逆转录—半套式聚合酶链反应检测汉坦病毒RNA及其临床初步应用

目的：建立可用于汉坦病毒检测的ＲＴ－ＰＣＲ方法，并对其临床应用进行初步研究，方法：比较７６－１１８株和ＳＲ－１１株Ｓ基因序列，选择其保守区设计半套式引物，通过病毒培养上清及患者血清的扩增检测进行ＰＣＲ方法的敏感性，特异性及临床应用研究。结果所建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法可检出１．２５ＰＦＵ的病毒量；对照组（正常细胞培养上清和正常人血清）经扩增检测为阴性，８６份级ＩＦＡ检测抗ＨＶ－ＩｇＭ阳性的肾综合征出血     

荧光定量PCR技术在检测HCV—RNA中的应用

目的 评价荧光定量ＰＣＲ技术测定ＨＣＶ－ＲＮＡ水平的价值,探讨ＰＢＭＣ中检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的意义。方法 采用荧光定量ＫＲ及ＲＴ－ＰＣＲ技术同时检测８７例血液透析患者的血清和淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果血清、淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ的荧光定量ＰＣＲ检出率（４９．４％、６９．０％）,分别高于相应标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ阳性率（３３．３％、３５．６％）（Ｐ ＜０．０５）。血清、淋巴细胞中同时检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的一致率,荧光定量ＰＣＲ法（３１．０％）显著高于ＲＴ－ＰＣＲ定性法（６．９％）（Ｐ＜０．００１）． 荧光定量ＰＣＲ法,淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ检出率高于血清（Ｐ＜０．０１）。结论 与 ＲＴ－ＰＣＲ相比,荧光定量ＰＣＲ技术检测 ＨＣＶ－ＲＮＡ敏感性较高,对ＰＢＭＣ内ＨＣＶ－ＲＮＡ检测有利于提高ＨＣＶ检测的阳性率。     

肠道病毒RNA RT-PCR检测在病毒性心肌炎诊断中的应用

目的 探讨ＲＴ－ＰＣＲ方法在肠道病毒感染诊断中的应用。方法 根据肠道病毒５’非编码区和ＶＰ２基因区共同序列设计一对引物,建立了检测各型肠道病毒的ＲＴ－ＰＣＲ方法。用该方法扩增已知病毒,并用于临床标本检测。结果 所检测１１种已知病毒中,只对肠道病毒的９个型别扩增,１８６例心肌炎患者血清标本中,５２例（２７．９５％）阳性,１５例脑炎患者脑脊液标本中,４例（２６．６７％）,阳性。结论 该ＲＴ－ＰＣＲ方法     

直接分型检测单纯疱疹病毒PCR方法的研究

作依据单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）ＤＮＡ聚合酶基因的核苷酸序列，设计三个引物，一个上游ＨＳＶ－１／ＨＳＶ－２型共同性引物，一个下游ＨＳＶ－１型特异性引物和一个下游ＨＳＶ－２型特异性引物，建立分型检测ＰＣＲ的方法，ＨＳＶ－１的扩增产物是４７７ｂｐＨＳＶ－２扩增产物为３９９ｂｐ，扩增产物的克隆及序列分析表明，该方法特异，用此方法对ＢＡＬＢ／ｃ幼鼠中枢神经系统ＨＳＶ感染的脑标本进行了检测，进一步证实直接分型     

肾综合征出血热患者血清样本中汉坦病毒RNA检测及其临床意义

目的 观察病毒血症在病程各期的变化。方法 根据汉坦病毒血清Ⅰ型７６－１１８株及血清Ⅱ型８０－３９株Ｍ基因Ｇ１区设计两对公有引物及一条探针,应用ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ方法对５７例９６份肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）患者血清中ＨＶ－ＲＮＡ检测,所有ＰＣＲ产物用ＤＯＴ－Ｂｌｏｔ证实。结果 ９６份样本中６８份阳性,阳性率７８．８％;在病程第１、２、３周,ＨＶ－ＲＮＡ检测率分别为９４．７％、４７．５％、２５％     

应用RT-PCR快速检测病毒性心肌炎患者血清中CVB-RNA

目的：探讨ＲＴ－ＰＣＲ在病毒性心肌炎中的诊断价值。方法：选用柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＶＢ）保守区５′－非编码区的组特异性引物,对４２例临床拟诊为病毒性心肌炎的患者血清行ＲＴ－ＰＣＲ,以检测ＣＶＢ－ＲＮＡ,同时采用间接ＥＬＩＳＡ检测血清中ＣＶＢ－ＩｇＭ。结果：心肌炎患者血清中ＣＶＢ－ＲＮＡ的检出率为６６７％（２８／４２）,而ＩｇＭ的检出率为５２４％（２２／４２）。结论：ＲＴ－ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ都是特异、敏感的诊断方法,并且ＲＴ－ＰＣＲ比ＥＬＩＳＡ敏感（Ｐ＜００５）     

正常人肝细胞中HBV-PHSA受体基因表达的研究

作者根据乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ａｄｒ型ＰｒｅＳ２基因序列设计合成一对聚合酶链反应（ＰＣＲ）引物，经特异性试验后，用于扩增正常人肝细胞中多聚人白蛋白受体（ＰＨＳＡｒ）基因转录产物。结果：ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＮＡ－ＰＣＲ扩增结果均为阳性，而相应骨骼肌总ＲＮＡ扩增结果呈阴性，提示乙型肝炎病毒ＰｒｅＳ２区与ＰＨＳＡｒ基因外显子序列具有一定程度的同源性；同时表明ＰＨＳＡｒ基因在肝组织中处于表达状态，而对ＨＢＶ不敏感的组织如骨骼肌则不表达。该研究结果与其它ＨＢＶ－ＰＨＳＡｒ研究相比，进一步证实了ＰＨＳＡｒ在ＨＢＶ感染肝细胞的作用。     

RT-PCR结合地高辛标记定量检测猴免疫缺陷病毒RNA

从感染猴免疫缺陷病毒（ＳＩＶ）的恒河猴血浆和培养细胞株中分别纯化病毒ＲＮＡ，经逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增ＳＩＶｇａｇ基因特异的ＤＮＡ片段。将ＲＴ－ＰＣＲ产物用地高辛标记，检测灵敏度比凝胶电泳和斑点杂交提高１００倍。用已知拷贝数的ＲＮＡ作为定量标准，可估计待测样本中ＳＩＶＲＮＡ的拷贝数。     

正常人肝细胞中HBV—PHSA受体基因表达的研究

作者根据乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ａｄｒ型ＰｒｄＳ２基因序列设计合成一对聚合酶链反应（ＰＣＲ）引物，经特异性试验后，用于扩增正常人肝细胞中多聚人白蛋白受体（ＰＨＳＡｒ）基因转录产物。结果：ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＮＡ－ＰＣＲ扩增结果均为阳性，而相应骨骼肌总ＲＮＡ扩增结果呈阴性，提示乙型肝炎病毒ＰｒｅＳ２区与ＰＨＳＡｒ基因外显子序列具有一定程度的同源性；同时表明ＰＨＳＡｒ基因在肝组织中处于表达状态，而对ＨＢＶ不     

一株庚型肝炎病毒NS3区和NS5区部分基因序列的分析

用ＲＴ－ＰＣＲ的方法从非甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病人血清中检测到一株庚型肝炎病毒（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ）。其中扩增ＮＳ３区基因采用５６例循环周期减温ＰＣＲ方法；扩增ＮＳ５区基因采用３５个循环周期的正常ＰＣＲ方法。并对其ＰＣＲ产物进行了克隆测序。在ＮＳ３区，样品与ＧＢＶ－Ｃ和ＨＧＶ的核苷酸序列同源性分别为８４．２％和８９．９％；而在ＮＳ５区样品与ＨＢＶ－Ｖ和ＨＧＶ的核苷酸同源性分别为９４．９％和９８．     

肾综合征出血热患者血清样本中汉坦病毒RNA检测及其临床意义

目的观察病毒血症在病程各期的变化。方法根据汉坦病毒血清Ⅰ型76-118株及血清Ⅱ型80-39株M基因G1区设计两对公有引物及一条探针,应用RT-nestedPCR方法对57例96份肾综合征出血热(HFRS)患者血清中HV-RNA检测,所有PCR产物用DOT-Blot证实。结果96份样本中68份阳性,阳性率70.8%;在病程第1、2、3周,HV-RNA检测率分别为94.7%、47.5%、25%,P<0.05;重型病人持续2周HV?RNA阳性检测率100%,而轻、中型分别为12.5%及42.8%,P<0.05。结论在HFRS病程中,病毒血症是一个急性过程,与发热期相平行,病毒血症持续时间与病情轻重密切相关。     

肾综合征出血热汉坦病毒分型及序列特征的研究

目的 分析黑龙江省肾综合征出血热（HFRS）患者携带汉坦病毒的基因型别及序列特征.方法 采集临床诊断为肾综合征出血热病人的全血60例,其中通过金标法检测出血热特异性抗体阳性40例、阴性20例,血凝块提取汉坦病毒RNA,应用RT-Nest-PCR及核苷酸序列测定分型技术对黑龙江地区的汉坦病毒进行分型研究,设计汉坦病毒M片段通用引物（MOF,MOR）及HTNV和SEOV的M片段特异性引物（HTNMF、HTNMR,SEOMF、SEOMR）,应用Nest-PCR进行扩增,回收阳性扩增产物进行基因序列测定,将所测基因序列与国内外HV病毒株序列进行核苷酸同源性分析,构建M基因种系进化树.结果 出血热特异性抗体阳性的病例中扩增出HTN型19份,抗体阴性的病例中扩增出HTN型1份、SEO型l份.总体来看黑龙江省流行的汉坦病毒毒株主要为HTN型和SEO型,以HTN型为主.经核苷酸及氨基酸同源性和种系进化分析表明其黑龙江地区的病毒株同源性较高,其中HTN型与76 ～ 118株同源性较高,SEO型与Z37株的同源性较高.结论 黑龙江省的HV感染病例多为HTN型,与其他GenBank中的各地标准株的核苷酸及推导的氨基酸序列均有一定差异,在系统进化树中分析HTN型与76-118株较为接近.SEO型与国内Z37较为接近.结合临床症状发现其临床症状较为相似的在系统进化发生树中较为接近.     

云南省祥云县肾综合征出血热流行特征分析

目的了解云南省祥云县肾综合征出血热（HFRS）流行特征和汉坦病毒（HV）宿主动物分布特点。方法收集祥云县2003～2012年HFRS疫情资料并采集病人和健康人血清检测HV抗体。在居民区和野外捕鼠,鼠肺组织标本用直接免疫荧光法检测HV抗原,用RT—PCR法检测Hv核酸。结果祥云县2003～2012年共报告HFRS病例100例,平均年发病率2．18／10万（0．88／10万-4．64／10万）。主要发病地区为云南驿镇、普棚镇和下庄镇。全年均有发病,以男性青壮年农民为主。居民区以褐家鼠和黄胸鼠为优势种,野外以中华姬鼠为优势种。鼠间HV总感染率为6．22％,其中褐家鼠、黄胸鼠和中华姬鼠HV感染率分别为4．38％（14／320）、5．33％（9／169）和13．25％（11／83）,其它阳性鼠种为灰麝驹、臭购鼯、小家鼠、大绒鼠。从8份阳性褐家鼠肺标本中检测到汉城型病毒核酸阳性3份,汉滩型核酸阳性1份。结论祥云县不仅存在着以褐家鼠为主要传染源的HFRS家鼠型疫源地,也存在野鼠型疫源地。近几年发病率上升与较高的鼠密度和鼠间HV感染率有关。     

河北省肾综合征出血热主要流行区鼠携带汉坦病毒基因序列分析

目的了解河北省肾综合征出血热（haemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）主要流行区汉坦病毒主要流行株的基因型及其变异情况。方法收集2012年河北省东北部地区捕获的啮齿动物,均为褐家鼠,取鼠肺组织,用间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测,抗原阳性的标本进行汉坦病毒（Hantavirus,HV）M部分片段扩增并测序,与该地区以往序列及其他部分标准株进行系统发生树及同源性分析。结果收集164份鼠肺标本,经IFA检测26份阳性,挑选9份有代表意义的标本进行逆转录巢式PCR扩增,9份鼠肺标本经RT-PCR检测均为汉城（SEO）型HV,病毒间变异不大,同源性达95.2%~100.0%。以往测序株与新测序株比较同源性为99.0%~100.0%。系统发生树分析结果表明9份标本均为SEO型HV,且为S3亚型。结论河北省HFRS主要流行区HV以SEO型为主,亚型为S3亚型。同型HV基因相对保守,具有区域稳定性特征。     

聚合酶链反应检测汉坦病毒感染的实验研究

目的 早期诊断汉坦病毒感染。方法 根据国际标准株（７６－１１８,３９）Ｍ基因Ｇ１区设计两对公有引物和一条探针,按异硫酸氰胍－酚一步法提取汉坦病毒ＲＮＡ,采用ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ检测病毒细胞培养上清原液及稀释液、１６份对照组血清、４０份ＨＦＲＳ急性期（１～５天）血清标本中的汉坦病毒ＲＡＮ,所有扩增产物采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ或Ｄｏｔ ｂｌｏｔ证实其特异性。结果 汉坦病毒细胞培养液和４０份     

革螨和恙螨体内汉坦病毒增殖与定位的分子生物学研究

目的 研究汉坦病毒在革螨、恙螨体内增殖、定位及与传播肾综合征出血热（HFRS）的关系。方法 采用聚合酶链反应（PCR）检测螨体内HV－RNA和基因分型;Vero-E6细胞培养检测TCID50／ml滴度;原位RT－PCR分子杂交法检测HV－RNA在螨体内分布和定位。结果 用PCR技术从革螨、恙螨体内检测到HV－RNA;取革螨、恙螨幼虫、若虫定期做HV TCID50／ml滴度,证明HV在革螨、恙螨体内可经期传播,并有增殖现象;用原位RT－PCR分子杂交法在革螨、恙螨的中肠上皮细胞和卵巢细胞内检测到HV－RNA阳性颗粒;用PCR分型证明从同一疫区鼠、螨、病人所分离的HV的基因型一致。结论 研究结果为革螨、恙螨作为HFRS的媒介提供了分子水平的证据,对HFRS的流行病学和预防具有重要的理论意义和实用价值。     

深圳市肾综合征出血热自然疫源地调查

目的了解深圳市肾综合征出血热(HFRS)疫源地的现状,为制定防治策略提供依据。方法在我市所辖4个区设25个点采用笼日法布笼捕鼠,调查鼠类种群构成;间接免疫荧光法检验鼠血清汉坦病毒(HV)抗体;直接免疫荧光法检验鼠肺抗原。结果共捕获鼠形动物472只,捕获率为8.25%,隶属于2目2科3属4种,4种鼠形动物中,除板齿鼠外,其余3种均发现携带HV或感染,带毒鼠全部为成鼠。褐家鼠占捕获鼠形动物的87.50%,为本市优势鼠种,其HV感染率和带毒率分别为18.20%和10.97%,臭鼩鼱占4.45%,HV感染率和带毒率均为11.76%,黄胸鼠占8.05%,HV感染率和带毒率均为2.94%。鼠血清平均HV感染率为16.78%,鼠肺平均带毒率为10.38%,平均带病毒指数为0.09。福田区鼠HV感染率、带毒率最高,分别为32.41%和20.69%,带毒指数达0.14。不同生境中旧居民区、菜市场及餐饮类场所鼠带毒指数较高,分别为0.13、0.11、0.11。结论深圳市广泛存在家鼠型HFRS疫源地,呈增强趋势,主要宿主动物为褐家鼠、臭鼩鼱和黄胸鼠。     

河北省2012年肾综合征出血热监测分析

目的对河北省2012年肾综合征出血热(HFRS)监测结果进行分析,掌握疫情发展动态,为防治HFRS提供参考依据。方法收集全省HFRS疫情资料采用描述性流行病学方法进行统计分析;夹夜法捕鼠,计算鼠密度及鼠种构成,对鼠肺进行汉坦病毒抗原检测及病毒基因分型。结果 2012年河北省共报告病例687例,发病率为0.95/10万,死亡2例。病例分布在全省85个县(市、区),占总数的48.30%,主要集中于秦皇岛市和唐山市。发病明显呈春季和秋冬季两个季节高峰,春峰高于秋冬季峰,占发病总数的48.90%。15~70岁人群为高发人群,占发病总数的88.50%,大年龄人群发病有增加趋势;病例男女比例为2.4:1;农民发病占79.48%。居民区平均鼠密度为2.88%,野外为1.08%,居民区鼠带病毒率为10.54%,野外未检出,均高于去年。居民区和野外优势鼠种仍为褐家鼠。阳性血清和鼠肺进行PCR分型,结果均为家鼠型(Ⅱ型)。结论河北省HFRS疫情呈明显上升趋势,重点为河北东北部的唐山和秦皇岛两市,属于家鼠型为主的混合型疫区。防控应对重点区域采取针对家鼠型为主的综合防治措施。     

汉滩病毒西安分离84FLi的M片段全基因序列测定及分析

目的 测定我国肾综合征出血热患者流产胎儿肝脏分离病毒84FLi株的全M片段基因序列，了解其分子基础。方法 采用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR），分节段扩增M基因片段的cDNA，直接用PCR产物或克隆人pMD18-T载体后进行测序。结果 84FLi株的全M基因序列组成为：M片段基因共由3616个核苷酸组成，四种核苷酸的比例分别为A30．92％，C18．03％，G21．18％，T29．87％。GC含量为39．21％，AT含量为60．79％，最大开放读码框为41－3448，共编码1135个氨基酸。核苷酸序列同源性分析表明84FLi株与HTN型同源性高于与其他型汉坦病毒的同源性，其中与中国株的同源性较高，与HV114株的同源性为85．5％。与HTNV的国际标准毒株76－118的核苷酸同源性分别为84．0％，氨基酸的同源性为96．0％。结论 84FLi株属于汉滩型病毒，并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高。