾病治疗过程中对免疫细胞活
性的影响。方法利用反复冻融的方法裂解B16黑色素瘤细胞制备肿瘤细胞裂解物（TCL）,将TCL同结核分支杆菌热休克蛋白
65（MHSP65）联用制备MHSP65-TCL。于不同时间点,给B16黑色素瘤荷瘤小鼠免疫MHSP65-TCL疫苗,观察该疫苗抑制黑
色素细细胞瘤的情况。与此同时,为了验证MHSP65-TCL中的TCL对免疫细胞活性的影响,我们将TCL于体外作用于小鼠脾
细胞,然后流式检测脾细胞CD69表达、脾细胞凋亡以及细胞培养上清液中IL-10和IFN-γ的表达情况。结果通过小鼠体内抑
瘤实验发现,B16黑色素瘤来源的MHSP65-TCL疫苗在小鼠体内产生了抑制黑色素细胞瘤的作用。通过体外细胞实验发现,
MHSP65-TCL中的TCL可以显著刺激体外培养的小鼠脾细胞的活化。除此之外,与这种细胞活化作用相反的,发现TCL还可
以诱导一部分体外培养的小鼠脾细胞发生凋亡,并促进脾细胞分泌IL-10,同时抑制IFN-γ的分泌。结论B16黑色素瘤来源的
MHSP65-TCL疫苗对黑色素瘤具有抑制作用。这种抑制作用主要是通过活化免疫细胞产生的。MHSP65-TCL的主要成分
TCL对免疫细胞还有抑制作用。这可能同TCL中存在的一些免疫细胞抑制物质有关。这些物质的明确以及去除将有助于提
高MHSP65-TCL疫苗的抗肿瘤效力。
     

基于小鼠黑色素瘤肺转移模型探讨丙泊酚上调DR5表达发挥抑瘤作用的研究

  目的  恶性黑色素瘤是一种恶性化程度高、易转移的由黑色素细胞恶性增殖引起的皮肤癌。本研究旨在探讨丙泊酚对小鼠B16F10黑色素瘤肺转移的抑制作用，以期为丙泊酚是否更适用于黑色素瘤相关手术麻醉提供一定的理论基础。  方法  体外细胞实验采用CCK-8方法考察不同浓度的丙泊酚对B16F10细胞增殖的抑制作用；流式细胞术检测不同实验组B16F10细胞凋亡率；Western blotting法检测各实验组DR5蛋白表达的变化。体内实验采用尾静脉注射B16F10细胞方法建立模型组，将C57BL/6J雄性小鼠24只, 采用随机数字表法分为4组, 即正常对照组, 黑色素瘤肺转移模型组, 丙泊酚50 mg/kg、10 mg/kg剂量组, 每组6只，观察腹腔注射丙泊酚对小鼠肺组织肿瘤转移结节的影响。  结果  体外实验结果显示，对照组与10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 3个浓度实验组于72 h时的细胞相对增殖能力(490 nm OD值)分别为0.91±0.03、0.81±0.02、0.71±0.02和0.61±0.02；100 μmol/L丙泊酚处理B16F10细胞在24 h、48 h和72 h三个时间点的细胞凋亡率分别为(8.09±1.01)%、(26.04±1.10)%、(32.94±1.30)%，100 μmol/L丙泊酚处理B16F10细胞72 h，DR5蛋白表达显著上调。体内实验证实，50 mg/kg剂量的丙泊酚腹腔注射可以显著抑制肺转移黑色素瘤的结节数，且免疫组化结果显示，丙泊酚组肺组织中DR5的表达显著增加。  结论  丙泊酚能够抑制小鼠肺转移黑色素瘤，其机制可能与上调DR5蛋白表达相关。      

甘草次酸通过Wnt/β-catenin通路抑制黑色素瘤恶性生物学行为的机制研究

目的 探讨甘草次酸通过Wnt/β-连环素(β-catenin)通路抑制黑色素瘤恶性生物学行为的可能机制。方法 以黑色素瘤细胞B16-F10为研究对象,MTT法进行浓度梯度试验选择0、1、2、4μmol/L为细胞处理浓度,并以顺铂0.01 mmol/L干预为阳性对照。采用Transwell小室法检测细胞侵袭及迁移能力;免疫印迹试验(Western blot)实验检测B16-F10细胞中Wnt/β-catenin通路蛋白和侵袭迁移相关蛋白基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达水平。构建裸鼠移植瘤模型,实验分为对照组(无药物处理)、甘草次酸组(40 mg/kg),观察移植瘤小鼠的肿瘤组织生长情况及肿瘤组织中Wnt/β-catenin通路蛋白和侵袭迁移相关蛋白表达水平。结果 MTT结果显示,甘草次酸以浓度依赖性方式抑制B16-F10细胞增殖,当甘草次酸浓度≥2μmol//L时,其对B16-F10细胞的增殖具有明显的抑制作用(P<0.05);Transwell小室实验结果显示,与对照组相比,甘草次酸2、4μmol/L浓度处理后,B16-F10细胞的侵袭、迁移能力明显下降(P<0...     

芹菜素对A375黑色素瘤生长、迁移和血管生成的影响及其作用机制

目的  探讨芹菜素对A375黑色素瘤增殖、迁移和血管生成的影响及其作用机制。方法  采用四唑氮化合物（MTS）法检测芹菜素对人黑色素瘤A375细胞增殖的影响;裸鼠皮下移植瘤模型考察芹菜素对体内黑色素瘤生长的影响;划痕实验检测芹菜素对细胞体外迁移的影响;小管形成实验检测芹菜素对人黑色素瘤血管生成的影响;Western blot检测芹菜素对A375细胞中调控增殖及血管生成相关蛋白表达的影响,如血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、磷酸化P38（p-P38）、总蛋白P38（t-P38）、磷酸化Erk（p-Erk）、总蛋白Erk（t-Erk）。结果  体外芹菜素处理A375细胞后,肿瘤细胞的体外增殖及体内生长较空白对照组明显受抑制;肿瘤细胞的迁移能力较溶剂对照组明显减弱;小管形成实验中,芹菜素能够抑制肿瘤细胞诱导的血管生成;分子机制研究发现,芹菜素能抑制血管生成相关蛋白VEGF及MMP-9的表达,同时芹菜素也能抑制调控肿瘤细胞增殖相关蛋白,如p-P38及p-Erk的表达。结论  芹菜素能抑制A375黑色素瘤生长、迁移及血管生成,其机制可能与抑制调控肿瘤细胞增殖及血管生成相关蛋白的表达有关。

     

蛋白4.1家族在小鼠黑色素瘤细胞中的表达及其对细胞增殖的影响

目的筛选小鼠黑色素瘤细胞中蛋白4.1家族的表达,探讨蛋白4.1对小鼠黑色素瘤细胞增殖的影响。方法以MEF、B16、 B16-F10细胞基因组RNA和总蛋白为模板,经PCR法和Western blot筛选蛋白4.1在小鼠黑色素瘤细胞中的表达;通过分子克 隆构建真核表达载体pEGFP-N1-EPB41L3 并转染黑色素瘤细胞;检测表达蛋白4.1B后B16、B16-F10 细胞增殖的变化。结果 蛋白4.1B在黑色素瘤细胞中表达缺失;通过转染成功构建的真核表达载体pEGFP-N1-EPB41L3发现,表达蛋白4.1B的黑色素 瘤细胞的增殖作用被显著性抑制。结论通过真核表达载体pEGFP-N1-EPB41L3 转染表达蛋白4.1B 可显著抑制B16 和 B16-F10黑色素瘤细胞的增殖。     

人黑色素瘤A375细胞中B7-H4表达的实验研究

目的:探讨B7-H4在人黑色素瘤A375细胞中表达及临床意义。方法:体外培养人黑色素瘤A375细胞,倒置显微镜观察细胞形态;采用RT-PCR和Western blot检测B7-H4 mRNA的转录水平及蛋白的表达水平。结果:B7-H4 mRNA和蛋白在A375细胞中表达均增高。结论:B7-H4在人黑色素瘤A375细胞中表达升高,可为黑色素瘤的诊断和治疗提供参考。     

HLA-A＊0201/K^b及MAGE-3基因共转染B16细胞的制备及其在MAGE-3肿瘤疫苗评价中的作用

目的用HLA-A2.1转基因鼠制备荷瘤模型以评价肿瘤疫苗的免疫效果，制备共表达HLA-A0201/Kb嵌合基因和MAGE-3的B16黑色素瘤细胞。方法采用基因共转染的方法，将HLA-A0201/Kb和MAGE-3转染到B16黑色素瘤细胞（B16-HLA-MAGE-3），利用RT-PCR、细胞流式和western blot的方法检测了HLA-A0201/Kb和MAGE-3在B16黑色素瘤中的表达；通过测定CTL活性和体内抑瘤实验证实肿瘤抗原MAGE-3可以在B16-HLA-MAGE-3中得到有效加工处理和递呈。结果RT-PCR、细胞流式和western blot的方法检测到HLA-A0201/Kb和MAGE-3在B16-HLA-MAGE-3黑色素瘤中的表达；LDH的方法观察到MAGE-3疫苗免疫小鼠脾细胞对B16-HLA-MAGE-3细胞的特异性CTL反应，抑瘤实验也证实，B16-HLA-MAGE-3细胞在免疫小鼠体内生长明显受到抑制。结论MAGE-3基因在B16-HLA-MAGE-3黑色素瘤细胞中得到表达，并被有效的加工处理、提呈给特异性CD8＋T细胞；B16-HLA-MAGE-3细胞可以用来制备荷瘤模型，且该方法适合利用转基因小鼠用于人表位疫苗的体内评价。     

全反式维甲酸对恶性黑素瘤A375细胞增殖及Fas蛋白表达的影响

目的 观察全反式维甲酸(ATRA)对体外培养恶性黑素瘤A375细胞增殖的抑制作用并探讨其作用机制.方法 设置溶剂对照及ATRA不同浓度组,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测ATRA不同浓度、作用不同时间各组细胞存活和生长情况,分析量效、时效关系;Western blot检测10 μmol/L ATRA作用不同时间Fas蛋白的表达.结果 ATRA在0.01～0.1 μmol/L浓度对A375细胞增殖抑制作用不明显;在1～100 μmol/L浓度有抑制作用;药物作用72 h时各浓度组的细胞抑制率均达到高峰,以100 μmol/L浓度组抑制率最高;10 μmol/L ATRA可上调A375细胞Fas蛋白的表达.结论 ATRA对A375细胞增殖的抑制作用呈时间和剂量依赖关系.ATRA可能通过Fas信号转导途径诱导A375细胞凋亡.     

NF-κB特异性抑制剂PDTC对鼠黑素瘤B16细胞增殖及VEGF表达的影响

目的:探讨核因子-κB(NF-κB)特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对鼠黑素瘤B16细胞增殖及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:不同浓度的PDTC作用于B16细胞不同时间后,MTT法测定其对B16细胞增殖的抑制率,ELISA检测PDTC作用下B16细胞VEGF的表达情况。结果:经PDTC处理的实验组,肿瘤细胞增殖活性明显受到抑制(P0.01);与对照组相比,PDTC作用后B16细胞VEGF表达降低(P0.01)。结论:PDTC具有显著抑制鼠黑素瘤B16细胞生长及VEGF表达的作用,是一种有潜力的抑制黑素瘤增殖的药物。     

三氧化二砷对小鼠B16细胞p53、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

目的 探讨三氧化二砷(As₂O₃))对小鼠B16细胞的生长抑制作用,对p53、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响,为临床治疗恶性黑素瘤提供理论和实验依据。方法 将不同剂量的As₂O₃作用于小鼠B16细胞后,吉姆萨染色和荧光染色观察B16细胞的凋亡变化;Western blot检测p53、Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果 染色后镜下可见As₂O₃可致B16细胞出现凋亡现象; As₂O₃能诱导p53、Bax蛋白的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达(P＜0.01)。结论 As₂O₃能诱导B16细胞凋亡,这一现象可能是通过诱导B16细胞的p53、Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下降来实现。     

婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC自杀基因系统对黑色素瘤的抑瘤实验

目的 观察婴儿双歧杆菌介导的胞嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶(CD／5-FC)自杀基因系统对黑色素瘤的体内、外抑瘤效果。方法 含重组CD基因的婴儿双歧杆菌中加入5-FC．厌氧条件下培养24h后取其上清液．加到黑色素瘤B16-F10细胞上．观察其对细胞形态及细胞生长抑制率的影响;建立小鼠黑色素瘤动物模型,尾静脉注入含重组CD基因的婴儿双歧杆菌,腹腔注入5-FC,观察携带重组CD基因的婴儿双歧杆菌联合5-FC对黑色素瘤肿瘤体积及肿瘤体积倍增时间的影响。结果 ①体外实验：实验组肿瘤细胞形态显示出显著的损伤性改变,细胞生长受到明显抑制．而对照组肿瘤细胞影响不大。②小鼠黑色素瘤动物模型实验结果显示,经重组婴儿双歧杆菌联合5-FC治疗21d．实验组肿瘤倍增时间明显长于对照组．其肿瘤体积明显小于对照组．且随着观察时间的延长,这种差异越显著。结论 婴儿双歧杆菌介导的CD／5-FC自杀基因系统对黑色素瘤具有明显的抑瘤效果。     

20(S)-人参皂苷Rg3抑制肿瘤生长的作用

目的：观察20(S)-人参皂苷Rg3的抗肿瘤生长的作用并探讨其机制。方法：通过B16黑色素瘤实体瘤模型、MTT法观察Rg3对B16黑色素瘤生长的作用,采用新生血 管计数实验、流式细胞术检测Rg3对肿瘤组织血管生成及细胞周期的影响。结果：实体瘤模型中,不同浓度Rg3各组瘤重明显低于对照组（P<0.01）,且Rg3组肿瘤周围的血管数也明显少于对照组（P<0.01）。体外实验中,MTT法见Rg3抑制B16黑色素细胞的生长,其IC₅₀为（7.76±0.46）mg·L^-1,并且Rg3可阻滞B16黑色素瘤细胞于G0/G1和S期,使G₂/M期细胞数明显减少。 结论：Rg3抑制B16黑色素瘤的生长,其机制可能是通过抑制肿瘤内血管生成及阻滞肿瘤细胞进入分裂期来发挥作用的。     

重组人可溶性血管内皮细胞生长抑制因子体外抗血管内皮细胞增殖的活性

目的：研究重组人可溶性血管内皮细胞生长抑制因子（VEGI）体外抗血管内皮细胞增殖的活性。方法：MTT法检测重组人可溶性VEGI对血管内皮细胞及肿瘤细胞增殖的抑制活性。结果：在体外,重组人可溶性BEGI可强烈抑制人脐静脉内皮细胞ECV304、大鼠肺源毛细血管内皮细胞（MPCEC）及新生牛主动脉内皮细胞（BAEC）的增殖,不能报制黑色素瘤细胞B－16和小鼠成纤维细胞L－929的增殖。结论：重组人可溶性VEGI能作用于不同来源的血管内皮细胞,而对肿瘤细胞增殖无抑制作用,提示其可能通过抗肿瘤新生血管生成而发挥抗肿瘤作用。     

丹参-人参配伍调控MDSCs重塑黑色素瘤免疫微环境的研究

  目的  研究丹参-人参配伍对鼠源黑色素瘤细胞株B16F10体内外免疫微环境的影响及其干预B16F10血行转移的作用机制。  方法  体外构建T淋巴细胞-B16F10共培养体系, 流式细胞术检测丹参-人参配伍体外能否增强T淋巴细胞对B16F10的杀伤能力; 构建B16F10小鼠尾静脉血行转移模型, 利用动物活体成像技术、HE染色法观察丹参-人参体内对B16F10肺转移的作用。利用流式细胞术、免疫组化及免疫荧光技术检测荷瘤小鼠体内CD4+、CD8+T细胞、骨髓源性抑制细胞(MDSCs)等免疫细胞数量, 利用qPCR技术检测MDSCs增殖的相关mRNA表达水平。  结果  丹参-人参配伍体外可增强T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤能力, 在体可有效抑制小鼠B16F10肺转移, 增强CD4+、CD8+T细胞浸润, 通过抑制MDSCs增殖的相关mRNA表达水平, 进而抑制转移灶MDSCs的表达。  结论  丹参-人参配伍可通过调控MDSCs重塑黑色素瘤免疫微环境, 达到抑制肿瘤转移的目的。研究为丹参-人参配伍的临床抗肿瘤转移应用奠定基础。      

灵芝多糖对小鼠黑素瘤细胞的体外抑制作用

目的：探讨灵芝多糖在体外对小鼠黑素瘤B16F10细胞株的抑制作用。方法：以小鼠黑素瘤B16F10细胞株为研究对象,用MTT法检测灵芝多糖对肿瘤细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞毒作用。结果：经灵芝多糖作用后黑素瘤B16F10细胞增殖活性受抑,细胞死亡增多。结论：灵芝多糖可抑制B16F10细胞的增殖,促进细胞死亡。     

过表达IL-12的恶性黑色素瘤细胞在肿瘤免疫微环境重建过程中抑制T细胞表面PD-1的表达

目的 探讨过表达IL-12的恶性黑色素瘤细胞B16对肿瘤免疫微环境重建过程中T细胞表面PD-1表达水平的影响。方法 利用慢病毒感染小鼠黑色素瘤细胞B16以构建稳定过表达IL-12的B16细胞株;利用qRT-PCR、ELISA检测IL-12的表达情况;通过平板细胞克隆形成实验验证转染病毒对B16细胞增殖能力的影响;利用ELISA检测B16/IL-12细胞在体内表达IL-12的能力;将健康的C57BL/6小鼠随机分为2组,分别接种B16细胞及B16/IL-12细胞,14 d后用流式细胞术检测肿瘤引流区淋巴结中高表达PD-1的T细胞比例;利用650cGy剂量的放射线照射C57BL/6小鼠以构建免疫重建模型,并将造模后的小鼠随机分为2组,分别接种B16细胞及B16/IL-12细胞,将未接受放疗处理的小鼠作为对照组接种B16细胞,记录各组小鼠肿瘤生长情况,接种细胞14 d后用流式细胞术分别检测肿瘤引流区淋巴结以及肿瘤组织中PD-1+T细胞比例。结果 B16/IL-12细胞相比于B16细胞显著增加IL-12的表达（P<0.001）;转染IL-12过表达慢病毒并未对B16细胞增殖能力造成显著影响（P>0.05）;接种B16/IL-12细胞的何瘤小鼠在其肿瘤组织中含有更高水平的IL-12（P<0.01）;常规荷瘤小鼠模型中,B16/IL-12组小鼠较B16组小鼠具有更低比例的CD4+PD-1+T细胞（P<0.01）,而CD8+T细胞群中,PD-1表达水平差异不显著（P>0.05）;免疫重建小鼠模型中,接种B16细胞的小鼠肿瘤引流区淋巴结和肿瘤组织中的CD4+PD-1+T细胞（P<0.05）及CD8+ PD-1+T细胞比例（P<0.01）均高于正常B16组小鼠,接种B16/IL-12细胞的免疫重建小鼠肿瘤引流区淋巴结及肿瘤组织中的CD4+PD-1+T细胞比例（P<0.01）和CD8+ PD-1+T细胞比例（P<0.001）相比于接种B16细胞的免疫重建小鼠均有显著降低;在小鼠肿瘤生长过程中,接种B16/IL-12细胞的免疫重建小鼠的肿瘤生长受到明显抑制（P<0.001）。结论 肿瘤区域过表达IL-12后可减少免疫重建过程中肿瘤区域T细胞表面PD-1 的表达,达到良好的肿瘤控制效果。     

黄芪多糖调节黑色素瘤小鼠PD-1/PD-Ls分子表达的研究

目的:研究中药黄芪提取物黄芪多糖在黑色素瘤B16-F10细胞荷瘤小鼠体内的抑瘤效应及对共刺激分子PD-1/PD-Ls通路的调节作用,阐明相关的抗肿瘤免疫调节机制。方法:对荷瘤小鼠进行黄芪多糖干预,绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率;CCK-8法检测荷瘤小鼠外周T淋巴细胞增殖活性;ELISA法检测荷瘤小鼠外周血IL-2、IFN-γ的分泌水平;Real-time PCR法检测荷瘤小鼠脾脏PD-1及肿瘤组织PD-L1、PD-L2在mRNA水平的表达;Western Blot法检测荷瘤小鼠脾脏PD-1及肿瘤组织PD-L1、PD-L2在蛋白水平的表达。结果:黄芪多糖可显著抑制B16-F10细胞在C57BL/6小鼠腋部皮下移植形成肿瘤的生长(P0.01);促进荷瘤小鼠外周T淋巴细胞的增殖(P0.01);升高荷瘤小鼠外周血IL-2、IFN-γ的分泌水平(P0.01);抑制荷瘤小鼠脾组织PD-1mRNA和蛋白的表达(P0.05,P0.01);抑制小鼠肿瘤组织中PD-L2的mRNA表达和PD-L1、PD-L2的蛋白表达水平(P0.01)。结论:黄芪多糖能抑制荷瘤小鼠皮下黑色素瘤的生长,其机制可能与黄芪多糖调节PD-1、PD-Ls分子的表达及相互作用,进而增强小鼠T淋巴细胞抗肿瘤免疫活性有关。