幽门螺杆菌重组粘附素的安全性、免疫原性和生物学活性的体外评价

目的通过体外实验确定重组粘附素(rBabA)的安全性、免疫原性及粘附作用,探讨rBabA在幽门螺杆菌(Hp)疫苗应用中的可行性。方法二苯胺法测定rBabA致T细胞凋亡率,ELISA法测定Hp感染者血清中抗rBabA抗体,MTT法测定T细胞对rBabA的增殖反应,光镜计数法研究rBabA对Hp与胃癌细胞粘附的影响。结果体外安全性实验表明rBabA无明显致BabA抗体阴性者T细胞凋亡的作用,而且可刺激rBabA抗体阳性者T细胞的增殖;ELISA法共检测了38份Hp感染患者血清,rBabA抗体阳性率为18.4%。rBabA能部分阻断Hp与胃癌细胞系的粘附。结论研究表明rBabA是安全的、具有免疫原性的Hp菌体成分,既可以刺激体液免疫,又能够提高细胞免疫,有望成为针对BabA2基因阳性Hp菌株疫苗研制中一种有效的新抗原。     

幽门螺杆菌重组粘附素rHpaA生物学活性及免疫原性的体外评价

目的：体外评价幽门螺杆菌（Hp)重组粘附素rHpaA的生物学活性及免疫原性,探讨其在Hp疫苗应用中的可行性。方法：流式细胞术和光镜定量计数法检测rHpaA及其抗体对Hp与胃上皮细胞粘附的影响;ELISA法测定Hp感染者血清中抗HpaA抗体,^3H-TDR掺入法测定人外周血淋巴细胞（PBL）对rHpaA的增殖反应,评价rHpaA对体液和细胞免疫的细胞;流式细胞术检测rHpaA对T辅助细胞（Th）表型的选择作用,探讨rHpaA可能的免疫机制。结果rHpaA和抗rHpaA抗血清均能部分阻断Hp与胃上皮细胞系的粘附;ELISA法能检测出Hp阳性患者血清中存在抗HpaA抗体,检测出率与Hp超声破碎抗原（HpSON)包被下的检出率相近（50%vs54%,P＞0．05）;不论培养基中是否加入IL－2,rHpaA均可刺激Hp PBL的增殖（P＜0．05）;Hp阳性或阴性PBL细胞与rHpaA孵育后均能显著提高IL－4阳性T细胞比例（P＜0．05）。结论HpaA是具有免疫原性的Hp菌体成分,且能选择性增加Th2细胞比例,有望成为Hp疫苗研制中一种有效的新抗原。     

表达幽门螺杆菌粘附素BabA重组蛋白菌株的构建及其粘附活性评价

目的 构建表达幽门螺杆菌(Hp)粘附素BabA重组蛋白的候选菌株并测定其粘附活性。方法 用PCR方法从Hp染色体DNA上扩增粘附素babA2基因，将其定向插入表达载体pET-22b( )中，并在BL21(DE3)大肠杆菌中表达，利用光镜计数法测定其粘附活性。结果 DNA序列分析表明，所克隆的粘附素babA2基因序列与GeneBank公布的一致。在37℃诱导表达3h后，粘附素BabA重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34．8％，体外实验证实BabA参与了粘附过程。结论 本研究获得了表达有生物活性的Hp粘附素BabA的克隆，为深入研究其相关功能奠定了良好基础。     

幽门螺杆菌粘附素基因保守区的克隆及免疫原性研究

目的 构建表达幽门螺杆菌(Hp)4种粘附素(BabA2、AlpA、AlpB和HopZ)保守区蛋白质的候选菌株,并研究其免疫原性。方法 利用PCR技术扩增粘附素保守区(命名为CB)基因,将其定向插人pET—22b( )载体,在BL21(DE3)大肠杆菌中表达;表达产物经亲和层析纯化和免疫印迹鉴定,ELISA法测定Hp感染者血清中抗CB抗体。结果 构建了4种粘附素保守区的重组质粒,测序显示CB基因长588bp,编码195个氨基酸。SDS—PAGE和凝胶扫描分析,CB基因表达的蛋白质相对分子质量约为22500,其重组蛋白质表达量占菌体总蛋白质的29％。经免疫印迹证实该重组蛋白质可以被Hp阳性患者血清所识别,ELISA法共检测了55份血清,以快速尿素酶实验(RUT)作为平行对照,两法的评价判断一致性程度的指标卡帕系数为0．76。结论 CB有可能成为一种有效的疫苗,用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗。     

表达幽门螺杆菌粘附素BabA重组蛋白菌株的构建及其粘附活性评价

目的构建表达幽门螺杆菌(Hp)粘附素BabA重组蛋白的候选菌株并测定其粘附活性。方法用PCR方法从Hp染色体DNA上扩增粘附素babA2基因,将其定向插入表达载体pET-22b( )中,并在BL21(DE3)大肠杆菌中表达,利用光镜计数法测定其粘附活性。结果DNA序列分析表明,所克隆的粘附素babA2基因序列与GeneBank公布的一致。在37 ℃诱导表达3 h后,粘附素BabA重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34.8%,体外实验证实BabA参与了粘附过程。结论本研究获得了表达有生物活性的Hp粘附素BabA的克隆,为深入研究其相关功能奠定了良好基础。     

重组幽门螺杆菌粘附素工程菌高密度发酵条件的研究

目的研究重组幽门螺杆菌粘附素基因工程菌的发酵工艺.方法采用德国B.Brau公司C-10型15 L发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行了优化.结果在优化的条件下,15 L发酵罐发酵工程菌,菌体收获量可达48.2g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的31.5%.结论此发酵工艺可以提高工程菌收获和目的蛋白的表达.     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆及表达

通过基因工程技术获得具有良好免疫原性的重组Ｎ－乙酰神经氨酰乳糖结合原纤维样血凝素。方法利用ＰＣＲ技术从幽螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ，Ｈｐ）总ＤＮＡ中钓取ｈｐａＡ结构基因，克隆及序列分析后在大肠杆菌中进行高效表害，表达产物纯化后用酶联免疫吸附法检测其抗原性。     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆及表达

目的 通过基因工程技术获得具有良好免疫原性的重组N-乙酰神经氨酰乳糖结合原纤维样血凝素（HpaA）。 方法 利用PCR技术从幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）总DNA中钓取hpaA结构基因,克隆及序列分析后在大肠杆菌中进行高效表达,表达产物经纯化后用酶联免疫吸附法（ELISA）检测其抗原性。结果 序列分析证实hpaA结构基因长度为783 bp,编码261个氨基酸,SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约为29 000,可溶性表达占全菌的20%以上,经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析后获得纯度为90%的重组蛋白。ELISA法显示该蛋白可被Hp全菌抗血清识别。结论 基因重组粘附素HpaA具有良好的抗原性,可望作为一种有效的蛋白疫苗用于Hp感染的防治。     

幽门螺杆菌粘附素基因alpA的克隆与高效表达

目的 克隆并表达幽门螺杆菌粘附素AlpA基因。方法 提取幽门螺杆菌染色体基因，用PCR方法扩增alpA基因，将其克隆至表达载体pET-22B( ),转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达。结果 分离得到了1.5kb的alpA基因片段，并在大肠杆菌中实现了该基因的高效表达，在37℃诱导表达3h后，表达产物占细菌总蛋白的31．9％。表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在，其中主要是包涵体的形式，目的蛋白占不溶性蛋白的64．8％。结论 幽门螺杆菌alpA基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础。     

幽门螺杆菌粘附作用的体外研究

置幽门螺杆菌(HP)悬液于含人喉癌上皮细胞(Hep-2)或人胃癌上皮细胞(MKN-28)的培养瓶内,经2h或3.5h培养后观察HP对细胞的粘附情况。结果发现HP能成丛地粘附在上皮细胞表面,少数侵入胞浆内。HP对MKN-28粘附率明显高于对Hep-2细胞者。随菌龄的延长或菌株的变异,HP的粘附作用明显减弱。1%D-甘露糖对HP的粘附性有部分阻抑作用。     

高效表达幽门螺杆菌黏附素Hp0410的嗜酸乳杆菌重组菌株的构建

目的构建高效表达幽门螺杆菌黏附素Hp0410的嗜酸乳杆菌重组菌株。方法从幽门螺杆菌标准株NCTC11639中扩增出幽门螺杆菌黏附素基因Hp0410,克隆入穿梭质粒pMG36e中,通过电穿孔将重组质粒转入嗜酸乳杆菌,表达的目的蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳与硝酸银染色及Western blotting鉴定,并检测重组质粒的稳定性。结果扩增的黏附素Hp0410基因与基因库公布的一致,构建的重组质粒成功转入嗜酸乳杆菌中,表达出分子量约34kD的目的蛋白,Western blotting证实该蛋白可被幽门螺杆菌感染患者血清所识别。重组质粒pMG36e-Hp0410在含有红霉素和不含有红霉素的环境下均稳定。结论成功构建了高效组成型表达幽门螺杆菌黏附素Hp0410的重组嗜酸乳杆菌菌株。     

Construction of the E.coli clone expressing adhesin BabA of Helicobacter pylori and evaluation of the adherence activity of BabA.

OBJECTIVE: To construct a recombinant E.coli strain that highly expresses blood group Ag-binding adhesin (BabA) of Helicobacter pylori (Hp) and to assess the adherence activity of Hp BabA. METHODS: The gene fragment encoding BabA was amplified from Hp chromosomal DNA by PCR technique and inserted into prokaryotic expression vector pET-22b (+), which was then transformed into BL21 (DE3) E.coli strain for the expression of BabA recombinant protein. The adherence activity of Hp BabA obtained was assayed by counting under light microscope. RESULTS: DNA sequence analysis showed that the sequence of babA2 DNA was in agreement with that published in GenBank. The BabA recombinant protein amounted to 34.8% of the total protein of the bacterium after IPTG induction for 3 h at 37 degrees Celsius, and BabA-mediated adherence was confirmed in vitro. CONCLUSION: A clone expressing biologically active Hp BabA has been obtained, which may facilitate further study of the function of the adhesin.     

黄连素对幽门螺杆菌抗菌作用的实验研究

目的探讨黄连素对幽门螺杆菌（//e/fcofcflctefpy/or;,冲）的抗菌作用。方法采用kirby-bauer法对 61例Up临床分离株及标准株均分别行黄连素抗Hp药敏实验;实验中黄连素药敏纸片制成25阽、50阽、 100叫g、250 jig四个梯度含量,每株菌药敏实验时均同步设克拉霉素、阿莫西林药敏标准纸片对照。结果黄连 素250 jig含量组与克拉霉素、阿莫西林对照组平均抑菌圈直径、有效率分别相比较,效果相当（/>>()? 05),黄连 素100 pg含量组和克拉霉素、阿莫西林对照组办效果相比较,有效率相当（P>0.05);而平均抑菌圈直径不及 克拉霉素及阿莫西林对照/>=0(P <0.05);余下黄连素梯度组和克拉霉素、阿莫西林抗Hp效果相比,无论平均 抑菌圈直径还是有效率均劣于两者（P<0. 05);黄连素各梯度组抗菌作用相比,无论平均抑菌圈直径还是抗冲 有效率在一定梯度含量范围内呈现剂量相关性,以250梯度含量组最优,余下依次下降（P <0.05)。结论黄连素25 pg量级水平即具有一定的抗Hp作用,但以250 pg含量抗Hp效果与克拉霉素及阿莫西林抗菌作用 相当     

重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及其生物学性质

目的 基因重组人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)并分析重组蛋白的生物学性质。方法 采用PCR从我国临床分离的Hp菌株中克隆UreB基因，并通过DNA重组技术构建非融合表达UreB的重组质粒pET-11C-UreB，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。结果 重组UreB在大肠杆菌中表达，相对分子质量约62000，表达率26％。N端15个氨基酸序列为MKKISRKEYVSMYGP，肽图及氨基酸组成成分分析结果与理论预测值吻合。以重组UreB免疫BalB／c小鼠，能产生抗UreB抗体。ELISA及Western blotting分析显示，重组UreB具有良好的免疫原性和反应性，表现出与天然Hp UrcB相似的生物学功能。结论 为重组UreB作为Hp亚单位疫苗成分奠定了免疫学基础。     

幽门螺杆菌感染与ABO血型及胃肠激素的相关性

目的探讨幽门螺杆菌(H.pylori)感染性消化性溃疡(peptic ulcer,PU)与ABO血型及胃肠激素的相关关系。方法随机选择217例消化性溃疡患者为研究组(PU组)和236例健康志愿者为对照组,分别采用放射免疫法和微柱凝胶法检测胃泌素、生长抑素水平和ABO血型,比较ABO血型胃泌素、生长抑素水平和H.pylori感染的差异。结果PU组O型血者占48.85%,明显高于O型血在正常人群中的分布(32.20%,P0.05);无论是消化性溃疡患者还是健康者,O型血人群的H.pylori感染率均显著高于非O血型(P0.05-0.01);O型对照组胃泌素水平比非O型各组高,但无显著性差异(P0.05);对照各组生长抑素水平无差异(P0.05);而PU组O型胃泌素水平升高,与各对照组相比有显著性差异(P0.05);PU组O型生长抑素水平则下降,与其他各组相比有显著性差异(P0.05)。结论 ABO血型中O型血者易患消化性溃疡,幽门螺杆菌的易感性及胃肠激素分泌紊乱是关键因素.     

携带RA538的重组体腺病毒体外及体内安全性研究

目的 研究携带ＲＡ５３８的重组腺病毒Ａｄ－ＲＡ５３８潜在的副作用,评价其安全性,为其进一步进入临床试验提供依据。方法 体外病毒扩增实验：预先用Ａｄ－ＲＡ５３８感染ＨｅＬａ细胞,制备细胞提取液后反复两次感染ＨｅＬａ细胞,观察Ａｄ－ＲＡ５３８扩繁殖,扩增以及对ＨｅＬａ细胞的作用,逆转录－聚合酶链反应检测其ＤＮＡ的转录;     

重组幽门螺杆菌过氧化氢酶对结肠粘膜上皮细胞氧化应激的影响

OBJECTIVE: To investigate the effects of recombinant Helicobacter pylori catalase (rHpCAT)on oxidative stress in rat colonic mucosal epithelial cells. METHODS: Oxidative stress model was established by hydroxyl generated from Fenton reaction in cultured colonic mucosal epithelial cells isolated from normal rats, in the model of which the effects of rHpCAT were observed. The cells were divided into normal control, model, 5-aminosalicylic acid (5-ASA, 0.1 mmol/L), and rHpCAT (1 x 10(5), 1 x 10(6), and 1 x 10(7) U/kg, respectively) groups. At the end of the experiment, the content of lactic dehydrogenase (LDH), malondialdehyde (MDA), myeloperoxidase (MPO), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) and, superoxide dismutase (SOD) were detected in the culture supernatant. RESULTS: The contents of LDH, MDA and MPO were elevated while those of GSH-Px, CAT and SOD reduced in the model group. rHpCAT at different doses reduced the release of LDH, depressed the contents of MDA and MPO, and increased the contents of GSH-Px, SOD and CAT. CONCLUSION: rHpCAT has protective effects against rat colonic mucosal oxidative damage.