端粒酶活性在骨髓间充质干细胞中的表达

目的：探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells MSCs)端粒酶活性的表达并检测其部分生物学特性。方法：取正常成人骨髓用含10%新生牛血清的LG-DMEM培养液培养、扩增。流式细胞仪行细胞表面抗原检测，细胞化学染色鉴定其生物学特性，观察其在地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C特定培养条件下向成骨细胞分化的能力，采用TRAP（Telomerase repeat amplification protoco1 assay)-银染法测定其端粒酶的活性。结果：分离培养获得的贴壁细胞，碱性磷酸酶染色阳性。流式细胞仪检测CD34、CD45呈阴性表达，CD29、CD44呈阳性表达。经向成骨细胞诱导3周后，可得到成骨细胞，经茜素红染色得到证实。TRAP-银染法证实MSCs表达一定的端粒酶活性。结论：体外分离培养的MSCs可以向成骨分化，表达一定的端粒酶活性，具有干细胞的特性。     

新生大鼠大脑皮质神经干细胞的分离培养与胆碱能神经元的鉴定

目的:体外分离和培养新生大鼠大脑皮质神经干细胞并进行鉴定,为用于脑梗死动物模型梗死区移植细胞作准备.方法:分离新生大鼠皮质神经干细胞,进行体外培养,使用免疫细胞荧光染色技术对细胞的特性进行鉴定,并对细胞的胆碱能特征进行鉴定.结果:获得了Nestin阳性的神经干细胞,其分化后可获得MAP-2、GFAP和 CNPase阳性的神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞;通过胆碱能鉴定发现大脑皮质干细胞可分化为胆碱能神经元. 结论:体外分离和培养的大脑皮质神经干细胞具有增殖分化的能力,并可以分化为胆碱能神经元,有望应用于皮质损伤后认知障碍及运动障碍的细胞移植治疗.     

脑源性神经营养因子对神经干细胞的体外定向分化及体内移植的影响

目的 了解体外培养的大鼠脑神经干细胞植入正常成鼠脑内后的存活、迁移和分化情况，以及脑源性神经营养因子（BDNF）对其影响。方法 从出生2～3d的大鼠脑皮质分离培养神经干细胞，采用BDNF诱导分化后，用免疫荧光染色鉴定神经元的数量。将培养的神经干细胞经溴脱氧尿苷（BrdU）标记，或同时加用BDNF后，移植入成鼠大脑皮质，移植1个月后，应用抗BrdU和抗β-ptubulin Ⅲ双重免疫荧光染色，对脑切片中细胞分化和迁移情况进行分析。结果 植入的神经干细胞可在大脑皮质发生迁移，个别移植的细胞可分化成神经元。体外诱导分化实验中，神经干细胞经BDNF诱导3d后，其分化成神经元的数量约为对照组的5倍。在神经干细胞脑内移植时，加用BDNF发生迁移的神经干细胞的数量较未加BDNF的增多，但神经干细胞分化成神经元的数量与未加BDNF对比无明显差别。结论 体外培养的新生大鼠脑神经干细胞植入正常成鼠脑内后，能够存活、迁移及分化，BDNF有助于移植的神经干细胞的存活和迁移。     

人脑神经干细胞的分离培养和鉴定

目的 探讨人脑神经干细胞的分离培养和鉴定方法。方法 采用无血清培养液从人胚胎脑皮质分离和培养神经干细胞，并应用免疫荧光技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向化潜能的鉴定。结果 鉴定表明从人胚胎脑皮质分离培养的细胞具有神经干细胞的特征，并可在体外增殖，经诱导可分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。结论 从人胚胎脑皮质成功分离培养了神经干细胞，它是研究细胞诱导分化的良好模型。     

脾气虚证自由基损伤、端粒长度变化探析

目的：探讨脾气虚状态下模型大鼠体内氧自由基损伤程度和端粒长度的变化情况。方法：采用＂饮食不节＋疲劳过度＂复合方法造模14 d后,取大鼠脑皮质和血清测定SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA的含量,取脑皮质测端粒长度。结果：脾气虚模型组大鼠血清和脑皮质中SOD活性、GSH-Px活性、T-AOC和MDA含量与正常组相比均有显著差异（P〈0.05）。模型组脑皮质中端粒长度明显缩短（P〈0.05）。结论：脾气虚模型大鼠体内存在着明显的抗氧化酶活性降低和端粒长度缩短,但脾气虚状态处于脾病全程的何种阶段尚需深入研究了解。     

系统性红斑狼疮患者外周血CD4+和CD8+细胞端粒长度及端粒酶活性的研究

目的:探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血CD4 、CD8 和CD19 细胞端粒长度和端粒酶活性变化及其在发病中的作用.方法:用免疫磁珠法,从外周血单个核细胞分离CD4 、CD8 和CD19 淋巴细胞,提取细胞蛋白后,用PCR为基础的端粒酶测定法(Telomeric repeats amplification protocol,TRAP)测定端粒酶活性;Southern Blot测定细胞端粒长度.结果:SLE患者CD4 、CD8 和CD19 细胞端粒酶活性均高于正常对照,但只有CD19 细胞端粒酶活性与正常对照相比差异有显著性(P<0.05).SLE患者CD4 和CD8 淋巴细胞的端粒长度均较正常对照明显缩短,CD19 淋巴细胞的端粒长度无明显缩短.结论:SLE患者CD19 细胞端粒酶活性显著增高,维持了细胞端粒长度;而CD4 和CD8 细胞端粒酶活性可能不足以维持由于细胞分裂所导致的细胞端粒缩短.     

新生大鼠神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的获得新生大鼠神经干细胞,为深入研究其增殖分化奠定基础。方法从新生24小时内大鼠端脑及中脑部位分离NSC,采用体外无血清悬浮培养,以获得能在体外长期生存的NSC;通过单细胞克隆实验检测其自我更新能力,免疫细胞化学检测NSC标志物nestin表达及分化为神经元和胶质细胞的能力;用细胞计数法研究其生长特点并绘制生长曲线。结果获得的NSC能在体外长期生存,具有很强的增殖能力、自我更新能力,能分化为神经元和胶质细胞,具有多向分化能力,表达nestin,体外传代至10代细胞数量扩增了40倍。结论成功地从新生大鼠端脑和中脑中分离得到了能在体外长期培养的NSC。     

新生大鼠脊髓源性神经干细胞的分离培养及分化鉴定

目的：探讨分离、培养新生大鼠脊髓源性神经干细胞的方法并对其进行分化鉴定,为临床应用脊髓神经干细胞进行周围神经系统疾病的替代治疗奠定细胞学基础。方法：首次采用注射器灌注法分离新生24 h Wistar大鼠脊髓源性神经干细胞,神经细胞培养液调节细胞终浓度并进行培养,形成克隆后,传代。将传至第1代培养细胞加入含10%胎牛血清的DMEM /F12 培养基诱导其分化。形态学方法观察细胞的生长状态,利用鼠抗Nestin抗体、鼠抗GFAP抗体、鼠抗MAP-2抗体进行分化的神经干细胞免疫组织化学鉴定。 结果：新生大鼠脊髓源性神经干细胞可在体外培养条件下贴壁生长,在血清的作用下可分化为具有典型神经细胞形态、表达特异性组织蛋白Nestin、GFAP、MAP-2的神经细胞。结论： 大鼠脊髓内可分离出脊髓源性神经干细胞,呈贴壁增殖状态,并有分化能力。     

胰岛β-细胞中端粒酶活性、端粒长度与血中胰岛素含量变化的研究

目的探讨1型糖尿病(TIDM)大鼠胰岛β-细胞中端粒酶活性、端粒长度变化及与胰岛素(Ins)分泌的关系,研究三者在TIDM发病机制中的作用。方法TIDM大鼠模型组与正常大鼠对照组各60只,同时分离提取胰岛β-细胞,采用改良TRAP法检测β-细胞端粒酶活性;用southern blot法检测端粒长度;分别与对照组进行对比分析。测定TIDM组血清Ins含量并与端粒长度作相关分析。结果TIDM组胰岛β-细胞端粒酶活性显著高于正常对照组(P<0.01),而端粒长度显著低于正常对照组(P<0.01);端粒长度与Ins含量变化具有高度正相关(r=0.927,P<0.01)。结论TIDM大鼠胰岛β-细胞端粒酶的活性、端粒长度与胰岛β-细胞合成、分泌Ins密切相关,提示端粒酶的活性与端粒长度可能在TIDM的发病机制中具有重要作用。     

新生大鼠神经干细胞的体外分离和培养

目的改进大鼠神经干细胞的分离和培养方法。方法用出生1～3d的新生大鼠，取脑用刀片剁碎和吸管吹打的机械分离法代替酶消化法。用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞、神经元和星形胶质细胞。结果用机械分离法从新生大鼠脑组织分离神经干细胞的获得率较高，并培养出较多的神经球，还能分化成神经元和星形胶质细胞。结论该方法简便，能得到较多的神经球，细胞获得率也较高。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及鉴定研究

目的建立胎鼠神经干细胞体外培养方法并鉴定神经干细胞,观察神经干细胞生长特点。方法采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的无血清培养基对大鼠胚胎间脑组织细胞悬液进行培养。通过检测神经干细胞的特异性抗原、神经干细胞的自我增殖能力和分化能力来鉴定神经干细胞。结果分离培养出了大量具有不断增殖的能力、表达神经巢蛋白的神经干细胞,并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞,并能稳定传代20代以上。结论无血清培养基分离培养的胎鼠脑组织神经干细胞具有自我更新和增殖能力,巢蛋白细胞免疫荧光鉴定为神经干细胞,成功建立了大鼠神经干细胞的分离培养方法。     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法建立及鉴定

目的：纯化和鉴定体外培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞.方法：取1~3天新生大鼠大脑皮层细胞进行体外培养,通过差速贴壁和传代去除成纤维细胞和神经元等,采用免疫组化法检测星形胶质细胞特异性蛋白—胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）鉴定星形胶质细胞.结果：培养的细胞具有典型的星形胶质细胞形态且生长旺盛,第3代95%以上为星形胶质细胞,特异性抗原GFAP表达阳性.结论：该方法操作简单,可靠,是一种有效的新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法.     

体外培养的人胚胎脑皮层神经干细胞的生长特性

目的从胎龄10～12周的人工流产胚胎脑皮层分离、培养神经干细胞后观察其生长特性.方法分别分离、鉴定孕10～12周人工流产的人胚胎脑皮层及孕16d Wistar大鼠脑皮层来源的神经干细胞,并在体外培养增殖.通过普通及电子显微镜观察、生长情况测定等方面的比较来观察其生长特性.结果不同来源的神经干细胞均保持着未分化状态,能够自我更新以及具有多向分化潜能.但来源于人胚胎脑皮层的神经干细胞生长速度明显较慢,且其生长需多种细胞因子的联合刺激.结论人胚胎脑皮层神经干细胞体外培养存在生长速度慢,分裂相所占比例低,群体倍增时间长以及其生长需多种细胞因子的联合刺激等问题.     

体外少突胶质细胞培养的新方法

目的 探讨小鼠鼠婴大脑皮质体外少突胶质细胞培养的新方法。方法 取C57/BL6新生小鼠P0~P2（出生后0~2天）的大脑皮质,accummax室温消化10min,然后用含10%FBS的DMEM/F-12高糖培养基体外培养,培养至第7天时,运用巴氏管吹打,从混合培养的细胞中分离纯化少突胶质前体细胞,然后加入促分化培养基促使少突胶质前体细胞分化发育成熟,行细胞免疫荧光进行鉴定。结果 少突胶质前体细胞纯度较高,达到93.3%左右。加入促分化培养基后,少突胶质前体细胞可快速分化发育成熟。结论 该体外少突胶质细胞培养方法较简单,细胞纯度及产量高,对临床脱髓鞘疾病的研究具有很大的应用价值。     

系统性红斑狼疮患者外周血CD4~+和CD8~+细胞端粒长度及端粒酶活性的研究

目的:探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血CD 4+、CD 8+和CD 19+细胞端粒长度和端粒酶活性变化及其在发病中的作用。方法:用免疫磁珠法,从外周血单个核细胞分离CD 4+、CD 8+和CD 19+淋巴细胞,提取细胞蛋白后,用PCR为基础的端粒酶测定法(T e lom eric repeats am p lification protoco l,TRAP)测定端粒酶活性;Sou thernB lot测定细胞端粒长度。结果:SLE患者CD 4+、CD 8+和CD 19+细胞端粒酶活性均高于正常对照,但只有CD 19+细胞端粒酶活性与正常对照相比差异有显著性(P<0.05)。SLE患者CD 4+和CD 8+淋巴细胞的端粒长度均较正常对照明显缩短,CD 19+淋巴细胞的端粒长度无明显缩短。结论:SLE患者CD 19+细胞端粒酶活性显著增高,维持了细胞端粒长度;而CD 4+和CD 8+细胞端粒酶活性可能不足以维持由于细胞分裂所导致的细胞端粒缩短。     

小鼠神经干细胞的分离培养

目的 探讨小鼠神经干细胞的体外分离培养方法。方法 采用贴壁培养法,从成体小鼠大脑皮层分离并体外培养成体小鼠大脑皮层细胞,制成细胞悬液后将其置入DMEN/F12(1:1)液(包括15％FCS,bFGF20ng/ml,青霉素100u/ml和链霉素100u/ml)培养,获得细胞克隆。应用免疫组织化学技术检测克隆细胞巢蛋白(Nestin)的表达。结果原代及传代培养的细胞均可持续分裂增殖形成细胞克隆;克隆细胞表达巢蛋白(Nestin)。结论 分离的细胞在体外具有很强的增殖能力和自我更新能力,表达Nestin的为中枢神经系统的干细胞。     

组织块法重复培养牙周膜干细胞的生物学功能研究

目的 对同一块牙周膜组织重复培养获得的原代牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）的生物学特性和功能进行比较，评价重复培养得到的PDLSC能否用于实验研究和临床治疗。方法 收集正畸治疗拔除的前磨牙，组织块法进行PDLSC原代培养。首次传代后收集剩余的牙周膜组织重复进行组织块法细胞培养，多次培养获得原代PDLSC。每次培养的原代PDLSC进行扩增培养，选取第1、3、5次培养获得的PDLSC分为A、B、C组。分别绘制细胞增殖曲线，STRO-1表面标记物表达的检测鉴定，细胞周期分布检测和观察成骨诱导，测定各组PDLSC端粒长度和端粒酶表达水平。结果 三组细胞的STRO-1表达均呈阳性；生长趋势和扩增数量相似；A、B两组细胞周期分布无显著差异（P>0.05），C组与A、B组比较细胞周期分布差异显著（P<0.05）；地塞米松诱导三组PDLSC成骨，21d时均有茜素红染色阳性的钙化结节；A、B两组PDLSC端粒长度、端粒酶表达水平均无显著差异（P>0.05），C组PDLSC端粒长度显著长于A、B组（P<0.05），端粒酶表达水平显著高于A、B组（P<0.05）。结论 通过同一块牙周膜组织培养得到的PDLSC生物学功能相同，但在细胞安全性上是否能够用于实验研究和临床治疗有待进一步的探讨。     

3～18周胎龄人胚胎神经干细胞的分离、培养及增殖

目的:在分离、纯化、培养3～18周胎龄人胚胎神经干细胞(NSC)的基础上,进一步研究3～18周胎龄NSC的增殖特点.方法:从3～18周龄流产人胚胎的大脑皮质和神经管组织中分离NSC,实验分组:A组(3～6周龄),B组(7～11周龄),C组(12～18周);培养、纯化NSC;以单细胞克隆实验及免疫细胞化学对其进行生物学特性鉴定;计数神经球数目、直径检测其生长情况.结果:从3～6周流产人胚胎大脑皮层和神经管组织中以及7～18周的人胚胎大脑皮层中均分离获得了可在体外生存增殖的NSC,经鉴定,该类细胞在生长方式、形态结构、功能特征、表面标志等方面,均具有典型NSC的生物学特征;A组人胚胎NSC的神经球数目和直径均大于B、C组(P＜0.05).结论:3～18周胎龄组NSC的增殖能力均随胎龄的增加而逐步减弱.     

小鼠神经干细胞中一氧化氮合酶的表达

目的：体外分离、培养和鉴定胎小鼠神经干细胞（NSC）并检测其一氧化氮合酶（NOS）的表达，为进一步阐明NOS在NSC中的作用奠定基础。方法：利用含EGF的条件培养基，从胚胎小鼠大脑皮层中分离并体外培养胎小鼠NSC，在含胎牛血清的培养基中诱导其分化；用充纯氮气的方法造成细胞缺氧，观察缺氧对NOS的诱导作用；免疫组织化学方法检测细胞中nestin,nNOS,eNOS和iNOS的表达。结果：原代培养的细胞具有连续增殖并形成克隆的能力，在含血清的培养基中能分化为神经元及神经胶质细胞样细胞；免疫组化nestin,nNOS和eNOS在一般培养条件下呈阳性表达，而iNOS呈阴性表达，经充氮气缺氧诱导后，iNOS呈阳性表达。结论：成功分离并培养小鼠NSC；发现不同亚型的NOS在NSC不同培养条件下有不同的表达。     

SD大鼠脑皮质星形胶质细胞的纯化

目的 改进实验步骤获取符合体外研究使用的富含星形胶质细胞的培养物.方法无菌条件下取新生1天内的SD乳鼠的脑皮质,先机械吹打,然后以差速贴壁、摇床振荡以及传代的方法去处其他细胞,SABC法和免疫荧光双标方法GFAP鉴定纯度.结果成功获取星形胶质细胞比例>95%的培养物.结论上述方法可靠地获取了符合体外研究要求的培养物,免疫荧光双标方法较直观.