RASSF1A基因转染对人肺腺癌细胞株A549增殖的抑制作用

目的：观察外源性RASSF1A基因对人肺腺癌细胞A549增殖及NF- κB亚单位P65表达的影响。方法：利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA3.0-RASSF1A质粒和空载体pcDNA3.0质粒分别导入A549细胞，经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆，Western blotting检测RASSF1A基因表达。采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法、流式细胞仪分析转染细胞的生物学行为。 RT-PCR和Western blotting检测基因转染对P65表达的影响。结果：经脂质体转染和筛选，建立了稳定表达RASSF1A基因的A549细胞系。与未转染组和转染空白载体组比较，转染RASSF1A基因的细胞生长速度明显减慢（P<0.05），细胞周期中G1/G0期比例明显增加（P<0.05），而S期比例减少；转染组细胞核内P65蛋白表达明显降低（P<0.05），而全细胞P65蛋白及mRNA表达未见明显变化。结论：RASSF1A基因可能通过抑制P65活性而抑制人肺腺癌细胞A549的生长。     

TGFB1抑制A549细胞增殖的分子机制研究

①目的 构建并鉴定TGFB1真核表达载体pcDNA3.1/TGFB1,探讨TGFB1抑制A549细胞增殖的可能机制.②方法 采用基因重组技术将TGFB1 CDS 插入真核表达载体pcDNA3.1 (+),构建TGFB1真核表达质粒.脂质体介导转染肺癌细胞A549,分为正常对照、空质粒及转染组.MTT和集落形成实验检测各组细胞活性和细胞增殖能力.Real-time- PCR及Western blot方法 检测各组中TGFB1、p53、Bax和Fas的mRNA和蛋白的表达水平.③结果 酶切和测序结果 证实TGFB1真核表达质粒构建成功.MTT和集落形成实验结果 显示pcDNA3.1/TGFB1转染组、细胞活性和细胞增殖能力明显降低(P<0.01).pcDNA3.1/TGFB1转染组与正常对照组、空质粒组比较:TGFB1、p53、Bax和Fas mRNA表达显著增加(P<0.01);TGFB1、p53、Bax和Fas蛋白的表达水平显著增加(P<0.01).④结论 TGFB1可能通过上调p53、Bax和Fas蛋白的表达抑制肺癌细胞A549的增殖.TGFB1有可能成为肿瘤生物治疗的靶点.     

RASSF1A基因对食管癌细胞EC9706生长抑制作用的研究

目的观察RASSF1A基因对食管癌细胞EC9706生长的抑制。方法将包含RASSF1A基因的质粒转染RASSF1A表达缺失的EC9706细胞,建立稳定转染细胞系,通过MTT法检测细胞活性和增殖能力、流式细胞仪检测其对细胞周期的影响、裸鼠移植瘤实验检测转染细胞的体内成瘤特性。结果稳定表达RASSF1A的EC9706细胞较对照组细胞的RASSF1A蛋白表达增加;细胞生长速度减慢（P〈0．01）;细胞周期中G1期比例增加,S期比例减少（G1期：RASSF1A组细胞：68．53％±3．34％;空质粒组：54．25％±4．61％;未转染组：53．41％±5．60％。S期：RASSF1A组细胞：（23．19±5．04）％;空质粒组：（31．81±2．05）％;未转染组：32．09％±1．99％）（P〈0．01）;同时裸鼠致瘤能力也被抑制（P〈0．05）。结论RASSF1A基因的外源性表达能显著抑制食管癌细胞在体内外的生长,提示该基因在食管癌的发生发展中发挥重要作用。     

JAB1对缺氧环境肺癌A549细胞化疗敏感性调控的研究

目的观察导入pcDNA3.1-HRE-JAB1真核表达质粒的肺癌A549细胞,在低氧环境下对健择(Gemzar)的化疗敏感性,以期找到一种提高肺癌化疗敏感性的方法。方法首先构建缺氧反应元件启动的pcDNA3.1-HRE-JAB1真核表达质粒,鉴定后将该质粒导入肺癌A549细胞。在低氧环境培养过程中加入化疗药物Gemzar,观察空白组(A549)、空载体组(A549+pcD-NA3.1-HRE)和质粒组(A549+pcDNA3.1-HRE-JAB1)肺癌A549细胞对Gemzar的敏感性。采用Real-time PCR和Westernblot分别检测各组肺癌A549细胞中JAB1的mRNA和蛋白表达水平;流式细胞术检测各组肺癌A549细胞周期分布和凋亡情况。结果通过双酶切鉴定,确定构建获得了pcDNA3.1-HRE-JAB1质粒。在有化疗药物Gemzar的情况下,质粒组分别与空白组或空载体组比较,质粒组肺癌A549细胞中JAB1mRNA和蛋白表达水平明显增加(P<0.01),细胞凋亡率明显增加(P<0.01),而细胞周期被明显阻滞于G1期(P<0.01)。结论 JAB1在低氧环境下高表达提高了药物Gemzar化疗的敏感性,这将可能成为一种理想的提高肺癌或其他实体恶性肿瘤化疗敏感性的手段。     

野生型p53基因转染对人肺腺癌细胞系A549 VEGF表达和肿瘤生长的影响

目的:研究外源性野生型p53(wtp53)基因对人肺腺癌细胞系A549血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响. 方法:将含有wtp53基因的pcDNA3.1-wtp53和空载体pcDNA3.1-neo质粒,通过阳离子脂质体转染A549细胞,应用半定量RT-PCR和ELISA技术检测其对VEGF表达情况的影响;将A549,A549/pcDNA3.1-neo和A549/ pcDNA3.1-wtp53细胞分别接种至裸鼠皮下,观察成瘤时间及瘤块大小;免疫组化法计数VEGF阳性细胞百分数并进行半定量分级. 结果:pcDNA3.1-wtp53转染组VEGF mRNA和蛋白表达均明显低于其他2组. pcDNA3.1-wtp53转染后裸鼠成瘤时间延长,瘤块生长缓慢. 结论:wtp53基因转染可抑制VEGF表达和肿瘤的生长.     

细胞膜上稳定表达融合蛋白CRT/vGPCR A549细胞株的建立

目的 将人钙网蛋白(calreticulin,CRT)基因与病毒G蛋白偶联受体(virus G-protein couple receptor,vGPCR)基因进行基因重组,用此重组基因建立细胞膜上稳定高表达CRT/vGPCR融合蛋白的人肺癌A549细胞株.方法 从pSG5-vGPCR质粒中获得全长vGPCR基因片段并与CRT全长编码序列的3′端连接形成融合基因,然后将融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中.用此质粒转染人A549肺癌细胞,通过G418筛选建立稳定转染的A549细胞株,用RT-PCR检测重组融合基因的表达,用细胞免疫荧光分析鉴定融合蛋白的表达及其在细胞膜上的定位.结果 成功获得重组融合质粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR,经DNA序列测定证实融合基因两阅读框(ORF)对接无误.将上述质粒转染A549细胞后,建立了稳定转染CRT/vGPCR的A549细胞株,融合基因在A549细胞中表达并定位到细胞膜上.结论 通过与CRT基因融合重组,具有膜定位能力的vGPCR能将CRT蛋白高效包被到肿瘤细胞膜上.     

野生型INK4a基因转染对肺腺癌A549细胞放疗敏感性的调控

目的研究野生型INK4a基因转染对人肺腺癌A549细胞放疗敏感性的调控.方法利用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将含有人全长野生型INK4a cDNA的真核表达重组质粒pcDNA3.1-p16导入该基因位点缺失的人肺腺癌A549细胞系中,确定其编码蛋白p16稳定表达;在设立空白组和空质粒转染组的情况下,检测分析放射线对A549细胞的克隆形成率和杀伤效率的影响.结果转染INK4a基因后的细胞与未转染及空质粒转染的细胞相比:肿瘤细胞S期和G2/M期的比例下降,G0/G1期的比例增加,生长减慢,凋亡指数增加,放射线处理后克隆形成率减少,50%抑制剂量(ID50)略有降低.结论 INK4a基因转染增强了肺腺癌A549细胞对放射线的敏感性,为将来肺癌患者基因治疗提供了一定的实验依据.     

SEMA3B基因真核表达载体的构建及对肺癌细胞恶性生物学行为的影响

目的构建抑癌基因SEMA3B真核表达载体pc DNA3.1-SEMA3B,并检测其对肺癌A549细胞恶性生物学行为的影响。方法应用PCR扩增SEMA3B全长c DNA片段,构建真核表达载体pc DNA3.1-SEMA3B。克隆PCR、双酶切法、基因测序验证过表达载体构建成功。将pc DNA3.1-SEMA3B真核表达载体和空载体pc DNA3.1分别转染入A549细胞中,应用qRT-PCR、Western blot检测SEMA3B mRNA、蛋白表达水平的变化;MTS法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期;克隆形成实验检测细胞集落形成能力。结果 SEMA3B基因扩增片段与预测片段一致,克隆成功,且测序鉴定证实真核表达载体构建成功。转染pc DNA3.1-SEMA3B真核表达载体可上调SEMA3B mRNA、蛋白表达水平,且可抑制A549细胞的增殖,诱导凋细胞亡,细胞被阻滞在G1期,抑制细胞集落形成能力。结论成功构建了SEMA3B基因真核表达载体,抑癌基因SEMA3B在肺癌恶性生物学进程中可能发挥重要作用。     

A549细胞转染esp1基因后生物学行为的变化

目的:观察A549细胞转染esp1基因后细胞生物学行为的改变.方法:将IRE-EGFP-esp1质粒用FuGENE 6脂质体转染到肺腺癌细胞A549,经G418筛选获得转染阳性的细胞系(esp1-A549).采用DNA荧光染色流式细胞仪分析转染后细胞DNA含量、倍性及细胞周期,计算S期细胞比率(SPF)和DNA指数(DI);采用细胞表面磷脂酰丝氨酸检测法和闪烁计数法分别检测细胞凋亡和增殖情况,同时检测软琼脂集落形成能力.以未转染(A549)、转染空载体(neo-A549)的细胞作对照.结果:与其他2组比较,esp1-A549细胞的DI、SPF及细胞增殖率降低,细胞凋亡率升高.esp1-A549细胞软琼脂集落形成数为3.5±0.6,克隆形成率为12.5%,低于A549细胞的23.3±0.2(t=4.93,P=0.004)和46%.结论:esp1基因的上调表达对A549细胞部分恶性生物学表型具有一定的抑制作用.     

RBM5 基因表达载体构建、稳定转染A549 细胞系的建立及功能的初步研究

目的：通过构建表达载体、建立稳定转染RNA结合基序5(RNA binding motif 5,RBM5)的A549细胞系, 初步研究RBM5基因过表达对A549 细胞增殖以及天冬-谷-丙-组氨酸盒多肽15[DEAH box polypeptide 15,DHX15]表 达的影响。方法：应用分段克隆法构建pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体;将测序验证后的重组质粒pcDNA3.1(+)/ RBM5转染肺腺癌A549细胞并以G418进行筛选,采用Western印迹鉴定RBM5基因过表达阳性细胞,流式细胞仪分别 检测经pcDNA3.1(+)/RBM5稳定转染的A549细胞[pcDNA3.1(+)/RBM5-A549]及pcDNA3.1(+)空白质粒转染的A549细胞 [pcDNA3.1(+)-A549]的周期分布;运用RT-PCR技术分别检测pcDNA3.1(+)/RBM5-A549和pcDNA3.1(+)-A549细胞中剪 接相关因子DHX15的表达情况。结果：成功构建出pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体,筛选出RBM5基因稳定转染过 表达阳性细胞株;pcDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞处于G1期细胞比例增大、S期细胞比例减小(均 P<0.01);cDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞的DHX15表达上调(P<0.01)。结论：成功构建重组质粒 pcDNA3.1(+)/RBM5,并建立了RBM5稳定转染的A549细胞系;初步证实RBM5基因过表达可抑制肺腺癌A549细胞的细 胞周期,并使DHX15表达上调。     

张力蛋白1抑制非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭

目的: 探讨张力蛋白1(tensin1,TNS1)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达水平、与NSCLC患者预后的关系及其对NSCLC细胞生物学功能的影响。方法: 收集56例NSCLC患者的临床病理资料,通过电话方式进行随访,了解患者生存情况。荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测56例NSCLC标本和对应癌旁组织中TNS1 mRNA表达水平,分析其与NSCLC患者临床病理特征的关系。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析TNS1 mRNA与NSCLC患者预后的关系。采用qRT-PCR和蛋白质印迹法分别检测NSCLC细胞A549、H1299与正常肺支气管上皮16HBE细胞中TNS1 mRNA和蛋白表达水平;将A549、H1299细胞各分为2组,分别转染TNS1过表达质粒(pcDNA3.1/TNS1组)和相应的空载质粒(阴性对照pcDNA3.1组);MTT实验、克隆形成实验、细胞划痕、Transwell实验分别检测细胞增殖、迁移、侵袭能力;蛋白质印迹法检测细胞上皮间质转化相关分子蛋白水平。结果： 与癌旁组织相比,NSCLC组织中TNS1 mRNA表达明显降低(P<0.05)。TNS1 mRNA表达量与NSCLC患者淋巴结转移及术后肿瘤转移相关(P<0.05),与年龄、性别、吸烟、病理分型、肿瘤大小、TNM分期无明显相关性(P>0.05)。TNS1 mRNA高表达患者的3年累积无病生存率和累积总体生存率均高于TNS1 mRNA低表达患者(P均<0.05)。A549和H1299细胞中TNS1 mRNA和蛋白表达量均明显低于16HBE 细胞(P均<0.01)。与对照组相比,pcDNA3.1/TNS1组A549和H1299细胞增殖、迁移、侵袭能力降低,E-钙黏蛋白表达明显上调(P<0.01),波形蛋白表达明显下调(P<0.01)。结论： TNS1在NSCLC组织及细胞中表达下调,与NSCLC患者预后相关,可抑制NSCLC细胞增殖和迁移。     

miR-152通过靶向FGF2抑制肺癌A549细胞系的增殖侵袭

目的:探讨miR-152通过靶向成纤维细胞生长因子2（FGF2）对肺癌A549细胞系的增殖和侵袭的作用机制。方法:通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测正常上皮细胞BEAS-2B和肺癌A549细胞中miR-152和FGF2的表达情况;采用转染技术,分别特异性表达肺癌A549细胞系中miR-152和FGF2基因的表达。将肺癌A549细胞系分为6组:miRNA 空转组（miR-NC组）、miR-152 过表达组（miR-152 mimics组）、miR-152 抑制组（miR-152 inhibitor组）、FGF2过表达空转组（pcDNA3.1-NC组）、FGF2过表达组（pcDNA3.1-FGF2组）和miR-152过表达+FGF2过表达组（miR-152+ pcDNA3.1-FGF2组）。通过qPCR检测A549细胞系中miR-152和FGF2的表达水平;细胞克隆和Transwell小室实验分别检测A549细胞系的增殖和侵袭能力;采用双荧光报告基因法验证miR-152与FGF2结合情况;Western印迹法检测A549细胞系中FGF2、自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）Ⅱ/Ⅰ、beclin1和p62的表达量。结果:qPCR结果显示,与正常上皮细胞BEAS-2B比较,肺癌A549细胞中miR-152的表达量显著降低（P＜0.01）,而FGF2的表达量显著增加（P＜0.01）。TargetScan生物信息学软件预测显示miR-152与FGF2的3′UTR结合,双荧光报告基因检测结果显示,miR-152与FGF2直接结合。细胞克隆和Transwell小室实验结果显示,与miR-NC组比较,miR-152 mimics组中的A549细胞系的增殖和侵袭能力显著减低（P＜0.05）,miR-152 inhibitor组的增殖和侵袭能力显著增加（P＜0.05）。与pcDNA3.1-NC组比较,pcDNA3.1-FGF2组中的A549细胞系的增殖和侵袭能力显著增加（P＜0.05）。与miR-152 mimics组比较,miR-152+ pcDNA3.1-FGF2组中A549细胞系的增殖和侵袭能力显著增加（P＜0.05）。Western印迹结果显示,与miR-NC组比较,miR-152 mimic组FGF2和p62蛋白表达显著降低（P＜0.05）,但LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1的表达量显著增加（P＜0.05）,而miR-152 inhibitor组结果与之相反。与pcDNA3.1-NC组比较,pcDNA3.1-FGF2组FGF2和p62蛋白表达显著增加（P＜0.05）,而LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1的表达量显著降低（P＜0.05）。与miR-152 mimics组比较,miR-152+ pcDNA3.1-FGF2组FGF2和p62蛋白表达显著增加（P＜0.05）,LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。结论:miR-152靶向FGF2抑制肺癌A549细胞系自噬,从而降低增殖侵袭能力,可成为肺癌临床治疗的新靶点。     

RASSF1A转录本在肺癌组织中表达及其临床意义

目的　探讨RASSF1A(RAS相关区域家族 1A)基因转录表达与肺癌发生、发展的关系。方法　采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)的方法检测 4 7例肺癌患者癌组织及相应癌周正常组织中RASSF1AmRNA的表达水平。结果　 (1)RASSF1AmRNA在所有正常组织中表达 ,而在肺癌癌组织中存在较高的表达缺失率 (5 3 2 % )。 (2 )淋巴结转移阳性者癌组织中RASSF1AmRNA表达缺失率 (70 4 % )明显高于淋巴结转移阴性者 (30 0 % ) (P <0 0 1) ;(3)RASSF1AmRNA表达缺失率与肺癌分期有关 ,越晚病例RASSF1A表达缺失率越高 (P <0 0 5 ) ;(4 )RASSF1AmRNA表达缺失与肿瘤组织学类型、肿瘤分化程度及吸烟指数未见显著相关 (P >0 0 5 )。结论　RASSF1A转录表达缺失 ,它可能参与调控肺癌的发生、发展过程 ,并进而影响其生物学特点及预后。     

miR-205靶定YES1对肺癌细胞A549的增殖抑制作用

目的：利用实时定量RT-PCR技术和双荧光蛋白报告基因分析系统检测miR-205在肺癌组织及A549细胞系中的表达水平以及其直接靶基因YES1,探讨miR-205抑制肺癌细胞A549增殖的可能机制。方法: 实时定量RT-PCR技术检测10例肺癌组织和10例癌旁正常肺组织中miR-205的表达水平;miR-205 mimics和control mimics分别转染A549细胞,利用细胞计数和集落形成实验检测转染后A549细胞的增殖情况。选取表达绿色荧光蛋白的质粒 pcDNA3/EGFP,将YES1 3′UTR的一段特异性序列、YES1 3′UTR（miR-205互补位点）点突变后的序列分别插入该质粒中,构建YES1-3′UTR和mut-YES1-3′UTR的绿色荧光表达质粒。实验分为YES1-3′UTR、YES1-3′UTR与miR-205 mimics、YES1-3′UTR与control mimics、mut-YES1-3′UTR、mut-YES1-3′UTR与miR-205 mimics和mut-YES1-3′UTR与control mimics共6组,均与表达红色荧光蛋白pDsRed2-N1共同转染肺癌细胞系A549,荧光分光光度计进行蛋白定性和定量检测。结果：与癌旁正常肺组织比较,miR-205在肺癌组织及A549细胞中表达水平降低(P<0.05);miR-205mimics 转染组A549细胞增殖率明显低于转染control mimics对照组（P<0.05）;YES1-3′UTR与miR-205 mimics共转实验组荧光蛋白表达水平低于YES1-3′UTR与control mimics共转染组（P<0.01）;YES1蛋白高表达组A549细胞细胞克隆形成数高于细胞对照组（P<0.05）。结论： miR-205可能通过靶定靶基因YES1抑制了肺癌细胞A549的增殖,提示miR-205和YES1有可能成为肿瘤生物治疗的新靶点。