四倍体菘蓝毛状根培养系统的建立及外界因子对其生长的影响

用发根农杆菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ Ｒ１６０１,Ａ４,ＡＴＣＣ１５８３４菌株感染菘蓝Ｉｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ,同源四倍体的子叶１０ｄ后,在子叶切口处均能陆续长出毛状根。转化根在不含激素的ＭＳ固体培养基上快速生长并表现出典型的毛根性状,经冠瘿碱分析证明确已被转化。建立了毛状根培养系统并比较了各种外界因子生长的影响。     

粟米草毛状根的研究

目的：建立粟米草（Ｍｏｌｌｕｇｏ ｐｅｎｔａｐｈｙｌｌａ Ｌ．）的毛状根培养系统并研究毛状根的生长特性。方法：分别用发根农杆菌Ｒ１６０１,ＡＴＣＣ １５８３４和Ａ４感染粟米草无菌苗的子叶,获得毛状根,并筛选优质株系;用高压纸电泳法对毛状根进行甘露碱检测;测定其生长曲线;比较不同基本培养液、不同ｐＨ 值对毛状根生长的影响。结果：高压纸电泳结果显示,所获毛状根中均含有甘露碱,表明毛状根中确已转入发根农杆菌的Ｔ－ＤＮＡ;１／２ ＭＳ０培养液ｐＨ ５．４～５．８最适合粟米草毛状根的生长。结论：快速生长的粟米草毛状根在药用活性成分的生产上将具有较大潜力。     

四倍体菘蓝毛状根的抗内毒素作用

目的：从菘蓝的同源四倍体植物诱导出毛状根,并探讨用毛状根代替自然根作为药用的可能性。方法;利用发根农杆菌Ａ４菌株感染四倍体菘蓝,采用细菌内毒素检查法考察诱导所得毛状根的抗内毒素作用。结果：Ａ４菌株能诱导四倍体菘蓝产生毛状根,毛状根具有较强的抗内毒素作用。结论：发根农杆菌诱导四倍体植物产生的毛状根有可能成为传统中药材的一种代用品。     

发根农杆菌Ri T—DNA对墨旱莲的遗传转化

目的 建立墨旱莲Eclipta prostrata的毛状根离体培养系统。方法 分别用发根农杆菌A4,R1601,ATCC15834 3种菌株感染墨旱莲的子叶外植体,获得毛状根,并筛选了优质株系,测定了毛状根的生长细线;利用高压纸电泳法对毛状根进行-DNA转化的检测。结果 首次利用发根农杆菌A4,R1601,ATCC15834 3种菌株成功地从墨旱莲中诱志出毛状根;经高压纸电泳检测,墨旱莲毛状根中含有甘露碱,表明Ri质粒的T-DNA已整合进毛状根中。结论 墨旱莲毛状根离体培养的建立为进一步进行药物活性成分的工业化生产奠定了基础。     

药用植物商陆毛状根培养系统的建立

目的:建立药用植物商陆(Phytolacca acinosa Roxb.)的毛状根离体培养系统.方法:分别用发根农杆菌A4、R1600、C58C1 3个菌株感染商陆的子叶外植体,获得毛状根,并筛选了优质株系;考察了影响毛状根生长的因素;测定了毛状根的生长曲线;利用PCR和高压纸电泳法对毛状根进行tDNA转化的检测.结果:利用发根农杆菌A4、R1600、C58C1 3种菌株成功地从商陆中诱导出毛状根;以水解酪蛋白为氮源、以麦芽糖为碳源最有利于商陆毛状根的生长;毛状根的生长曲线呈"S"形,24 d时质量达到最大(增长18倍);PCR及高压纸电泳检测结果表明Ri质粒的tDNA已整合进毛状根中.结论:成功建立了商陆毛状根离体培养系统,为进一步进行药用成分的工业化生产和引入外源基因改良性状奠定了基础.     

远志毛状根诱导及其3,6’-二芥子酰基蔗糖酯测定

目的从远志诱导出毛状根,并检测其寡糖酯类成分的产生。方法应用发根农杆菌A4、R1600和R1000菌株分别感染远志外植体,采用高效液相色谱(HPLC)法检测诱导出的毛状根中3,6’-二芥子酰基蔗糖酯的含量。结果 3种发根农杆菌均能诱导远志外植体产生毛状根,且毛状根中都检测到3,6’-二芥子酰基蔗糖酯,A4菌株诱导远志下胚轴产生的毛状根的3,6’-二芥子酰基蔗糖酯含量高于R1600和R1000菌株(F=5 066.792,P<0.05)。结论用远志毛状根培养物生产寡糖酯类成分是一条值得探索的新途径。     

短葶飞蓬毛状根的诱导及黄酮类成分测定

目的通过诱导培养短葶飞蓬毛状根产生有用次生代谢产物。方法利用发根农杆菌C58C1感染短葶飞蓬无菌苗叶盘诱导毛状根,小量提取脱农杆菌完全的毛状根DNA用于rol基因的PCR检测,经PCR检测阳性的毛状根采用4种不同液体培养基振荡扩大培养,对于获得的毛状根系测定其中总黄酮和灯盏花素的量。结果发根农杆菌感染10min共培养2d可取得较好的转化效果,继代培养约两个月后可脱菌完全,获得的毛状根PCR检测阳性率为52.9%,4种液体培养基中B5培养基更适合于毛状根的生长,毛状根中总黄酮量要明显高于正常根中的量,但灯盏乙素的量明显低于正常根中的量。结论通过短葶飞蓬毛状根大量培养可获取灯盏黄酮类药用成分。     

发根农杆菌诱导广藿香毛状根的研究

目的 筛选诱导广藿香毛状根的最佳条件,建立广藿香毛状根诱导体系,并以此体系作为下一步研究的基础.方法 采用共培养法,用发根农杆菌ATCC15834和C58C1,经预培养、侵染、共培养和除菌操作诱导广藿香外植体产生毛状根.结果 预培养时间为2d,乙酰丁香酮质量浓度为15 mg/L,侵染时间为25 min,共培养时间为2d,发根农杆菌ATCC15834和C58C1诱导率均达到最高,分别为83.3％和80.5％;PCR扩增结果证实,发根农杆菌Ri质粒的T-DNA部分已在广藿香毛状根的基因组中整合及表达,说明广藿香毛状根已经被成功诱导.结论 成功诱导并建立了广藿香毛状根诱导体系.     

何首乌毛状根培养及大内酚的含量测定

目的 测定何首乌毛状根中大黄酚的含量。方法 用发根农杆菌Ri 15834菌株感染何首乌茎、叶外植体,均可诱导出毛状根,并能合成大黄酚,采用薄层扫描法测定毛状根中大黄酚。结果 毛状根中大黄酚的含量为0．0164％。结论 该毛状根具有典型的毛状根形态特征,大黄酚含量低于何首乌药材。     

掌叶大黄发根及愈伤组织、悬浮细胞中蒽醌类成分的比较研究

目的：比较Ｒｉ质粒转化的掌叶大黄发根与愈伤组织、悬浮细胞以及掌叶大黄生药中游离蒽醌成分的含量。方法：用发根农杆菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ９４０２野生型菌株感染掌叶大黄外植体以诱导发根，建立发根离体培养系，用Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ鉴定发根；分别诱导掌叶大黄愈伤组织和悬浮细胞；用高效液相色谱法测定发根、愈伤组织、悬浮培养细胞以及掌叶大黄生药中芦荟大黄素等游离蒽醌化合物的质量含量。结果：从子叶柄上诱导出了发根，并建立了培养体系；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果证明Ｒｉ质粒ＴＤＮＡ转移并整合到植物细胞基因组中；用叶片作外植体诱导出了愈伤组织；悬浮培养细胞用叶片、叶柄外植体诱导的愈伤经液体培养获得；掌叶大黄发根中各种游离蒽醌化合物含量普遍高于愈伤组织，但低于生药和悬浮培养细胞。结论：用掌叶大黄发根培养物生产蒽醌化合物是一条值得探索的新途径。     

莨菪发根培养体系的建立

目的建立莨菪Hyoscyamus niger的发根培养体系。方法分别用A4、LBA9402和C58C1三种发根农杆菌菌株转化莨菪子叶受体,获得发根;测定发根的生长曲线和比较不同因素对发根生长量的影响;PCR鉴定转化发根;莨菪发根中生物碱类含量的测定。结果首次利用发根农杆菌A4、LBA9402、C58C1三种菌株成功从莨菪中诱导出发根,并建立了莨菪发根最优的培养体系;经PCR鉴定证明Ri质粒的T-DNA已转化进莨菪的发根中。结论莨菪发根培养体系的建立为利用遗传代谢工程手段调节莨菪次生代谢物含量和进行药用活性成分的工业化生产奠定了基础。     

天山大黄发根培养物中蒽醌化合物的产生

目的：探索用发根培养法生产植物次生代谢物的途径。方法：用发根农杆菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ９４０２所含Ｒｉ质粒遗传转化药用植物天山大黄以诱导发根用纸电泳法检测发根中冠瘿碱的存在；用高效液相色谱法测定发根中芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚８甲醚等游离蒽醌化合物的含量。结果：诱导出了天山大黄发根，并建立了发根离体培养系；从发根中检测到甘露碱、农杆碱的存在；定量分析发现，天山大黄发根中含有多种蒽醌类成分，其中大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚８甲醚的含量分别高于原植物根中的含量。结论：天山大黄发根能产生与原植物药用部位种类相似的化学成分     

菘蓝不同栽培居群的等位酶分析

目的：对菘蓝Ｉｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ,不同栽培居群进行等位酶分析研究。方法;在全国各地采集菘蓝１３个二倍体栽培居群的种了,异地栽培于上海市崇明岛同一块试验田。以水平切片淀粉凝胶电泳方法,对菘蓝等位酶多态性进行研究,分析了８个酶系统的１５个等位酶位点。结果：等位酶多态位点陌分为１３．３％～３３．３％,每个位点的位基因平均数Ａ为１．１～１．５,预期杂合度Ｈｅ为０．０２７～０．１００     

中药菘蓝过氧化物同工酶的测定

目的:对菘蓝不同器官的POD同工酶进行分析测定。方法:采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳。结果:菘蓝的POD同工酶酶谱具有一定的器官特异性和稳定性。结论:同工酶变化与生物的生长发育之间具有特异性关系,可为生物生长发育的调控研究提供参考。     

不同播期菘蓝的生长及结籽差异性研究

目的研究春播和秋播两种不同播期菘蓝生长的差异、生殖生长特性以及这两种播期下菘蓝的结籽情况,为建立科学的规范化栽培技术提供理论依据。方法菘蓝播种出苗之后,定期进行采样,测定根系与苗系生长变化规律,开花后观察测定菘蓝开花结果情况。结果菘蓝经过春化在春季转暖后迅速抽薹,这一时期株高、冠幅等生物量变化非常明显;两种不同播期的菘蓝生长存在明显差异,春播菘蓝开花前生长明显优于秋播菘蓝,但是开花结果后倒伏严重,长势不如秋播菘蓝。结论两种繁殖方式生产的种子千粒质量、单株平均产量、公顷产量均有差异,但种子的发芽率差异不大,不影响来年生产;春播菘蓝生产的种子质量较秋播的高,但是生长后期要注意防倒伏;秋播菘蓝在秦巴山区和秦岭以南可以很好生长,南方地区两种种子繁殖方式均适宜,而北方地区更适宜于春播繁殖方式。     

四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅱ.转半夏凝集素基因菘蓝的分子生物学检测

目的 获得转基因菘蓝的分子生物学证据。方法 对经卡那霉素筛选的抗性再生菘蓝苗进行聚合酶链式反应(PCR)，Southern杂交和RT—PCR检测。结果 PCR和Southern杂交检测结果表明，外源半夏凝集素基因已经整合到转基因菘蓝的基因组中，RT—PCR结果表明其DNA可以正常转录成mRNA。结论 可以利用农杆菌介导的基因转化技术培育抗虫的菘蓝新品系。