细粒棘球蚴中国大陆株线粒体苹果酸脱氢酶基因的克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴线粒体苹果酸脱氢酶（mMDH）基因片段，进行序列分析，为研究包虫病疫苗候选基因奠定基础。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA，根据国外细粒棘球蚴mMDH（线粒体苹果酸脱氢酶）基因的已知序列设计一对引物，采用RT—PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆侏mMDH基因。将PCR产物纯化后，亚克隆到pGEM—T载体并构建成基因工程菌株后进行序列测定和分析。结果 用RT—PCR成功扩增出细粒棘球蚴中囤大陆株mMDH基因，测序表明该基因开放阅读框为1017bp，与已发表基因核苷酸序列相比，同源性为99％，理论蛋白编码的氩基酸序列同源性为99％。结论 在国内首次获得细粒棘球蚴线粒体苹果酸脱氢酶（mMDH）基囚序列，为进一步构建重组表达基因工程菌株打下良好的基础。     

细粒棘球蚴中国大陆株Eg10基因片段的分子克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴（E．granulosus）Eg10基因片段，并进行序列分析。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴，提取总RNA，根据GeneBank公布的细粒棘球蚴Eg10基因片段已知序列，设计一对引物，采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株Eg10基因片段，将纯化后的PCR产物克隆到pGEM-T载体，进行序列测定和分析。结果 成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株k10基因片段，测序为938bp，该基因序列与检索基因核苷酸序列同源性为100％，推导编码氨基酸序列同源性亦为100％。结论 测序的k10基因序列有完整的编码框（765bp），对于进一步研究其结构和功能及对包虫病的免疫预防具有重要意义。     

细粒棘球蚴延伸因子-1基因的克隆、测序及特性分析

目的 对细粒棘球蚴（E.granulosus）翻译延伸因子（translation elongation factor）EF-1基因片段进行分子克隆及序列分析。方法 从细粒棘球蚴原头蚴中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴EF-1基因片段,与pGEM-T载体重组并转化E.Coli JM109,经筛选扩增获得重组基因克隆,再进行序列测定和分析。结果 成功构建了EF-1／pGEM—T／JM109克隆体系,测序表明该基因开放阅读框为693bp,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为99％,推导编码氨基酸序列同源性为99％。结论 扩增获得的基因片段可能为细粒棘球蚴（E.granulosus）翻译延伸因子EF－1基因片段。     

细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白基因分子克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴（E.granulosus）铁蛋白（ferritin）基因序列,进行序列分析。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据国外细粒棘球蚴铁蛋白基因的已知序列设计一对引物,采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白基因,待PCR产物纯化后,将其克隆到pGEM-T载体,进行序列测定和分析。结果 用RT-PCR成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白基因,测序表明该基因为562bp。同源性比较结果表明：该基因序列与已发表基因核苷酸序列相比,390bp同源性约为97.7％,推导编码氨基酸序列同源性为97.7％,此基因序列在435bp出现终止密码。结论 测序的铁蛋白基因序列有完整的编码框,为进一步研究其结构和功能,以及对包虫病的免疫预防具有重要意义。     

细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因分子克隆和序列分析

目的获得细粒棘球蚴（E.granulosus）亲肌肉基因（myophilin）序列并进行序列分析.方法从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据GeneBank公共数据库检索出细粒棘球蚴亲肌肉基因的已知序列设计一对引物,采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因,将其克隆到pGEM-T载体,进行序列测定和分析.结果成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因,测序表明该基因为573bp;该基因序列与检索基因核苷酸序列相比,同源性为100%,推导编码氨基酸序列同源性为100%.结论测序的亲肌肉基因序列有完整的编码框,可做为包虫病重组抗原的候选基因.     

细粒棘球蚴中国大陆株谷胱苷肽S-转移酶基因的克隆和序列分析

目的 对细粒棘球蚴谷胱苷肽S-转移酶基因进行克隆和序列分析。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA，根据国外细粒棘球蚴谷胱苷肽S-转移酶基因的已知序列设计一对引物，采用RT-PCR技术扩增，将PCR产物纯化后，将其克隆到pGEM-T载体后进行序列测定以及生物信息学分析。结果 用RT-PCR成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株谷胱苷肽S-转移酶基因，测序表明该基因开放阅读框为660bp，与已发表基因核苷酸序列相比，同源性为99％。结论 成功克隆了细粒棘球蚴中国大陆株谷胱苷肽S-转移酶基因序列，为其进一步的研究奠定基础。     

细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因的克隆和序列分析

目的获得细粒棘球蚴（E.granulosus）诊断抗原（diagnostic antigen）P-29基因并进行序列分析。方法从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据GenBank公共数据库检索出细粒棘球蚴诊断抗原P-29基因的已知序列设计一对引物,通过RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和分析。结果成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因,测序表明该片段由717bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为100％,推导编码氨基酸序列同源性为100％。结论成功克隆细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因序列,可做为包虫病重组抗原的候选基因。     

细粒棘球蚴线粒体rRNA的序列测定

通过EST方法对细粒棘球蚴cDNA库进行筛选,将得到的EST序列送入GenBank和EBI进行同源性分析及登陆,对有意义的EST进行通测,得到了完整的细胞线粒体rRNA序列。并进行了同源性比较及质粒转化。为细粒棘球蚴的系统分类,鉴定及进化研究提供了新的有用依据。     

细粒棘球蚴中国大陆株zw-5基因的克隆和生物信息学分析

目的获得细粒棘球蚴zw-5基因序列,进行序列分析,为研究包虫病疫苗候选基因作好前期工作。方法从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据国外细粒棘球蚴Eg-CWGRS-12D11基因的已知序列设计一对引物,采用RT—PCR技术扩增,将PCR产物纯化后,将其克隆到pGEM—T载体后进行序列测定以及生物信息学分析。结果用RT—PCR成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株zw-5基因,测序表明该基因开放阅读框为624bp,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为99％。结论在国内首次获得细粒棘球蚴zw-5基因序列,对进一步研究其结构和功能以及包虫病的防治具有重要意义。     

结核分枝杆菌MPT64诊断抗原基因的克隆及生物信息学分析

目的获得结核分枝杆菌MPT64诊断抗原基因,进行DNA测序、序列特性生物学特性分析,为研究结核病诊断抗原侯选基因奠定基础。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌MPT64抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和生物信息学分析。结果成功扩增出结核分枝杆菌MPT64抗原基因,测序表明该片段由699bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为98%,推导编码氨基酸序列同源性为98%。结论经DNA测序证实,扩增出的片段确为MPT64,该片段阅读框完整。     

结核分枝杆菌CFP10诊断抗原基因的克隆及序列特性分析

目的扩增结核分枝杆菌培养滤液蛋白10基因（CFP10）,并将其克隆至质粒pGEMT中进行核苷酸序列特性分析,为研究结核病候选诊断抗原基因奠定基础。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌CFP10抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行酶切鉴定及序列测定和生物信息学分析。结果成功扩增出结核分枝杆菌CFP10抗原基因,测序表明该片段开放阅读框由303bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为100%,推导编码氨基酸序列同源性为100%。结论成功克隆CFP10基因,经DNA测序证实,该片段阅读框完整,为其原核表达及相关研究奠定了基础。     

DNMT1靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析

目的:本研究利用RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术,以DNMT1(DNAmethyltransferase 1)为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础.方法:设计有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体,转化JM109菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经测序鉴定确实为所需序列.结论:DNMT1靶向RNA干扰重组体的成功构建和序列分析,可进一步利用克隆所得的小RNA序列干扰DNMT1的mRNA转录,从而达到治疗肿瘤的目的.     

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cDNA的克隆及鉴定

目的:克隆人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长cDNA以构建相应腺病毒表达载体。方法:根据人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因序列设计合成可扩增人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cD-NA的特异性引物,用RT-PCR法从骨髓细胞总RNA中扩增人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cDNA,并克隆至pGEM-T载体中,经酶切鉴定后再行序列分析。结果:逆转录多聚酶链反应扩增产物长度与预期的456 bp一致;用M13正、反向引物行荧光测序,证实克隆出的序列与GenBank的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cDNA序列完全一致;人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长cDNA被成功地插入到质粒pGEM-T中。结论:克隆人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长cDNA为构建相应腺病毒表达载体及应用B7-1行肿瘤免疫基因治疗提供了可能性。     

人同源盒基因Nkx3.1启动子的克隆及活性测定

目的：克隆Nkx3．1基因5’上游1．06kb片段，构建pGL3-1．06kb载体，测定其启动子活性。方法：采用PCR方法从人基因组DNA中扩增Nkx3．1基因5’上游1．06kb片段并构建到荧光素酶报道基因pGL3-basic载体中，与内参照质粒pRL-Tk共转染前列腺癌LNCaP细胞，通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果：PCR扩增的1．06kb片段经测序正确无误；pGL3-1．06kb转染LNCaP细胞48h后，双荧光素酶活性测定M1／M2=2．7，为pGL3-control活性的1．5倍，为pGL3-basic活性的50倍。结论：克隆的人Nkx3．1基因5’上游1．06kb片段具有较强的启动子活性。     

高温致神经管畸形相关基因片段N32的克隆和测序

目的：对高温致神经管畸形相关基因片段N32进行克隆和测序分析。方法：利用T－A克隆方法，将高温致神经管畸形相关基因片段N32克隆入pMD 18-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，少量抽提质粒，酶切鉴定并测序，测序结果与GenBank中已知序列进行同源性比较并进行功能分析。结果：N32片段的序列与家鼠剪接因子3bl(Sf3bl)基因的3‘端序列同源性为93％。结论：N32片段所在基因的低表达在高温致神经管畸形中可能发挥重要作用。     

一个新的高血压病相关基因的克隆和表达

目的寻找和克隆新的高血压病相关基因，探讨高血压病的发病机制。方法应用差异显示筛选的方法，对正常（ＷＫＹ）大鼠和自发性高血压病大鼠（ＳＨＲ）血管平滑肌细胞进行ＲＮＡｍａｐｐｉｎｇ分析，选择下调的ｃＤＮＡ进行克隆。结果获得一个新的ｃＤＮＡ，其长度为４１６０ｂｐ，可编码５５１个氨基酸，蛋白质分子量为６２６４４。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证明，这一基因不仅存在于血管平滑肌细胞中，而且也广泛分布在大鼠心、肾、脑、肺和肝组织中。这一基因在ＳＨＲ大鼠的心、肾、脑、肝中低表达，在ＷＫＹ大鼠高表达；血管紧张素ＩＩ、内皮素－１、ＩＬ－１等致血管平滑肌细胞增殖和高血压的因素可以抑制这一基因的表达，其作用可为相应的拮抗剂所阻断；心钠素、降钙素基因相关肽、肾上腺髓质降压素等抑制血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖和降低高血压的因素可以上调这一基因的表达。结论获得了一种新的与血管平滑肌细胞增殖或高血压相关的基因，它可能拮抗ＶＳＭＣ增殖，在高血压的发生中起重要作用。     

人β catenin启动子的克隆及活性分析

目的克隆β catenin基因5′上游1.8?kb启动子,构建启动子 荧光素酶报告基因载体pGL3 1.8?kb,测定其启动子活性,为进一步研究β catenin基因表达调控机制奠定基础。方法采用PCR方法从人基因组DNA中扩增β catenin基因5′上游1.8?kb片段并构建到荧光素酶报道基因pGL3 basic载体中,与内参照质粒pRL Tk共转染前列腺癌PC3细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果PCR扩增的1.8?kb片段经测序正确无误;pGL3 1.8?kb转染PC3细胞48?h后,双荧光素酶活性测定启动子活性（M1／M2）为11.71,是pGL3 control活性的2.43倍,为pGL3 basic活性的206.31倍,为pGL3 promoter活性的21.38倍。结论克隆的β catenin基因5′上游1.8?kb片段具有较强的启动子活性。