应用脂肪干细胞构建小口径组织工程血管平滑肌层的实验研究

目的 探索利用脂肪干细胞在生物反应器内构建组织工程血管平滑肌层的可行性.方法 用抽吸的脂肪获取脂肪干细胞,在生长因子TGF-β1和BMP4作用下诱导成平滑肌细胞,然后将诱导的平滑肌细胞接种于生物材料PGA上形成细胞-材料复合物,将该复合物置于生物反应器内进行培养,在模拟胚胎发育血流动力学的刺激下(搏动频率75次/min,扩展量<5%)构建小口径的血管平滑肌组织.培养8周后,取材做组织学和生物力学检测并与正常血管对比.结果 脂肪干细胞在TGF-β1和BMP4的诱导下,细胞具有平滑肌细胞特有的"波峰-波谷"样生长特点,并表达平滑肌细胞的特异性标记物:α-SMA、SM22α、calponin、SM-MHC;反应器内培养8周后,构建管样组织胶原分泌旺盛,具有一定的力学强度和弹性.结论 利用脂肪干细胞可在体外生物反应器内构建组织工程化小口径血管,为临床上小血管病变的修复提供了一种新的、有效的途径.     

利用脱细胞血管基质体外构建小口径组织工程血管

目的 探讨利用犬的间充质干细胞诱导分化种子细胞,以异种脱细胞血管基质为基础体外构建小口径血管移植物.方法 采用密度梯度离心和贴壁培养的方法从犬骨髓中分离出间充质干细胞并体外培养,诱导分化成内皮样细胞和平滑肌样细胞;采用非离子型去垢剂和胰蛋白酶去除猪颈动脉血管壁结构细胞,对脱细胞基质进行组织学、力学检测及孔隙率评估.在生物反应器内采用旋转种植的方法将犬骨髓间充质干细胞诱导的内皮样细胞种植到脱细胞基质上,体外构建小口径组织工程血管.结果 犬的骨髓间充质干细胞体外能够定向诱导分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞,可以作为血管组织工程的种子细胞.经过脱细胞处理后,光镜和电镜观察证实血管壁的细胞成分完全去除.具有良好的孔径和孔隙率.支架在生物力学、孔隙率等方面符合构建组织工程血管支架的要求.在生物反应器内剪切力条件下可以初步构建出组织工程血管.结论 小口径血管移植物可以将间充质干细胞诱导种子细胞,以异种脱细胞血管支架作为基质,在搏动性生物反应器内培养的方法进行构建.     

脂肪干细胞构建组织工程化角膜基质组织

 目的 探讨以可降解高分子材料聚羟基乙醇（polylactic-co-glycolic acid,PLGA）为支架,复合自体脂肪干细胞构建组织工程角膜基质修复角膜基质层缺损的可行性。方法 兔脂肪干细胞（rabbit adipose derived stem cells,rASCs）培养至第4代接种在PLGA载体支架上,扫描电镜观察细胞在支架上生长黏附情况。体外培养7天后将rASCs-PLGA复合物回植到角膜基质缺损模型的兔角膜基质层间,术后第12周和24周取材行组织学和透射电镜超微结构观察。未接种细胞的PLGA材料移植基质层间作为对照组。结果 细胞在PLGA支架上生长增殖良好,实验组移植术后12周材料降解,角膜基本恢复透明。组织学检查显示移植后24周新生角膜基质样组织与正常角膜基质组织相似,电镜下胶原纤维直径与正常角膜基质组织比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论 脂肪干细胞可作为种子细胞来源用于构建组织工程角膜基质。     

非休眠期成年兔骨髓基质干细胞和脂肪基质干细胞用于核移植构建重组胚

目的研究非休眠期成年兔骨髓基质干细胞和脂肪基质干细胞作为供体,以体外成熟去核兔卵母细胞作为受体进行核移植构建重组胚胎的可行性及囊胚形成率. 方法首先利用新西兰兔骨髓和脂肪为来源分别培养骨髓基质干细胞和脂肪基质干细胞,然后用他们作为核供体,采用卵细胞胞质内直接注射法构建重组胚胎,7 d后比较囊胚形成率. 结果核移植操作后卵细胞存活率达80.0%,骨髓基质干细胞和脂肪基质干细胞作为供体重组胚胎囊胚形成率分别为88/522 (16.9%)和73/464 (15.7%), (P>0.05, Yates corrected). 结论处于非休眠期的成年兔骨髓基质干细胞和脂肪基质干细胞移植到去核卵母细胞后能够进行早期胚胎发育,两者囊胚形成率无明显差别.     

组织工程骨膜成骨的构建及血管化超微结构的观察

目的 用组织工程方法构建组织工程骨,从超微结构观察成骨过程中成骨细胞、血管再生的变化,探讨小肠黏膜下层作为组织工程骨支架材料促进组织工程骨血管化的优越性.方法 应用密度梯度离心法体外分离、培养骨髓基质干细胞,并将成骨诱导骨髓基质干细胞与小肠黏膜下层复合培养2周.未复合细胞的单纯材料作为空白对照.将复合培养细胞与单纯材料分别植入无胸腺裸鼠皮下,扫描和透射电镜观察植入前和植入后4、8、12周成骨细胞、血管生成的变化过程.结果 体外复合培养见细胞在材料上生长、分化、增殖良好,细胞分泌大量的细胞外基质,置入体内后成骨良好,形成大量的血管;12周后材料被吸收,与周围组织无明显界限.单纯材料中央部位有大量小血管及血管内皮细胞增生,其周围多为成纤维细胞,无成骨细胞.结论 小肠黏膜下层作为以骨髓基质干细胞为种子细胞的支架材料,有利于骨的再生和血管化形成,是一种良好的骨组织工程支架材料.     

组织工程骨膜成骨的构建及血管化超微结构的观察

目的用组织工程方法构建组织工程骨,从超微结构观察成骨过程中成骨细胞、血管再生的变化,探讨小肠黏膜下层作为组织工程骨支架材料促进组织工程骨血管化的优越性。方法应用密度梯度离心法体外分离、培养骨髓基质干细胞,并将成骨诱导骨髓基质干细胞与小肠黏膜下层复合培养2周。未复合细胞的单纯材料作为空白对照。将复合培养细胞与单纯材料分别植入无胸腺裸鼠皮下,扫描和透射电镜观察植入前和植入后4、8、12周成骨细胞、血管生成的变化过程。结果体外复合培养见细胞在材料上生长、分化、增殖良好,细胞分泌大量的细胞外基质,置入体内后成骨良好,形成大量的血管;12周后材料被吸收,与周围组织无明显界限。单纯材料中央部位有大量小血管及血管内皮细胞增生,其周围多为成纤维细胞,无成骨细胞。结论小肠黏膜下层作为以骨髓基质干细胞为种子细胞的支架材料,有利于骨的再生和血管化形成,是一种良好的骨组织工程支架材料。     

兔MSCs-PGA复合物在RCCS中的成骨潜能

目的：探讨联合应用兔骨髓基质干细胞（MSCs）、聚乙醇酸（PGA）支架材料和成骨诱导因子在旋转式细胞培养系统（RCCS）中构建组织工程化骨的可行性。方法：利用密度梯度离心法分离培养兔骨髓基质干细胞，采用动力接种方法形成骨髓基质干细胞-PGA支架复合物，以成骨条件培养液为生长介质，在RCCS中进行培养。用趋骨性荧光素四环素标记、茜素红染色以及扫描电镜、透射电镜观察，研究细胞-PGA支架在RCCS中的成骨潜能。结果：组织化学研究显示，兔骨髓基质干细胞-PGA支架结构中RCCS中培养第7d时，茜素红钙质染色呈弱阳性反应，至第21d及28d时，茜素红钙质染色呈强阳性反应。荧光显微锏上，培养组织趋骨性荧光素四环素标记呈现金黄色荧光，荧光亮度与分泌物堆积程度成正相关，与钙质染色阳性反应结果一致。超微结构观察，见骨髓基质干细胞合成分泌胶原纤维，释放基质小泡，并出现钙盐沉积，形成丛毛球状钙球，最终形成骨组织。结论：在旋转式细胞培养系统中，骨髓基质干细胞-PGA支架结构具有形成类似活体骨组织特征的组织工程化骨的潜能。     

异种生物衍生骨与兔骨髓间充质干细胞的体外黏附实验研究

目的:探寻良好的骨组织工程支架材料。方法:以市售新鲜猪股骨制备一种生物骨衍生材料,将材料与兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合培养,扫描电镜下对复合培养过程进行动态观察。结果:异种生物衍生骨具有三维立体多孔结构,并有良好的生物相容性和材料细胞界面。结论:异种生物衍生骨是一种具有临床应用前景、适用于构建组织工程骨的支架材料。     

小肠黏膜下层复合骨髓间充质干细胞体外构建心肌组织薄片的实验研究

目的 探讨利用小肠黏膜下层（SIS）复合骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外构建心肌组织薄片的可行性。方法 将自大鼠骨髓分离培养的BMSCs经5-氮胞苷（5-Aza）诱导培养3周后种植在经脱细胞处理的SIS浆膜面,在体外动态条件下共培养2周,构建组织工程心肌组织薄片,并进行病理组织学、超微结构和免疫组织化学染色观察。结果 与BMSCs体外共培养2周的SIS经苏木精-伊红（HE）染色显示,细胞在SIS上不只局限于材料表层,呈多层分布,部分细胞逐步向深层迁移和渗透。扫描电子显微镜观察发现,细胞较好地在SIS上黏附、生长和迁移,细胞分泌大量的细胞外基质。免疫组织化学染色结果显示,SIS上的细胞为表达α-actin、cTnⅠ和connexin-43的心肌样细胞。结论 在体外将SIS复合经5-Aza诱导的BMSCs,成功地初步构建出组织工程化心肌组织薄片。SIS是一种良好的心肌组织工程生物支架材料。     

生物反应器构建组织工程化血管的初步研究

目的探讨生物反应器内构建具有一定力学强度的组织工程化血管的可行性。方法从6月龄毕格犬的颈总动脉、颈外静脉分别获取平滑肌细胞和内皮细胞，体外培养扩增后，将平滑肌细胞接种于聚羟基乙酸（PGA）上形成细胞-材料复合物，置于生物反应器内（搏动频率75次／min；扩张量〈5％）培养3周，接种内皮细胞继续培养1周后取新生血管，进行大体观察、组织学和免疫组化检测。结果生物反应器内培养的组织工程化血管大体观察具有良好的弹性，管腔圆；平滑肌纤维成分排列规则且有层次感；免疫组化染色显示，平滑肌细胞呈棕黄色层状排列，内皮细胞于血管内侧呈单层排列。结论应用生物反应器可构建具有良好弹性的组织工程化血管。     

偏光显微镜在组织工程血管构建中的应用

目的利用偏光显微镜对组织工程构建血管壁中的胶原成分进行定性分析。方法体外培养、扩增的人脐带动脉平滑肌细胞,将其与可降解生物材料聚乙醇酸(PGA)制成的管状结构结合(实验组),体外培养1周后植入裸鼠背部皮下。于植入后2、4、5、11周时分别取材,普通光镜(HE和Masson染色)及偏光显微镜下观察组织学形态,并比较结果。以无细胞单纯管状PGA-DMEM植入裸鼠背部皮下作为对照。结果偏光显微镜下,随着植入时间的延长,实验组的PGA-平滑肌细胞复合结构从以PGA为主向以胶原和平滑肌细胞为主要成分过渡;对照组则随着PGA的降解无胶原成分形成。偏光显微镜检测结果与光镜下的组织形态学检查结果相同。结论偏光显微镜可用于组织工程血管壁中胶原成分的检测,方法简便且结果可靠。     

构建组织工程血管的支架材料和种子细胞研究进展

国内外学者已对用于构建组织工程血管的支架材料和种子细胞进行了较多的研究,以期研制出能代替自体血管用于临床的血管移植物,它应具备良好的生物相容性、适应性重塑和生长的潜能。虽然组织工程研究已开展30多年并取得一定成果,但是仍有许多问题亟待解决。如何研制出理想的支架材料和选择合适的种子细胞有待进一步研究。综述近年用于构建组织工程血管的支架材料和种子细胞的研究进展。     

糖尿病患者脂肪干细胞（ADSCs）的分离、培养及鉴定研究

目的 建立糖尿病患者ADSCs的分离、培养流程,并检测其生物学标志物与健康人来源ADSCs的差异.方法 取健康人和糖尿病患者脂肪组织,按健康人ADSCs的分离培养流程进行两组细胞的分离、培养;取P3代ADSCs,分别用流式细胞仪检测两组细胞表面标志物CD29、CD44、CD105的表达.结果 糖尿病患者脂肪组织采取和正常ADSCs类似的分离培养流程可以获得呈典型形态的ADSCs,流式细胞仪检测实验组和对照组P3代ADSCs CD29、CD44、CD105均呈阳性表达.结论 成功建立了糖尿病患者来源的ADSCs分离和培养流程,初步证实其具有正常人来源ADSCs的生物学标志物.     

皮肤成纤维细胞构建组织工程化猪角膜基质样组织

目的探讨以皮肤成纤维细胞为种子细胞,在猪角膜微环境中构建组织工程化角膜基质组织的可行性。方法分离获取胎猪皮肤成纤维细胞经体外培养、扩增。通过转染绿色荧光蛋白(GFP)基因标记细胞,示踪细胞的转归。选取第3代的细胞接种于可吸收生物材料聚羟基乙酸(PGA),形成细胞-生物材料复合物,体外培养1周后,移植于猪的角膜基质层内,于第8周取材进行大体、组织学检查及超微结构观察。以角膜基质细胞为种子细胞构建的组织工程化角膜基质组织作为对照。结果术后8周,实验组角膜逐渐恢复透明,与对照组角膜无明显差别。组织学检查显示形成新生的角膜基质样组织,呈板层状,排列较规则,与对照组角膜组织相似。超微结构观察及胶原纤维直径检测显示,实验组与对照组角膜组织差异无统计学意义。荧光显微镜观察到GFP阳性细胞存在。结论皮肤成纤维细胞可能替代角膜基质细胞,在猪角膜内构建角膜基质样组织。     

组织工程骨在颅颌面骨缺损临床修复中的应用

目的 探索人自体骨髓基质干细胞(hBMS6C)为种子细胞的组织工程骨在治疗临床颅颌面骨缺损中的可行性。方法 自1999到2002年问,选择颅颌面骨缺损病11例(外伤性颅骨缺损4例,先天性梨状孔周围骨凹陷畸形7例)进行治疗研究。从患者髂前上棘穿刺取骨髓,密度梯度离心法分离hBMSC,经体外成骨诱导和扩增至第3代。将诱导的hBMSC,与部分脱钙骨(partly demineralized bone mattix,pDBM)复合,并于体外培养一周后,手术回植骨缺损区。选择3例梨状孔凹陷畸形患者,在凹陷明显侧植入hBMSC／pDBM复合物,对侧轻度凹陷区仅植入单纯pDBM。分别于术后1,3,6,12,24,48,50个月进行临床外形和三维CT检查随访。2例患者在Ⅱ期手术时,取少量植入物活检,行组织学(HE染色),免疫组织化学(骨桥蛋白、骨粘连蛋白)检测。结果 患者三维CT检查结果示术后3～6月能形成组织工程化骨,并修复骨组织缺损。术后1～2．5年的随访表明组织工程骨稳定存在,无明显骨吸收现象,临床治疗效果稳定。组织工程骨活检标本HE染色显示其组织学结构与正常松质骨相同,并有典型软骨内化骨现象。免疫组织化学显示有骨桥蛋白、骨粘连蛋白阳性表达。而植入的单纯部分脱钙骨于术后3～6月吸收,组织学显示为脱钙骨降解碎片和纤维组织的混合物。结论 以自体hBMSC为种子细胞,利用组织工程技术可在人体内形成稳定的工程化骨组织,并临床修复颅颌面骨组织缺损。这项研究的结果为组织工程骨的临床大规模应用奠定了坚实的基础。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养与鉴定

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)体外分离培养、鉴定条件及方法,探讨其作为种子细胞构建血管化组织工程皮肤可行性.方法 用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,筛选贴壁细胞培养并传代.观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,检验细胞CD44、CD29、CD14、CD45等表面标记.采用定向诱导分化方法体外鉴定hBMSCs...     

兔脂肪干细胞(ADSCs)与聚羟基乙酸/壳聚糖(PLGA/CS)支架材料生物相容性研究

 目的  探讨兔脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)作为种子细胞复合新型聚羟基乙酸(polylactic-co-glycolic acid,PLGA)/壳聚糖(chitosan,CS)支架材料的生物相容性,为进一步构建组织工程化脂肪组织提供实验依据。方法  取雄性新西兰大白兔腹股沟脂肪组织,Ⅰ型胶原酶消化分离出ADSCs进行培养,贴壁细胞至3~5代,评价其多向分化能力。将干细胞收集重悬后,以l×107/mL的密度接种于多孔PLGA/CS支架,形成细胞 支架材料复合物。培养7天后,扫描电子显微镜观察细胞在支架材料上的黏附生长和基质分泌情况,评价细胞与支架材料的生物相容性;Dil荧光标记检测细胞在支架材料上的分布;Hochest 33258检测细胞在支架上的生长情况。接种1和7天后,分别对细胞 材料复合物行Annexin V/PI双染色法检测材料对细胞的毒性作用。用成脂诱导条件培养基诱导分化ADSCs及ADSCs支架材料复合物,7天后,尼罗红荧光染色液检测ADSCs在不同环境下的成脂分化能力。结果  原代培养的ADSCs呈成纤维细胞样外观,在相应诱导条件下能够分化为脂肪细胞和骨细胞。细胞接种于PLGA/CS支架材料上第8天分裂增殖达到高峰,扫描电子显微镜下提示ADSCs在支架表面贴附生长良好,并向孔隙内壁充分延伸,细胞周围形成丰富的基质成分。活死双染结合共聚焦显微镜显示材料对细胞活性无影响,尼罗红染色可见成脂诱导后的ADSCs细胞质内有红色脂滴颗粒形成。结论  多孔PLGA/CS支架与兔ADSCs具有良好的生物相容性,可作为构建组织工程脂肪组织的支架材料。     

人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化

目的 通过成人脂肪体外分离培养脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）研究其生理特性及在特定培养条件下向成骨分化,探讨脂肪源性干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景.方法 从成人脂肪中利用胶原酶消化法分离并体外培养干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CCK8检测细胞活性,P3代脂肪干细胞通过成骨诱导液诱导向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶（AKP）,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OP）表达变化.结果 成人脂肪间质来源的ADSCs,能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞检测证实其特异表达相关干细胞表面标记物;成骨诱导后表现出呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性,茜素红染色阳性,诱导培养0、3、7、14、21、28天后RT-PCR定量检测证实细胞中ALP、OP阳性表达.结论 成人脂肪中可分离得到ADSCs,其稳定表达特异性的表面抗原,并且经过相应诱导培养后可向骨细胞分化,阳性表达OP、ALP,可作为优良的骨组织工程的种子细胞来源.