推进式离心管结合单密度梯度法快速纯化大鼠胰岛

目的 探索用简化的单一密度梯度法建立快速纯化大鼠胰岛细胞的方法.方法 用胶原酶P消化分离SD大鼠胰腺,采用自制的推进式离心管以及单一密度(1.090 g/cm3)的HCA-Ficoll-400密度梯度液来纯化大鼠胰岛细胞.通过DTZ染色,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能.结果 纯化后平均每条SD大鼠胰腺可获得(731±89)个胰岛细胞当量(IEQ),平均纯度为(73.2±9.4)%.平均活率为(92.8±2.4)%.纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖时胰岛素的释放量为低糖时的3.54±O.79倍(P＜o.001).结论 为各种胰岛细胞的实验研究建立了快速分离纯化胰岛细胞的方法,纯化的胰岛细胞功能良好.     

小鼠胰岛分离纯化后肾被膜下胰岛移植动物模型的建立

目的：探讨一种分离纯化小鼠胰岛细胞的优良新型方法,经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植建立动物模型.方法：（1）胰岛分离及检测：采用胆总管内胶原酶逆行灌注消化胰腺的方法分离胰岛,淋巴细胞分离液单一密度梯度离心法纯化胰岛.利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,台盼兰染色鉴定胰岛细胞的活性,以葡萄糖刺激胰岛素释放来检测胰岛功能.（2）胰岛移植：空白对照组（n =12）,糖尿病鼠组（n=12）,对糖尿病鼠组行同种异体鼠肾被膜下胰岛移植,观测血糖及生命体征变化.结果：每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90 ％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=3）.糖尿病小鼠经胰岛移植后,1～3 d内,血糖均降至11.1 mmol/L以下.结论：采用新改进的分离纯化胰岛方法,可获得高质量、高功能的胰岛细胞.经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植动物模型的成功建立,为进行人胰岛小鼠移植及人胰岛同种异体移植提供重要试验价值.     

大鼠胰岛的分离和纯化

目的 探讨获得足够数量和较高纯度大鼠胰岛的分离和纯化方法.方法 采用V型胶原酶灌注消化法分离成年大鼠胰岛,Ficoll 400非连续密度梯度法纯化胰岛.双硫腙(DTZ)染色鉴定培养的胰岛细胞,锥虫蓝染色检测细胞活性.葡萄糖刺激胰岛素释放试验评价胰岛细胞的功能.结果 分离纯化后大鼠胰岛平均收获量为(480±30)IEQ,纯度大于90%,活性大于90%.在低糖和高糖刺激下,胰岛素分泌量分别为(12.28±0.89)mIU/L、(19.01±1.49)mlU/L,二者相比较.差异有统计学意义(P<0.05),刺激指数为(1.55±0.01).结论 胶原酶V逆行灌注消化胰腺和Ficoll400非连续密度梯度纯化法,可获得高纯度高活率的大鼠胰岛.     

大鼠胰岛细胞分离纯化的实验研究

目的寻找简便、高效的大鼠胰岛分离纯化方法,并对纯化胰岛细胞的基本生物学状况进行鉴定。方法采用胰管内注射胶原酶水浴消化以及Ficoll400不连续密度梯度离心法纯化,用DTZ染色计算胰岛细胞的纯度;用AO/PI染色计算胰岛细胞存活率;通过体外葡萄糖刺激胰岛素分泌试验和糖尿病大鼠移植判定胰岛细胞功能。结果纯化后获得(738±193)个胰岛细胞/每只胰腺,纯度为(77±13)%,纯化后细胞形态完好,活度大于95%,体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验,低糖情况下胰岛素分泌量为(24.31±5.47)mIU/L,高糖情况下为(37.62±4.29)mIU/L,两者有显著性差异(P<0.05),胰岛移植后,实验组48h后血糖值降至正常,维持(3.9±1.7)d。结论采用胰管内胶原酶灌注进行大鼠胰岛分离及Ficoll400不连续密度梯度法纯化可获得较高纯度和活度的胰岛细胞。     

一种简易高效的大鼠胰岛分离纯化方法

目的探索一种高效、高纯度大鼠胰岛分离纯化方法,并研究纯化后的胰岛细胞在体内外环境中的基本生物学功 能状况。方法采用 Ｈａｎｋｓ液经胰管内注射法机械性扩张破坏大鼠胰腺的腺泡组织点后将其剪碎置于含 １ｇ／Ｌ胶原酶 的 Ｈａｎｋｓ 液中,于 ３７℃中静止消化 ２５～３０ｍｉｎ后移入含 １０％胎牛血清的 ＲＭＰＩ－１６４０完全培养液中,２４℃短期培养, Ｆｉｃｏｌｌ－４００非连续密度梯度液离心纯化胰岛,纯化后的胰岛进行异种移植。结果经Ｆｉｃｏｌｌ－４００纯化后,平均每只成年 Ｗｉｓｔａｒ大鼠胰腺能获得 ９２０～ｌ ２３０个胰岛,纯度可达 ９８％以上;在葡萄糖刺激下胰岛素释放量约为基础分泌水平的 ２．２ 倍（Ｐ＜０．００１）纯化后的胰岛异种移植可逆转实验性糖尿病ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠的高血糖平均达（８．７±１．６）ｄ。结论胰腺消化 物经短期培养后再进行胰岛纯化的方法具有耗酶量少、技术难度小、胰岛纯度和产率及活率高的特点,是一种简便易行 的高效分离纯化方法．     

大鼠胰岛细胞的分离纯化及培养

目的　探讨大鼠胰岛细胞分离纯化和培养的方法。方法　采用胰导管逆行灌注Hanks液分离成年大鼠胰岛,Ⅴ型胶原酶消化,不连续密度梯度Ficoll 4 0 0纯化胰岛。用台盼蓝和双硫腙染色检测胰岛活性和纯度,葡萄糖刺激胰岛素释放试验检测胰岛功能。结果　胰岛细胞的收获量为5 4 0±15 0个胰岛 胰腺,活性>90 % ,纯度>90 % ,高糖刺激后胰岛素释放量为低糖刺激的2倍多。结论　胰导管灌注Hanks液,Ⅴ型胶原酶消化和不连续密度梯度葡聚糖纯化胰岛,可以获取数量多,活性和纯度好的胰岛     

大鼠胰岛分离及纯化方案的改进

目的优化大鼠胰岛分离纯化条件,为糖尿病胰岛受损的发病机制研究及胰岛再生的应用提供必要材料。方法胆总管原位灌注胶原酶V消化胰腺并分离胰岛后,比较经典不连续密度梯度Ficoll离心法和Histopaque1077密度离心法纯化胰岛的效果,其间观察胰腺灌注液体积及消化时间不同对大鼠胰岛分离纯化的影响,并对纯化后的胰岛进行数量、纯度和功能的体外检测。结果 Histopaque 1077密度离心法比经典不连续密度梯度Ficoll离心法可得到更多优质的胰岛(P<0.01)。两种方法获得的胰岛在高糖刺激下释放胰岛素的能力差异无统计学意义(P>0.05)。胰腺灌注液之体积及消化时间对胰岛提取有十分重要的影响。结论 Histopaque 1077密度离心法简单易行且效率较高,有望成为纯化大鼠胰岛的首选方法,便于临床和基础研究工作的开展。     

大鼠胰岛的分离和钙化

目的：改进分离与纯化方法，以获得较高纯度和活力的大鼠胰岛。方法：用改良的酶法分离、Ｄｅｘｔｒａｎ梯度法纯化大鼠胰岛。用ＤＴＺ法判定胰岛纯度；用ＡＯ／ＰＩ法判定胰腺存活率；用大鼠胰岛移植于ＳＴＺ糖尿病小鼠法判定其功能。结果：雌、雄性ＳＤ和Ｗｉｓｔａｒ大鼠间胰岛形态无明显差异。Ⅴ型和Ⅵ型胶原酶对大鼠胰岛分离效果相似；分离以０．１％胶原酶分次消化、作用３０ｍｉｎ为宜，细胞存活率达９０％。纯化用２２％－１     

大鼠胰岛分离纯化技术的改进

目的探索成年大鼠胰岛的分离纯化理想方法,并对获得的胰岛进行体外功能鉴定。方法通过用胶原酶P液灌注分离成年SD大鼠胰岛,不连续密度梯度离心法纯化胰岛,STZ染色鉴定胰岛,AO/PI染色鉴定胰岛活率,胰岛素释放试验判定胰岛功能,光镜观察体外培养胰岛的形态学变化。结果纯化后每只大鼠胰岛收获量为(629±102)IEQ,胰岛纯度>90%,胰岛细胞活率>90%,胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量在低糖和高糖刺激下的浓度分别为(3.701 5±0.492 0)mIU/L和(10.477 1±2.233 4)mIU/L,刺激指数为2.837 8±0.102 3,体外培养48h几乎完全贴壁,培养3周生长状况仍良好。结论分离条件把握好后,胶原酶P消化、Fi-coll400非连续密度梯度离心法可获得高纯度高活率的大鼠胰岛。     

多种分离纯化大鼠胰岛细胞的实验方法比较

目的：采用不同的分离或消化方法，探讨如何提高大鼠胰岛细胞分离纯化后的收获量和质量。方法：将25只供体SD雄性大鼠依胰腺分离或消化的方法不同随机地分为5组；（1）A组：胆总管灌注胶原酶P；（2）B组：胆总管灌注Hanks液；（3）C组：胆总管不灌注液体；A，B，C＜3组胰腺直接分次消化；（4）D组：胆总管不灌注，胰腺剪碎后分次消化；（5）对照组：胆总管灌注胶原酶P，胰腺直接单次消化，将分离的且经岛沉淀物用Ficoll-400纯化并培养，再把胰细胞移植于糖尿病裸鼠受体腹腔内。结果：纯化后的胰岛细胞在收获量上A和B组明显多于对照组或C组，而D组最低；A，B和D3组的纯度均高于对照组或C组；在胰岛成活率方面，A，B，C3组均高于对照组或D组，移植于糖尿病裸鼠受体内的大鼠胰岛细胞均可逆转高血糖状态。结论：经胆总管灌注胶原酶后的大鼠胰腺用分次消化的方法可提高胰岛细胞的收获,纯度和活性。     

成年猪胰岛细胞的分离纯化及其微囊包裹

目的:探索成年猪胰岛细胞分离纯化的有效方法,获取具有免疫隔离作用的小微囊化胰岛细胞。方法:①用胶原酶灌注,人工、静态的方法分离成年猪胰腺;用Ficoll400不连续密度梯度离心纯化猪胰岛,从形态和功能学(体外培养)鉴别分离细胞的活力。②用自制的静电微囊发生装置、采用纯化的海藻酸钠和多聚赖氨酸材料制备小微囊化胰岛细胞,并鉴别微囊胰岛的活力和微囊膜的通透性。结果:①每只猪胰腺可获得(292647±79909)个胰岛,纯化前胰岛产量为(5360±1779)IEQ/g胰腺组织,纯化后产量(3239±1116)IEQ/g胰腺组织,胰岛纯度为90%。胰岛组织学结构完整,体外培养胰岛素分泌良好,葡萄糖刺激释放反应明显,显示了良好的细胞活力。②微囊化胰岛细胞圆形,直径315-350μm,表面光滑,大小相对均一,其内可见1-2个胰岛团。微囊胰岛也具良好活力,微囊膜通透性良好。结论:①本方法分离成年猪胰岛能获得较高数量和具有良好活力的猪胰岛细胞。②自制的静电微囊发生装置能制成具有生物活性的大小相对均一,圆形,表面光滑的小APA微囊化胰岛细胞(直径315-350μm),为进行肝内微囊化胰岛移植提供了可能。     

大鼠胰岛细胞原代培养方法的改良

目的探讨一种简单易行的大鼠胰岛细胞培养方法,获取尽可能多的高质量胰岛,并寻找进行体外实验研究的最佳时间和条件。方法运用胶原酶原位灌注法分离胰腺,Ficoll400纯化胰岛细胞,双硫腙(DTZ)染色鉴定胰岛,运用倒置显微镜观察细胞生活状态,放免法检测胰岛素分泌考察胰岛功能。结果每只大鼠可分离438±27个胰岛/胰腺,细胞存活率为92.3±2.3%,GSIS实验中胰岛素释放指数SI为3.25±0.26。结论本分离纯化方法可获得数量多,质量高的胰岛细胞,为原代胰岛细胞的体外研究提供实验条件。     

家兔胰岛的分离纯化研究

目的探讨家兔胰岛分离、纯化的方法及其计数和活性的测定。方法选用日本大耳自家兔。予V型胶原酶于38℃内水浴外消化。采用Ficoll 400不连续密度梯度离心法对胰岛进行纯化,并对获得的胰岛进行DTZ染色计数。同时计算胰岛当量（IEQ）数。予台盼蓝染色法分析胰岛活性。结果DTZ染色纯化前每只家兔胰腺收获胰岛细胞数为15046±2733。IEQ数为：4635±554;化后胰岛数量为：5300±609,IEQ数为：1213±218;胰岛细胞活率〉90％,胰岛纯度为〉60％。结论家兔胰腺消化分离后得到胰岛的数量和IEQ均较多,且动物来源广泛、实验成本较低,预示其在胰岛移植中可作为胰岛来源。     

成年大鼠非胰岛内Nestin阳性细胞的体外分离、培养及分化

目的:建立成年大鼠胰腺非胰岛内Nestin阳性细胞的体外分离培养及分化的方法。方法:采用胰管内注入胶原酶消化法分离3只成年大鼠胰腺组织,并经含10%胎牛血清RPMI 1640液（pH 7.6）体外培养,36 h后弃去悬浮细胞及胰岛,改用无10%胎牛血清RPMI 1640液（pH 7.4）加bFGF、EGF及N₂添加剂培养,18～22 d后收集新生类胰岛样细胞团并传代培养。挑选新分离的胰岛和新生类胰岛样细胞团每次各40个,共3次,采用¹³¹Ⅰ放射免疫法测定分离的胰岛及新生类胰岛样细胞团的胰岛素分泌量,并计算葡萄糖刺激指数（SI）;免疫荧光细胞化学法检查贴壁细胞及传代后的新生类胰岛样细胞团Nestin阳性细胞的表达。 结果:胰管内注入胶原酶消化法可获得功能、形态良好的胰岛;分离后胰腺组织在pH 7.6的10%胎牛血清RPMI 1640液培养条件下,36 h内胰岛细胞不贴壁,贴壁细胞中大多数表达Nestin阳性细胞,无胰岛素和胰高血糖素表达,但Nestin表达不一,培养18～22 d可见新生类胰岛样细胞团出现,新生类胰岛样细胞团传代后仍可见Nestin阳性细胞。新分离的40个胰岛在含糖3.3、16.7 mmol•L^-1培养液中胰岛素分泌量为(63.6±4.0)、(202.2±14.8)mIU•L^-1;而新生的40个类胰岛样细胞团胰岛素分泌量为(3.5±0.2)、(3.3±0.2)mIU•L^-1,差异有显著性（P<0.001）。 结论:胰管内注入胶原酶消化法可获得功能、形态良好的胰岛;在pH 7.6条件下可分离培养出成年大鼠胰腺非胰岛内Nestin阳性细胞,经无血清培养形成的类胰岛样细胞团,可传代培养,并表达胰岛素。胰腺非胰岛内Nestin阳性细胞具有胰腺干细胞特点。     

SD大鼠胰腺导管上皮细胞培养技术的研究

目的 分离纯化SD大鼠胰腺导管上皮细胞，为将其转分化为胰岛细胞提供细胞来源。方法 用酶消化法培养SD大鼠胰腺导管上皮细胞，观察细胞增殖动态，用CK-19进行免疫组化鉴定。结果 胰腺导管上皮细胞可在体外有效扩增，有效去除成纤维细胞是扩增的关键。结论 低血清培养和反复贴壁法可获得较纯的胰腺导管上皮细胞。     

犬胰岛的分离与纯化

目的探讨影响胰岛分离与纯化结果的相关因素,寻找获得足够数量、高纯度、具有活性的胰岛细胞的方法,为临床胰岛移植应用提供实验基础。方法寻找自动分离技术连续分离22只犬的胰岛,连续性密度梯度离心法纯化胰岛,观察分离纯化出来的胰岛细胞大体形态、超微结构,用葡萄糖刺激释放实验检验其活性。结果纯化前胰岛计数平均为（155040±310）IEQ／胰腺,纯化后的胰岛平均计数为（74200±185）IEQ／胰腺,纯度约为（89．4±2．6）％,回收率约为（47．8±1．3）％,活率达到（93．0±1．7）％。胰岛分离纯化的结果无论在数量上还是在质量上都随着分离技术的不断更新,操作技术的娴熟而有很大提高。葡萄糖刺激释放实验显示低糖组与高糖组比较P〈0．001,提示分离纯化后获得的胰岛功能状态良好。结论从犬中分离和纯化出足够数量的胰岛细胞,可用于临床研究。     

半自动消化法分离纯化人胰岛细胞的实验研究

目的 探索用半自动胰腺消化系统建立大规模人胰岛细胞纯化的可靠方法.方法 使用自制的半自动人胰腺消化分离装置及胶原酶P进行人胰腺的消化分离,用COBE2991细胞分离机及HCA-Ficoll纯化人胰岛细胞.通过DTZ染色,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的分泌功能.结果 消化后平均每条胰腺可平均获得(38 6201±78 219)个胰岛细胞当量(IEQ),纯化后平均每条胰腺可获得231 420±28 054IEQ,平均每克胰腺组织可获得(3148±317)IEQ,纯化后胰岛细胞平均纯度为(62.81±2.68)%.纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖(16.7 mmol/L)时胰岛素的释放量为低糖(3.3 mmol/L)时的3.53倍(P≤0.001).结论 成功建立了半自动人胰岛细胞分离、纯化的方法,纯化的人胰岛细胞具有良好的生物活性.     

成年猪胰岛分离方法的改进

目的 :开发成年猪胰岛分离方法。方法 :取成年猪胰腺体尾部 ,胰管内注入冷 0 .1 %胶原酶消化液 ,在 38.5℃水浴箱中消化后 ,放入 4℃ Hanks液中分离并用 60 0μm的滤过网过滤回收。残留的组织重新悬浮在冷 Hanks液中 ,并放入 Ricordi′s chamber内振荡 5min后再次过滤回收。用Ficoll不连续密度液梯度离心法进行胰岛纯化。结果 :纯化前、后胰岛收获量分别为 ( 850 5± 3349)g-1〔IEQ:( 4 2 53± 2 732 ) g-1)、( 2 334± 1 2 2 3) g-1〕,纯度 >80 %。胰岛收获量与消化后的消化液胰蛋白酶活性显示了弱的负相关 ( r=- 0 .44,P=0 .1 3) ,胰岛收获量≥ 80 0 0 g-1组的消化后消化液胰蛋白酶活性明显低于胰岛收获量 <80 0 0 g-1( 78.3± 2 6.7vs1 37.5± 48.4BAEEU,P<0 .0 5)。结论 :我们采用的胰岛分离方法能够获得大量的猪胰岛细胞 ;胰蛋白酶活性影响胰岛收获量。     

NOD 小鼠胰岛的分离及其在体内外的生物学特性

目的 建立分离纯化非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠胰岛的方法,并对其体内外生物学特性进行研究?方法 采用改良的胶原酶消化结合Ficoll 密度梯度离心方法,分离纯化NOD 小鼠胰岛?应用体外糖刺激实验检测分离纯化的胰岛功能,以及通过监测移植小鼠的血糖?体重变化及糖耐量实验对移植胰岛的体内生物学功能进行分析,并通过HE 染色和免疫荧光染色检测肾被膜下移植胰岛的存活情况?结果 胰岛产率为(116 ±12)个胰岛/胰腺,纯度>90%?体外糖刺激实验结果显示,NOD 小鼠胰岛的糖刺激胰岛素释放水平明显低于KM 小鼠胰岛?胰岛移植实验显示,移植胰岛能有效改善糖尿病小鼠的血糖?体重和糖耐量,但改善作用一般仅能维持2 周左右?HE 染色和免疫荧光染色结果显示,肾被膜下可见胰岛素阳性的胰岛细胞团,并且在残存的移植胰岛细胞团周围存在大量淋巴细胞浸润?结论 通过改良的小鼠胰岛分离方法可由NOD 小鼠分离得到大量较高纯度的胰岛,可用于今后探索如何阻断自身免疫损伤保护移植胰岛的研究?