部分抗肌萎缩蛋白基因酵母人工染色体物理图谱

酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosome,YAC)是近年发展起来的大容量克隆载体,可容纳数十万乃至上百万碱基对的DNA大片段,对克隆巨大基因和绘制大尺度物理图谱具有显著的优越性。抗肌萎缩蛋白基因是迄今发现的人类最大基因,长约、2300kb,该基因的异常,导致其蛋白产物一抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)异常而引起假肥大型肌营养不     

快速分离YAC末端的方法

近年来发展的酵母人工染色体Yeast Artifical Chromosome(YAC)可以克隆长至几百kb的DNA片段.目前世界上已有一些YAC文库,可以用PCR方法或传统的原位杂交法来筛选高密度克隆膜以得到单一YAC克隆,建立染色体特定区域的YAC重叠群,为研究此区域的DNA结构与功能及克隆其基因提供基础.     

部分抗肌萎缩蛋白基因酵母人工染色体物理图谱

酵母人工染色体《Yeast Attificial Chromosome，Hc)是近年发展起来的大容量克隆载体，可容纳数十万乃至上百万碱基对的DNA大片段，对克隆巨大基因和绘制大尺度物理图谱具有显的优越性。抗肌萎缩蛋白基因是迄今发现的人类最大基因，长约：2300kb．该基因的异常，     

Alu—PCR联合荧光原位杂交技术鉴定bcr基因相关YAC克隆

目的：制备慢性髓细胞性白血病（CML)bcr基因重排的DNA探针。方法：应用Alu-PCR和荧光原位杂交（FISH）技术，对3个酵母人工染色体（YAC）候选克隆进行鉴定，制备DNA探针，并经正常人外周血淋巴细胞和慢性髓细胞性白血病患骨髓细胞筛选。结果：确定了YAC765E3为非嵌合体，定位于染色体22q11bcr基因区域，而且可在Ph染色体阳性细胞中易位至3q34。探针特异性杂交效率达95%。结论：FISH技术是染色体、染色体畸变鉴定和染色体上特殊序列定位的重要检测方法。联合应用Alu-PCR技术特异性扩增载体YAC中人类基因组来源的DNA制备探针，为慢性髓细胞白血病的诊断和监测微小残留病提供了一个新的手段。     

X染色体长臂末端28个新序列标签位点的分离

用脉冲场凝胶电泳分离回收覆盖脆性X位点的酵母人工染色体YAC209G4中475kb片段，经MboⅠ完全酶解为平均长度400bp的片段，与pBSⅡKS质粒载体重组，共得到3500个重组作，筛选出60个含单拷贝序列插入片段的克隆。经序列测定，并与基因数据库分析比较，其中28个序列被基因数据库接受为新的序列标签位点，GenBank收录号为U26560-U26587。根据其中3个新序列标签的核普酸顺序设计PCR引物，在人基因组DNA中扩增出相应的特异片段。     

不同条件下人乳白蛋白YAC的高效定点打靶修饰

目的:对人乳白蛋白酵母人工染色体(HLA-YAC)进行定点改造,以便进一步利用该载体作与基因表达调控相关的研究.方法:借助kar1突变使YPH925菌株与异交配型菌株交配时丧失核融合的能力,把HLA-YAC由酵母AB1380转移到his3缺陷的YPH925菌株.分别以HIS3(对YPH925菌株)和G418R(对YPH925和AB1 380两种菌株)为选择标记,用含HLA-YAC的酵母基因组为模板,PCR克隆人乳白蛋白(HLA)基因的5'和3'端非翻译区各684 bp和940 bp为同源臂,构建打靶载体,线性化的打靶载体经电转化或醋酸锂转化转入酵母内,以菌落PCR为鉴定方法,辅以测序验证.结果:HLA-YAC在目的位置完成了定点打靶修饰,G418R的筛选效率高于HIS3,醋酸锂转化方法的打靶效率稍高于电转化.结论:对YAC的成功修饰为在动物体内的表达及调控研究打下了基础.     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA克隆及其乳腺特异性表达载体的构建

目的：克隆组织型纤溶酶原激活剂(tissue—type plasminogen activator，tPA)基因及构建其乳腺特异性表达载体。方法：以PCR技术克隆2．1kb tPA cDNA片段；应用体外连接技术，连接乳腺特异性表达载体pWA和2.1 kb tPA cDNA片段；转化连接产物，以内切酶酶切、琼脂糖电泳及插入片段序列分析鉴定阳性克隆。结果：琼脂糖电泳显示，2．1 kb tPA cDNA片段克隆成功；内切酶酶切片段与预期片段长度一致；插入片段序列与文献报道一致。结论：tPA基因克隆及其乳腺特异性表达载体构建成功。     

BAC介导的含97kb人β类珠蛋白基因簇转基因鼠模型的建立

目的 利用RecA蛋白介导的同源重组的方法,修饰含全长人β珠蛋白基因簇及一段IL—11受体α链基因的IAC(细菌人工染色体)克隆,建立只包括全长人β珠蛋白基因簇的转基因鼠模型。方法 分别在待删除片段上、下游用PCR合成500bp左右的两段同源序列,共同克隆入构建载体pBV的HindⅢ和XbaⅠ位点之间,然后以SolⅠ酶切后将此1kb的插入片段再克隆入温度敏感型穿梭裁体pSV—RecA中,转化含B5—BAC DNA的感受态大肠杆菌DHl0B,经氯霉素正筛选和镰孢菌酸(FA)负筛选,获得发生两次同源重组后只含修饰后的BAC DNA而穿梭载体已丢失的菌株。经脉冲场凝放电泳鉴定后,纯化修饰的BAC DNA,经显微注射受精卵制备转基因鼠,分析其中的人β珠蛋白基因簇整合和表达状况。结果 利用RecA蛋白介导的同源重组的方法,获得了IL—11受体α链基因被定位删除的含完整人β珠蛋白基因簇的BAC克隆(命名为βD—BAC),建立了3株独立的转基因鼠株系。结论 新的BAC介导的转基因鼠中的人β珠蛋白基因簇显示正确的表达模式和水平。     

一种改进的从细菌人工染色体中亚克隆DNA片段的方法

目的 运用基于PCR的重叠区延伸法构建缺口修复载体,通过同源重组的方式从细菌人工染色体(BACs)中亚克隆DNA片段.方法 用基于PCR的重叠区延伸法将线性化质粒骨架分子、较长的上游和下游同源臂(200～500bp)串联起来构建成缺口修复载体.将此载体电击转入含有BAC的EL350菌中,经热激诱导Red重组酶瞬时表达,使缺口修复载体与BAC发生同源重组.结果 重叠区延伸法构建的两个缺口修复载体分别成功地从BAC中亚克隆得到目的DNA片断.结论 该方法省去了酶切、连接、转化等繁琐的克隆步骤,大大缩短了实验周期,提高了实验效率,为基因组BAC测序过程中的缺口封闭及复杂的打靶载体构建提供了较为便捷的方法.     

日本血吸虫细菌人工染色体文库的初步构建(英文)

初步构建了一个日本血吸虫细菌人工染色体（BAC）文库,该文库已包含1000多个含基因组DNA插入片段的重组pEcBAC1克隆,平均插入片段为120kb。BAC文库将为日本血吸虫基因的结构与功能研究提供新的资源。     

河豚鱼基因组格式化粘粒文库的构建

目的 构建河豚鱼基因组文库,为人类基因组的研究提供资料。方法 以红鳍东方豚的精子ＤＮＡ为材料,采用含有”外显子捕获”元件的粘粒（ｓＣＯＧＨ２）作为载体,构建肖豚鱼的基因组粘粒文库。结果 该文库共有５７６００个克隆,分别被保存在６００块９６孔细胞培养板中,插入片段的大小平均为３５ｋｂ,相当于５．０个库容量,即从本文库中筛选到河豚鱼基因组任一单拷贝序列的机率为９９．２％。     

抗肌萎缩蛋白基因YAC克隆的筛选和鉴定

应用完整的ＤＭＤｃＤＮＡ探针，从人ＹＡＣ基因文库中筛选并Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定５个ＹＡＣ－ＤＭＤ克隆，其分子量分别为９００ｋｂ，８００ｋｂ，６５０ｋｂ，４５０ｋｂ和４５０ｋｂ。这些克隆是抗肌萎缩蛋白基因特定区域ＤＮＡ用之不竭的源泉，为抗肌萎缩蛋白基因结构和发病机制的研究创造了条件。     

HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建pAdeno-EGFP-HIF-1α 重组腺病毒载体,探讨其在脊髓损伤中的作用。 方法 采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR） 法扩增目的基因HIF-1α 并亚克隆到含有报告基因EGFP 的pShuttle-CMV-EGFP 穿梭载体中,得到pShuttle-EGFP-HIF-1α 重组穿梭质粒。将已构建的重组穿梭质粒转移至pAdeno 骨架载体上,获得pAdeno-EGFP-HIF-1α 重组腺病毒质粒,继而在H293 细胞中扩增,纯化后进行PCR 鉴定并测定病毒滴度。 结果 pShuttle-EGFPHIF-1 α 经KpnI/BamHI 双酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组在2.5 kb 和5.1 kb 处出现两条带,而阴性克隆组只有5.1 kb 处一条带,证明pShuttle-EGFP-HIF-1α 重组穿梭质粒构建成功;pShuttle-EGFP-HIF-1α 重组穿梭质粒与pAdeno 载体重组后,经XhoI 单酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组出现14.5 kb,11.7 kb,2.66 kb,2.6 kb,2.48 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb 八条带,而阴性克隆的腺病毒空载组有14 kb,11.8 kb,4.0 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb 六条带,证明重组pAdeno-EGFP-HIF1α 腺病毒质粒构建成功;pAdeno-EGFP-HIF-1α 重组腺病毒成功包装纯化后经PCR 鉴定,实验组和阳性对照组中均扩增到2.5 kb 片段,证明目的病毒中成功整合了HIF-1α 基因;TCID50 法测定纯化后的病毒滴度为2×10 10 PUF/ml 。 结论 成功构建了HIF-1α 和EGFP 双基因共表达重组腺病毒载体,为进一步研究其在脊髓损伤中的作用奠定了基础。     

河豚鱼基因组细菌人工染色体文库的构建

目的 研究模式生物－－河豚鱼的基因组以及利用河豚鱼基因组“小而全”的特点研究人类基因组,方法 以红鳍东方豚的精子ＤＮＡ为材料,以ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１为载体文库的构建河豚鱼基因组的细菌人工染色体格式化文库。结果 该文库包含２３０４０个克隆,分别保存在２４０块９６孔细胞培养板中,经对１００个随机抽样的克隆分析表明,郫入片段平均大小为１００ｋｂ,因此,该文库相当于河豚鱼单倍 基因组的６倍,好６个库容量,     

Construction and Significance of Directional Expression cDNA Library from Human NB4 Cells

Acutepromyeloidleukemia (APL)characterizedbythetranslocationt(15 ;17)isuniquelysensitivetothedifferentiation inducingeffectsofall trans retinoicacid (ATRA) .ATRAinducescompleteclinicalre missionsinmostofthepatientswithAPL .However ,chronicdailyoraladminis…     

Raji 细胞基因组文库的构建与筛选

目的:构建Raji细胞基因组文库,用EBV DNA探针对文库进行筛选.方法:Raji细胞基因组DNA经Bam HI酶切消化后,低熔点琼脂糖回收9～23 kb的酶切DNA片段,通过匹配黏性末端与磷酸化的Lambda DASH Ⅱ Bam HI酶切载体臂连接,在体外经包装系统包装成活的重组噬菌体,测定原始文库与扩增文库的滴度,用同位素标记的EBV DNA探针对Raji细胞基因组文库进行筛选.结果:Raji细胞原始文库与扩增文库的滴度分别为1.8×105和2.8×108 pfu/mL.文库经筛选获得4个阳性克隆,随机挑取1个阳性克隆稀释后铺平板作进一步杂交鉴定,发现所有噬菌斑均有杂交信号,证明该克隆确为阳性克隆.抽提该阳性克隆DNA,进行BarnHI酶切鉴定,证实插入片段的长度为8.5 kb.经测序、BLAST序列比对,结果显示插入片段一侧为EBV Bam HI W片段,另一侧与人类15号染色体RP11-665A22克隆高度同源.结论:Raji细胞基因组文库的成功构建,为进一步克隆包含EBV整合位点的细胞基因组序列、探讨EBV整合参与肿瘤发生发展的分子机制奠定了基础.