肿瘤-睾丸抗原与肿瘤免疫治疗

1肿瘤-睾丸抗原的发现VanderBruggen和TerryBoon等人发现了第一个人类肿瘤特异性抗原___MAGE-A1,在恶性黑色素瘤患者中它能诱发针对自身肿瘤细胞的特异性细胞毒T细胞(CytotoxicTLymphocyte,CTL)反应。目前已经发现了24个MAGE家族成员,它们均位于X染色体上,根据其在染色体上分布     

人肝癌细胞中一个MAGE抗原表位的获得及mRNA水平分析

0　引言　寻找和鉴定肿瘤抗原肽是肿瘤免疫研究中的重要任务 .人细胞毒性 T淋巴细胞 (CTL)可通过特异性识别与人类 HL A分子结合的肿瘤抗原决定簇而介导肿瘤抑制 ,用这些肽支撑的疫苗可以预防或治疗肿瘤 [1 ] .寻找和鉴定肝癌细胞表面表达的抗原肽对肝癌治疗有重要意义 .目前这方面报道很少 .本实验用细胞膜温和酸洗、液质联用技术分析了人肝癌细胞系 HHCC细胞膜表面表达的抗原肽 .并用 RT- PCR的方法在 m RNA水平上分析了该抗原肽编码基因的表达1　材料和方法1.1　材料　人肝癌细胞株 HHCC购于上海动物细胞所 .反相 C18柱为 Nobe…     

免疫球蛋白重链框架区的抗原九肽诱导特异性细胞毒T细胞增殖

目的 探索免疫球蛋白重链可变区(IgHV)是否存在T细胞识别的表位。方法 PCR扩增108例急性淋巴细胞白血病(ALL)的7个IgHV家族的重排基因,PCR产物直接测序并翻译成氨基酸。利用互联网生物信息资源分析B-ALL IgHV基因的重排类型和基因变异,利用SYFPEITHI和BIMAS软件预测IgHV基因编码蛋白质的T细胞表位。合成代表性九肽IgHV1家族的QLVQSGAEV,进行12结合分析、合成九肽诱导的T细胞扩增、扩增细胞的HLA-A*0201／QLVQSGAEV四聚体检测等实验,确定合成九肽的免疫原性。结果 66％的B-ALL检测到IgHV基因重排克隆。在40份测序得到的B-ALL IgHV序列中,选出26份进行HLA-A*0201分子结合九肽的预测,发现7个IgHV家族共有12条抗原九肽。除1条位于第3互补决定区(CDR3)外,10条(83％)位于框架区(FR),并与相应胚系VH家族的代表序列相同;为同一IgHV家族的白血病细胞所共有。合成的IgHV1抗原九肽可将12细胞表面HLA-A*0201分子的表达提高1．63倍。HLA-A*0201正常供者的外周血淋巴细胞接受该九肽负荷的自身PBMC的1轮刺激,CD8^ 四聚体^ 细胞达1．64％,继续接受该九肽负荷的12细胞的2轮刺激,CD8^ 四聚体^ 细胞增至82．57％。结论 B淋巴细胞的免疫球蛋白重链框架区有CTL识别的IgHv家族特异的抗原九肽,正常人外周血T细胞库存在这些抗原九肽特异的CTL,这些抗原九肽可诱导特异性CTL的增殖。     

Oncol2012: 初始T细胞来源的效应细胞在荷B16黑色素瘤小鼠免疫治疗中的应用

背景：恶性肿瘤的过继性细胞移植免疫治疗已投入临床使用多年。如何提高效应细胞的杀伤能力,如肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL),已经成为临床肿瘤免疫治疗的一个重要的努力方向。因此,我们探索了一种新的方法通过使用一定比例混合的CD4 、CD8 亚种群的初始T淋巴细胞来制备更有效的特异CTL并评价其肿瘤杀伤效率。 方法：实验使用荷B16恶性黑色素瘤的C57BL/6老鼠,并给予CTX腹腔注射进行预处理。分别评估CTX腹腔注射对肿瘤生长的影响情况及对肿瘤微环境的调节情况。应用磁珠分别阴性分选初始T细胞和总T细胞。在体外环境中检测并对比不同种T细胞的增殖能力以及细胞因子分泌水平。分别由初始T细胞（初始CD4 T：初始CD8 T=2:1）和总T细胞诱导分化得到肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞。经CTX预处理的实验小鼠给予肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞回输治疗,回输后检测效应细胞的归巢能力,检测肿瘤组织中IL-2、IFN-r、颗粒酶 B, 及穿孔素mRNA 水平,并测量肿瘤大小绘制生存曲线。 结果：CTX预处理组较对照组肿瘤生长情况无差异,但CTX预处理后较对照组可明显降低实验鼠脾脏中Treg细胞水平,以及血清中TGF-β1和IL-10 的水平（P＜0.05）。在体外初始T细胞较总T细胞表现出更强的增殖能力及细胞因子分泌能力（P＜0.05）。由初始T细胞诱导产生的效应细胞与由总T细胞诱导产生的效应细胞在归巢能力方面有显著差异（P＜0.05）,肿瘤组织中IL-2、IFN-r、颗粒酶 B 及穿孔素mRNA 水平存在显著差异（P＜0.05）。 结论：依据上述结果,我们认为由初始T细胞诱导产生的效应细胞拥有更强的增值能力、更强的归巢能力及细胞因子分泌水平,所以由初始T细胞诱导产生的效应细胞可以介导产生更强的抗肿瘤效应。     

PD-L1、CTLA-4及CD276蛋白在肝癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

目的 探讨细胞程序性死亡配体1 (PD-L1)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA-4)及CD276蛋白在肝癌组织表达及其与临床病理特征的关系。方法 收集84例经病理明确诊断的原发性肝癌患者手术切除的肿瘤组织和临床资料,免疫组织化学方法检测PD-L1、CTLA-4及CD276分子的表达情况,分析各分子表达水平与临床病理参数之间的关系。结果PD-L1高表达组肝硬化阳性例数和丙氨酸氨基转氨酶≤40 U/L例数占比均高于PDL1低表达组(均P <0.05),CD276高表达组甲胎蛋白<100μg/L例数占比低于CD276低表达组(P <0.05)。结论 PD-L1及CD276表达与肝癌发生发展密切相关,为潜在的肝细胞癌免疫治疗的实验室指标。     

MAGE基因与肿瘤免疫治疗

黑色素瘤抗原编码基因（MAGEs）在肿瘤免疫治疗的研究中起到十分重要的作用,并取得了一定的进展。本文主要针对MAGE基因的结构特点、表达特点、在肿瘤免疫治疗中的作用以及应用前景作一综述。     

乙型肝炎病毒感染者特异性细胞免疫的研究进展

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界流行趋势,是一个全球关注的健康问题,HBV作为一种非侵袭性嗜肝病毒,感染人体后并不直接损害肝脏,而是由其表达的抗原系统及其抗体所介导的特异性免疫反应和非特异性的以细胞因子为主的炎性介质导致的肝细胞损伤.特异性细胞免疫是清除机体内病毒的重要因素,针对HBV各类抗原表位的特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)作为主要的效应细胞,与病毒清除和细胞损伤有关,是当前研究的热点.本文就近年乙型肝炎病毒感染者特异性细胞免疫的研究现状作一综述.     

自然流产病人免疫治疗后外周血T淋巴细胞亚群的变化

①目的探讨自然流产病人主动免疫治疗后T淋巴细胞亚群的变化.②方法 30例自然流产妇女采用其配偶静脉血中的淋巴细胞进行免疫治疗,采用抗生物素-生物素-碱性磷酸酶标记的免疫染色方法,对30例妇女的外周血淋巴细胞亚群CD抗原进行检测.③结果经免疫治疗后,CD4+/CD8+比值明显升高(t＝2.65,P＜0.05).④结论自然流产病人免疫治疗后外周血淋巴细胞亚群CD4、CD8抗原检测,可以了解细胞免疫功能的变化,预测疗效.     

肝癌临床分期与外周血T淋巴细胞亚群的变化

应用Ｔ细胞亚群单克隆抗体检测了３６例肝癌患者外周血Ｔ淋巴细胞亚群的分布，结合日本肝癌研究会肝癌分期进行分析。正常组ＣＤ３和肝硬化组相比无明显差别，而ＣＤ４、ＣＤ４／ＣＤ８明显下降，ＣＤ８明显上升，各Ｔ细胞亚群变化与肝癌分期相关。提示日本肝癌研究会肝癌分期方案不仅能反映肿癌的发展情况，还可为临床评估患者免疫状态提供参考。     

肝癌患者围手术期外周血黑色素瘤抗原-1mRNA和甲胎蛋白mRNA检测与术后复发的关系

目的 探讨肝细胞癌患者围手术期外周血MAGE-1mRNA和甲胎蛋白(AFP)mRNA表达水平其与术后转移复发的关系。方法 通过巢式RT—PCR,在围手术期检测了45例肝细胞癌患者外周血MAGE-1mRNA和AFPmRNA,并进行平均11个月的随访。同时以22例肝炎后肝硬化、11例肝血管瘤、12例肝转移癌患者和20例健康志愿者外周血标本作为对照组进行了MAGE-1mRNA和AFP mRNA的对比检测。结果 MAGE-1mRNA在12例肝转移癌患者外周血中的检出率为33．3％(4／12);肝炎后肝硬化、肝血管瘤患者和健康志愿者中均未检出。AFP mRNA在肝炎后肝硬化患者外周血中的检出率为13．6％(3／22),在肝转移癌、肝血管瘤患者和健康志愿者中均未检出。45例肝细胞癌患者外周血中,MAGE-1mRNA／AFP mRNA的检出率分别是术前42．2％(19／45)／51．1％(23／45),术后7d20％(9／45)／24．4％(11／45),术后28d15．6％(7／45)／22．2％(10／45)。统计分析提示,术后28d肝细胞癌患者外周血检出MAGE-1 mRNA／AFPmRNA预示患者近期复发。并且双标志物联合检测较单标志物检测对预测复发具有更高的敏感性。结论采用巢式RT—PCR的方法联合检测肝细胞癌患者术后28d外周血中癌特异性的MAGE-1 mRNA和肝细胞特异性的AFP mRNA有助于预测肝细胞癌患者术后的转移复发。     

LMPs特异性T淋巴细胞对鼻咽癌细胞的杀伤作用

目的:研究树突状细胞负载EB病毒潜伏膜蛋白(latent membrane proteins,LMPs)介导生成的LMPs特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)LMPs-CTL的生物学特性,观察其对LMPs阳性鼻咽癌细胞SUNE的杀伤作用?方法:用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞,采用贴壁分离及白细胞介素(interleukin,IL)-4?粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)等细胞因子诱导成熟树突状细胞(dendritic cell,DC),通过DC细胞负载LMPs多肽抗原并递呈给同源T淋巴细胞,制备LMPs-CTL?CCK8法检测LMPs-CTL对SUNE细胞的杀伤作用;ELISA和羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxy fluoroscein succinimidyl ester,CFSE)染色法检测LMPs-CTL分泌IFN-γ及其增殖?结果:LMPs-CTL对SUNE细胞的杀伤率在12 h和24 h分别为(43.47 ± 1.93) %和(77.15 ± 3.18) %,显著高于对照组的(11.45 ± 3.06) % 和(24.27 ± 13.20)%(P < 0.05)?SUNE细胞刺激后,LMPs-CTL增殖能力较对照组有明显增强,IFN-γ分泌量达到(613.40 ± 121.77) pg/ml,显著高于对照组(86.90 ± 3.70) pg/ml(P < 0.05)?结论:通过DC细胞负载LMPs混合多肽可诱导生成LMPs-CTL,对LMPs阳性鼻咽癌细胞有较强的杀伤作用?     

噬菌体呈现颗粒疫苗诱导抗肿瘤细胞毒性T细胞反应

目的 构建呈现肿瘤相关抗原Ｐ８１５Ａ的噬菌体颗粒,在体诱导针对肥大细胞瘤Ｐ８１５的特异性细胞毒性Ｔ细胞（ＣＴＬ）反应。方法 构建呈现ＣＴＬ表位ＰＩＡ３５－４３的噬菌粒载体,大量制备呈现此表位的重组噬菌体颗粒、小剂量、无佐剂皮上免疫ＤＢＡ／２小鼠（Ｈ－２＾ｄ）,采用＾５１Ｃｒ释放法、ＥＬＩＳＰＯＴ观察针对肥大细胞瘤Ｐ８１５的ＣＴＬ反应。结果 重组噬菌体呈现颗粒疫苗在体诱导了针对弱抗原Ｐ８１５Ａ的ＣＴ     

抗原致敏树突细胞激活细胞毒性T淋巴细胞的体外抗肿瘤作用

目的 利用新型诱导剂钙离子载体(CI)A23187联合重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)体外诱导人外周血单核细胞(PBMC)生成树突细胞(DC),观察DC刺激细胞毒性T细胞(CTL)对人白血病细胞K562细胞产生的特异性杀伤作用.方法 采用密度梯度离心法及黏附法分离出PBMC,分2组培养:传统方法组,加人rhGM-CSF+重组人白细胞介素4+重组人肿瘤坏死因子-α;新型诱导剂组,加入rhGM-CSF+CI A23187.培养开始前,予K562细胞冻融抗原致敏,培养96 h后收集负载抗原的DC.光镜观察细胞形态的变化;流式细胞仪检测DC细胞的表面标志;四甲基偶氮唑盐比色法检测各组DC刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力、DC对K562细胞的抑制作用和DC激活的CTL细胞对K562细胞的杀伤作用.结果 与传统方法相比,A23187联合rhGM-CSF 诱导培养的DC具有更加典型的树突形态;DC 表面分子CD83、CD1a、CD86、CD40表达(45.2%±1.8%、31.5%±3.9%、40.1%±7.8%、36.4%±6.3%)较传统方法组(16.9%±1.3%、20.4%±3.4%、26.5%±2.2%、22.3%±3.0%)明显高(均P<0.05),且CD14表达(5.7%±0.8%比19.0%±1.6%)明显低(P<0.05);负载K562细胞冻融抗原后的DC具有明显刺激同种异体T细胞增殖作用;对K562细胞有明显抑制作用,效靶比为1:1及10:1时,抑瘤率分别为(25.3±3.8)%比(15.6±2.4)%、(35.6±5.2)%比(22.9±3.2)%(均P<0.05);刺激的CTL对K562细胞有明显的杀伤作用,效靶比为10:1及40:1时,杀瘤率分别为(44.3±6.2)%比(29.9±2.8)%、(61.0±5.2)%比(43.1±4.8)%(均P<0.05).结论 新型诱导剂CI A23187联合rhGM-CSF能更有效地诱导PBMC生成强效成熟DC,K562细胞冻融抗原冲击该DC激活CTL能够获得较强的杀伤K562细胞的能力.     

Generation of IgE-specific cytotoxic T lymphocytes as a novel immunotherapeutic approach for the treatment of allergic asthma

INTRODUCTIONOverproduction of immunoglobulin E (IgE) by a subset of B cells plays a key role in the pathogenesis of allergic asthma. Anti-IgE monoclonal antibodies have been successfully used to treat the disease, but long-term application is required.METHODSFor this study, cytotoxic T lymphocytes (CTLs) against IgE-producing B cells were generated ex vivo by stimulating naive CD8 T cells with IgE-derived peptides presented by Drosophila-derived artificial antigen-presenting cells. Based on the treatment of allergic asthma in mice, the inhibitive effect of this CTL on IgE responses and airway inflammation was determined with the enzyme-linked immunosorbent assay and histochemical method.RESULTSThe IgE-specific CTLs effectively lysed target cells in vitro, while the adoptively transferred CTLs specifically inhibited IgE responses and airway inflammation in an asthmatic mouse model. The effect of IgE-specific CTLs is MHC (major histocompatibility complex) Class I-restricted and requires the expression of perforin.CONCLUSIONIgE-specific CTLs generated ex vivo may provide a novel treatment for allergic asthma and lead to a new therapy for other immunological disorders.     

肾癌患者外周血T淋巴细胞核仁区酸性非组蛋白表达参数分析

目的 :探讨肾癌患者的外周血 T淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白 (Ag- NORs)的表达特点及其免疫学诊断意义。 方法 :应用细胞培养银染及 KL型肿瘤免疫计算机图像分析系统 ,分析 30例肾癌患者及 30例门诊健康志愿者外周血的 Ag-NORs的含量 ,以细胞核仁银染面积与细胞核面积比值 (I.S% )作为评估指标作比较。结果 :肾癌患者组 Ag- NORs的 I.S%值为 (5 .2 6± 0 .71) ,明显低于正常人的 (7.34± 0 .4 7) ,两者差异显著 (P<0 .0 1)。治疗后肾癌患者 I.S%值明显升高 (P<0 .0 1)。结论 :外周血 T淋巴细胞 Ag- NORs可望成为肾癌免疫学诊断及预后评估的一项参考指标。     

慢性乙肝患者血中细胞毒性T淋巴细胞表面PD-1/PD-L1的表达与病情的相关性

目的  研究慢性乙型肝炎患者外周血中细胞毒性T淋巴细胞表面程序性死亡分子-1（PD-1）/程序性死亡分子-1配体（PD-L1）的表达及其与病情的相关性。方法  选择慢性乙型肝炎患者90例和健康体检者82例进行研究。分别纳入慢性乙肝组和健康对照组,检测外周血细胞毒性T淋巴细胞表面PD-1、PD-L1的表达量以及血清生化指标。结果  慢性乙肝组患者外周血中细胞毒性T淋巴细胞表面PD-1和PD-L1的表达量显著高于健康对照组,乙型肝炎病毒载量越高、外周血中细胞毒性T淋巴细胞表面PD-1和PD-L1的表达量越高;慢性乙肝组患者血清中ALT、AST、IL-6、IL-8的含量均显著高于健康对照组且与外周血中细胞毒性T淋巴细胞表面PD-1和PD-L1的表达量呈正相关。结论  慢性乙型肝炎患者外周血中细胞毒性T淋巴细胞表面PD-1和PD-L1的表达量显著升高且与肝损伤程度、炎症反应程度相关。

     

Construction of HA-1-DC Nucleic-acid Vaccine and Induction of Specific Cytotoxic T Lymphocytes

An HA-1-DC nucleic-acid vaccine was constructed to induce anti-leukemia effect after hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). DCs were generated from HSCT donors in vitro, and its immunologic activity was assayed by using flow cytometry and mixed lymphocytes reaction. HA-1 gene was electroporated into the cultured DCs to construct a DC nucleic-acid vaccine. After transfection for 48 h, the expression of HA-1 protein could be detected by using Western blot. The DCs were cultured with syngenic lymphocytes to induce specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). The cytoxicity of the CTLs was detected by LDH assay. The results showed that The DCs derived from peripheral blood monocytes (PBMCs) expressed the phenotype of DCs, and were effective in stimulating proliferation of the allogenic lymphocytes. After electroporating for 48-h, HA-1 protein was detected by using Western blot. The cytotoxity of inducing CTLs was higher than the control group. It was suggested that minor histocompatibility antigen HA-1 could be considered as a target of immunotherapy against leukemia after HSCT.     

原发性肾病综合征患儿外周血T淋巴细胞亚群的观察

目的：探讨原发性肾病综合征(INS)激素敏感与激素不敏感组患儿的细胞免疫功能状态。方法：T淋巴细胞亚群测定采用APAAP桥联法。结果：INS激素敏感与激素不敏感组患儿活动期CD4^ 细胞下降，CD8^ 细胞升高，CD4^ ／CD8^ 细胞比值下降，与正常对照组比较，有显性差异。激素敏感与不敏感组间比较无显性差异。结论：INS患儿除存在细胞免疫异常外，还有其它因素参与肾脏免疫病理损害的转归。     

Effect of oxymatrine on specific cytotoxic T lymphocyte surface programmed death receptor-1 expression in patients with chronic hepatitis B

Background  Oxymatrine has certain antiviral effects in the treatment of chronic hepatitis B (CHB), but its exact mechanism is unclear. The objective of the present study was to explore oxymatrine’s antiviral mechanism by studying its effect on the hepatitis B virus (HBV) specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) surface programmed death receptor-1 (PD-1) expression in CHB patients.

Methods  Sixty-five CHB patients who had HBV DNA³10⁴ copies/ml, positive HBeAg, positive human leukocyte antigen (HLA)-A2, alanine aminotransferase (ALT) >2´upper limit of normal value (ULN) were randomly divided into two groups: treatment group (n=33), treated with an intravenous infusion of 600 mg oxymatrine in glucose solution once a day for a month, then with a 200 mg oxymatrine oral capsule three times a day, and a 200 mg silibin meglumine tablet three times a day; control group (n=32) patients were treated only with silibin meglumine tablet, method and dosage were the same as those of treatment group. Three months later, peripheral blood HBV-specific CTL surface PD-1 expression, HBV-specific CTL level, HBV DNA, HBeAg, and results of liver function tests were analyzed and compared.

Results  Three months post-treatment, in the treatment group, peripheral blood HBV-specific CTL surface PD-1 expression ((19.42±15.94)%) decreased significantly compared to the pretreatment level ((31.30±24.06)%; P <0.05), and decreased significantly compared to that of control group three months after treatment ((29.45±21.62)%; P <0.05). HBV-specific CTL level ((0.42±0.07)%) significantly increased compared with the pretreatment ((0.29±0.15)%; P <0.01), and the control group posttreatment level was (0.31±0.15)% (P <0.05). HBV DNA level in 11 cases became negative (HBV DNA<500 copies/ml, 33.33%), which was higher than that of the control group after treatment (two cases, 6.25%; χ²=7.45, P <0.01), HBeAg of nine cases turned negative (27.27%), which was higher than that of the control group after treatment (one case, 3.13%; χ²=7.27, P <0.01).

Conclusion  Oxymatrine could downregulate peripheral blood HBV-specific CTL surface PD-1 expression in CHB patients, increase HBV-specific CTL level, which may be one of the possible mechanisms by which oxymatrine clears or inhibits HBV in CHB patients.