端粒酶逆转录酶启动子hTERT/U6嵌合启动子的siRNA表达载体的肿瘤靶向性分析

目的:体外研究siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6 1表达载体在肿瘤细胞中的靶向性.方法:常规培养稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌SMMC-7721细胞株(EGFP-7721)和稳定表达绿色荧光蛋白的人正常成纤维细胞株HELF(EGFP-HELF).以PTZU6 1质粒转染EGFP-7721细胞和EGFP-HELF细胞为空白质粒组,siRNA-EGFP-PTZU6 1质粒转染EGFP-7721细胞和EGFP-HELF细胞为实验对照组,将siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6 1质粒转染EGFP-7721细胞和EG-FP-HELF细胞作为实验组,用real-time SYBR Green PCR和Western Blot鉴定siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6 1对两种细胞株的绿色荧光蛋白表达的影响.结果:正向和反向的重组质粒siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6 1转染EGFP-HELF细胞与空白质粒比较,EGFP基因表达无差异(P>0.05),而转染稳定表达绿色荧光蛋白的7721后仅反向的siRNA-EG-FP-hTERT/U6-FIEU6 1重组质粒抑制EGFP基因的表达(P<001).siRNA-EGFP-PTZU6 1质粒与空白质粒组比较,在EGFP-7721和EGFP-HELF细胞株间,EGFP基因的表达均具有统计学差异(P<0.01).结论:反向插入的siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6 1重组质粒在肿瘤细胞具有一定靶向性,为进一步探讨基因的靶向治疗奠定了基础.     

载体介导的RNA干扰技术对甲状腺癌细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制作用

目的应用载体介导的RNA干扰(RNA i)技术特异性地抑制甲状腺癌细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达。方法构建利用U6启动子转录功能性小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,对阳性克隆进行酶切和测序鉴定后,转染人甲状腺癌FRO细胞,利用RT-PCR和W eston blot法检测hTERT基因的表达情况。结果构建的表达质粒转染FRO细胞后,hTERT基因mRNA和蛋白质的表达水平明显降低,抑制率分别为76%和81%。结论siRNA的表达质粒能成功抑制甲状腺癌细胞hTERT基因的表达,为RNA i技术应用于甲状腺癌的基因治疗提供了实验基础。     

人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子驱动的增强绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达载体，研究其调控EGFP在肿瘤细胞中的靶向表达。方法：从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上，酶切获取约1100bv的启动子片段，克隆至无启动子的EGFP质粒载体pEGFP-1的多克隆位点中，构建pEGFP-hTERTp真核表达载体。用含有巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒pEGFP—N1作为阳性对照，pEGFP-1作为阴性对照，脂质体转染法分别转染人肺癌细胞95D，NCI—H446，A2，A549，LTEP—a-2，YTMLC和人正常细胞MRC-5，荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果；双酶切和单酶切均显示载体pEGFP—hTERTp构建成功。细胞转染结果显示：在转染了pEGFP-hTERTp质粒的肺癌细胞中EGFP都有不同程度的表达，而在MRC-5中无EGFP表达；转染pEGFP-N1的肺癌细胞和正常细胞中均可清晰地观察到EGFP强荧光表达。结论：hTERT启动子能调控EGFP在肺癌细胞中靶向性转录表达。CMV启动子调控的EGFP在肺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。     

Survivin启动子调控的hTERT基因RNAi载体的构建及其肿瘤靶向干扰作用研究

目的：构建带有肿瘤特异性Survivin启动子、hTERT基因靶向的shRNA表达载体pYr-Survivinp-miR30-hTERT,探讨该载体的肿瘤靶向性及其RNAi作用效率,为RNAi技术在肿瘤基因治疗中的进一步优化进行有益的探索。方法：化学合成hTERT基因shRNA寡核苷酸序列,克隆至质粒pYr-CMV-Mir30-shRNA,构建重组质粒pYr-CMV-Mir30-hTERT;克隆Survivin启动子序列,取代该质粒原有的CMV启动子,构建重组质粒pYr-Survivinp-miR30-hTERT,同时构建阴性对照质粒pYr-CMV-Mir30-NC,以上质粒均进行酶切及测序鉴定。将以上载体分别转染人乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞及293T细胞,荧光显微镜下观察细胞转染情况,并采用半定量RT-PCR、western blot 技术检测MCF-7细胞和Hela 细胞中hTERT mRNA和蛋白的表达。结果：重组质粒经酶切及测序鉴定证实均符合设计要求,构建成功;荧光检测结果表明,CMV组在三种细胞中均有荧光蛋白的表达,而Survivin组质粒仅在MCF-7细胞和Hela细胞中表达绿色荧光,转染效率均能达到70%以上,而在293T细胞中则未见荧光;RT-PCR和Western blot的结果均显示MCF-7细胞和Hela细胞的Survivin组和CMV组中hTERT mRNA和蛋白的表达均受到明显抑制（P<0.05）,两组之间无明显差异（P>0.05）。结论：Survivin启动子调控的hTERT基因RNAi载体能有效抑制Survivin阳性肿瘤细胞中hTERT的表达,而对正常细胞不产生影响。     

肿瘤基因靶向治疗载体的构建和鉴定

目的构建并鉴定人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transeriptase,hTERT)基因核心启动子调控的EGFP基因表达载体。方法从体外培养的HepG2细胞中提取全基因组DNA,以此为模板,克隆得到hTERT基因启动子核心区基因片段(hTERTp)。设计引物以质粒pEGFP-N1为模板利用PCR扩增得到EGFP基因片段,将两者通过搭桥PCR扩增得到hTERTp-EGFP片段,经SacⅠ、XbaⅠ双酶切定向插入到pGL3-Enhancer载体中,得到重组表达载体pGL3-hTERTp-EGFP。将该表达载体瞬时转染HELF细胞和HeLa细胞后观察EGFP蛋白表达情况。结果重组质粒经测序后确认插入序列正确无误,瞬时转染48h后在HeLa细胞中可以看到EGFP蛋白的大量表达,而在HELF细胞中未见表达。结论成功构建了可以通过hTERT核心启动子调控治疗基因在肿瘤细胞中特异表达的重组表达载体pGL3-hTERTp-EGFP。     

人甲胎蛋白基因启动子驱动siRNA表达载体的构建及其在HepG2细胞中RNA效应的初步鉴定

目的：探索基于人甲胎蛋白基因启动子构建的siRNA表达载体介导目的基因RNA干扰的可行性，为实现肝癌细胞靶向RNAi治疗作一初步研究。方法：PCR法扩增获得人甲胎蛋白基因启动子并插入pSilencer1．0-U6中以置换其U6启动子；依据人hIRH-1基因RNAi靶位点设计出siRNA模板DNA,体外合成相应寡核苷酸片段后经退火形成短双链。再克隆构建成靶向人hLRH-1基因siRNA表达载体；脂质体转染法将上述重组质粒转入HepG2细胞中，实时定量RT—PCR法初步分析所建系统在AFP表达细胞中触发靶基因hIRH-1的RNAi效应，以及hIRH-1调控下游靶基因的表达改变。结果：获得人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体pSWFPo以人hLRH-1为报告基因，本研究发现所建的RNAi载体系统可在表达AFP的细胞HepG2中有效诱导靶基因表达下调，抑制率约达85％；同时引致hLRH-1调控下游靶基因CydinEl与Oct4的表达相应下调。结论：人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体可在表达AFP的细胞HepG2中有效介导靶基因的RNAi效应，为临床肝癌细胞靶向的基因特异性RNAi治疗提供了初步的实验依据。     

肿瘤细胞特异启动子hTERT介导的靶向mdr1基因的RNAi用于逆转卵巢癌细胞MDR的研究

目的:探索应用肿瘤细胞特异启动子hTERT介导靶向肿瘤多药耐药基因mdr1的siRNA在卵巢肿瘤细胞特异表达并逆转MDR的可行性。方法:应用携带luc报告基因的报告质粒验证了hTERT启动子在卵巢肿瘤细胞株A2780中的转录活性,构建由hTERT启动子引导的靶向mdr1基因的siRNA表达载体phTERTsiMDR1B,并与携带mdr1基因靶序列的报告质粒进行共转染抑制实验,进一步将phTERT-siMDR1B表达载体与mdr1基因表达载体共转染A2780细胞,检测细胞中mdr1基因的mRNA与P-gp蛋白的表达水平。以具有耐紫杉醇表型的A2780细胞作为靶细胞进行耐药评价实验。结果:hTERT启动子在卵巢肿瘤细胞株A2780中具有良好的转录活性,而在正常人二倍体细胞株MRC-5中无转录活性;hTERT启动子介导的siMDR1B具有良好的抑制效果与特异性;hTERT启动子介导的siMDR1B可显著抑制细胞中mdr1基因的mRNA与P-gp蛋白的表达水平;转染了hTERT启动子介导的siMDR1B表达元件的细胞对紫杉醇的耐药程度显著降低。结论:hTERT启动子介导的靶向mdr1基因的RNAi用于逆转卵巢癌细胞MDR是可行的,本研究结果可为进一步开展卵巢肿瘤MDR逆转研究提供重要基础。     

巨细胞病毒和猴空泡病毒40启动子在中国仓鼠卵巢细胞中驱动基因表达效率比较

目的比较巨细胞病毒(CMV)和猴空泡病毒40(SV40)2种启动子驱动外源基因在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞CHO-K1中的表达效率。方法分别构建由CMV和SV40启动子驱动表达绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pWTY-02和pWTY-03。用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将表达载体质粒分别转染CHO-K1细胞,倒置荧光显微镜观察转染后CHO-K1细胞中EGFP的表达情况;流式细胞术检测EGFP的荧光强度,以比较2种启动子驱动外源基因表达的效率。结果 2种启动子均能够驱动EGFP在CHO-K1细胞中表达。转染质粒pWTY-02的CHOK1细胞的平均荧光强度明显高于转染质粒pWTY-03的CHO-K1细胞(P<0.05)。结论 CMV启动子在CHO-K1细胞中驱动EGFP的表达效率较高,为后续CHO表达系统中提高外源基因表达效率启动子的选择提供了依据。     

RNAi-DNA表达载体的构建与应用

目的构建siRNA的DNA表达载体,为研究RNAi在哺乳动物内抑制靶基因表达奠定基础.方法合成含靶向EGFP基因的siRNA转录模板的发夹结构,将载体质粒pTZU6 1用Sal I Xba I进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,转染到肝癌SMMC-7721细胞中进行表达,检测转染前后EGFP表达的变化.结果重组质粒在大肠杆菌菌株JM109内扩增.提纯、纯化后用HindⅢ、EcoRI酶切鉴定及测序鉴定证明EGFP-siRNA转录模板完整、正确的插入到pTZU6 1质粒中,并在mRNA和蛋白水平抑制了肝癌SMMC-7721细胞中的EGFP表达.结论成功构建了siRNA的DNA表达载体,并初步应用于靶基因的抑制.