组织工程真皮抗张强度的初步研究

目的 采用高敏度小张力膜状生物材料力学性能测定仪检测组织工程真皮的抗张强度。方法 分别培养含有不同数量成纤维细胞的胶原凝胶和复方壳多糖真皮替代物，15d后检测抗张强度。结果 组织工程真皮抗张强度随成纤维细胞数量增多而增强（P〈0．01），复方壳多糖人工真皮的抗张强度高于胶原凝胶真皮（P〈0.01）。结论 复方壳多糖真皮替代物具有良好的抗张强度，为临床应用提供稳定机械性能。     

组织工程皮肤分泌细胞因子的初步研究

目的研究组织工程皮肤培养液中IL-1β、IL-6和IL-8的分泌情况.方法收集组织工程皮肤制备过程中单层成纤维细胞(fibroblast,FB)培养液、胶原凝胶真皮替代物(dermal equivalent, DE)、复合壳多糖DE和复合壳多糖皮肤替代物(skin equivalent, SE)培养液标本,ELISA法检测其中IL-1β、IL-6和IL-8分泌量.结果复合壳多糖真皮基质促进FB、角质形成细胞(keratinocyte KC)分泌IL-6、IL-8.SE分泌的IL-6、IL-8在DE加KC之后和SE形成分层表皮时形成两个高峰.结论 FB、KC在壳多糖组织工程皮肤中混合器官型培养时分泌IL-6和IL-8较明显,这些细胞因子可在创面愈合中发挥重要作用.     

四种真皮替代物的制备和比较研究

目的 通过调整复合壳多糖真皮替代物的组分，比较不同配方获得的真皮替代物的组织学特性的异同。方法 在无菌条件下将浓缩的DMEM培养基、小牛血清、鼠尾胶原溶液、糖胺聚糖和壳多糖按比例配制成凝胶溶液，然后将成纤维细胞与上述凝胶溶液混合制成真皮替代物(替代物A)。以A为标准，缺如成纤维细胞为替代物B，缺如壳多糖为替代物C，缺如壳多糖和成纤维细胞为替代物D。比较A、B、C、D四种替代物的生物学特性，并在培养半个月时作组织学检查。结果 四种替代物以C收缩率为最大，A其次，B、D两种替代物几乎无收缩，组织学上A、C未见明显差异，B可见均匀的蜂窝状结构，D结构无序。结论 A复合壳多糖真皮替代物配方是四种真皮替代物中生物学特性最为理想的一种，可以在组织工程研究中发挥重要作用。     

人工皮肤培养模型的建立

模拟体内生理条件,采用细胞三维培养技术将角朊细胞接种在一活性真皮替代物（即成纤维细胞胶原凝胶）上,然后行气液界面培养,使角朊细胞的一些正常生长和分化的特殊提以再现,从而形成一种能应用于临床的人工皮肤。而且这一培养模型使角朊细胞、成纤维细胞和细胞外基质构成了一有机的整体,因而也是研究表皮分化、其表皮间相互关系的良好模型。     

应用胶原蛋白构建组织工程皮肤的实验研究

目的 探讨以胶原蛋白为支架构建组织工程皮肤的体外培养理想方法.方法 体外分离、培养、鉴定角朊细胞和成纤维细胞;利用本室自制胶原蛋白,制备胶原凝胶和胶原海绵两种组织工程支架;在成功构建人工真皮的基础上,种植角朊细胞,构建人工复合皮肤,并进行组织学及免疫组化检查.结果 制备的胶原海绵孔径平均100～150μm,孔隙率89%,组织相容性良好;两种皮肤替代物免疫组化染色显示Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白(FN)和层粘连蛋白(Laminin)阳性,HE染色可见均具有表皮和真皮双层结构,厚度约3mm,在形态结构上与正常皮肤相似.结论 培养的人角朊细胞和成纤维细胞种植于胶原蛋白支架上气-液界面培养可构建出具有类似天然皮肤结构的组织工程皮肤.     

以组织工程技术构建活性双层人工皮肤

用冷冻干燥胶原凝胶方法制备胶原海绵,经戊二醛交联处理,作为活性双层人工皮肤的支架;以幼儿包皮为细胞来源获得真皮成纤维细胞和皮肤角质细胞,体外扩增后作为种子细胞;在胶原海绵上接种成纤维细胞和角质细胞,体外构建活性双层人工皮肤。研究结果表明,人工真皮内的成纤维细胞生长良好,并且有人纤粘连蛋白类生物活性物质存在,活性双层人工皮肤表皮层有类似干天然皮肤表皮层的组织结构。     

胶原凝胶真皮构建及其性质测定

目的为了改进组织工程化人工皮肤的生物学性能。方法改进Hansburgh和Middelkoop制备人工真皮的方法,应用I型胶原酶和中性蛋白酶Dispase分离得到新生儿真皮成纤维细胞,并将其种植于胶原溶胀液,成功构建凝胶真皮,并检测了其力学及生物学性能。结果胎儿真皮成纤维细胞在凝胶真皮中增殖速度快、活性高、分泌细胞外基质丰富。结论凝胶真皮的生物学性能优于传统胶原海绵人工真皮。     

以表皮细胞及脱细胞真皮构建组织工程皮肤

目的 体外扩增培养表皮细胞，复合脱细胞真皮构建组织工程皮肤，以促进其进一步临床应用。方法 将人表皮细胞进行体外培养扩增后，以生长良好的表皮细胞接种于制备好的异种（猪）无细胞真皮支架上，行气液界面联合体外培养，构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及复合皮结构。结果 培养的表皮细胞扩增良好，脱细胞真皮支架去细胞完全，表皮细胞在脱细胞真皮上可以生长，可体外构建复合皮肤。结论 利用体外扩增的表皮细胞及制备的脱细胞真皮可体外联合构建具有复层结构的组织工程皮肤。     

复合培养人工皮肤的制备

复合培养人工皮肤的制备应用基础医学研究所马刚＊杨同书颜炜群张林＊侯立中用Ｄｉｓｐａｓｅ、胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ消化分离、培养表皮角月元细胞和成纤维细胞，分别接种到胶原网架上，培养１周后改为液气界面培养。所得到的培养皮肤在组织学上于第１周时表皮呈单层；第２...     

4种支架构建复合式口腔黏膜的组织学特点

目的利用4种不同支架材料构建复合式口腔黏膜,并比较其组织结构特点。方法体外培养人口腔黏膜的成纤维细胞和角质形成细胞,在4种支架材料中加入成纤维细胞,培养7d后,在支架表面加入角质形成细胞,培养4d后,移至气-液界面继续培养7d。苏木精-伊红染色镜下观察构建的复合式口腔黏膜的组织形态学特点。结果 4种支架均可构建形成复层上皮。其中,上皮层与脱细胞真皮基质材料(de-epidermised dermis,DED)结合紧密,形成的人工黏膜有明显的上皮钉突。不同于以往报道,上皮层与Alloderm结合并不十分紧密。以胶原凝胶为基质形成的人工口腔黏膜最厚,有明显分层。以胶原海绵-胶原凝胶为基质形成的复层上皮在部分区域长入至胶原海绵的空隙中。结论以DED和胶原凝胶为支架构建的口腔黏膜更接近于天然结构,而后者脆性较大,限制了其临床应用的可能。     

复合壳多糖人工皮肤的初步实验研究

目的探讨复合壳多糖人工皮肤移植家兔后表皮层角蛋白的表达以了解移植后皮肤表皮的分化情况.方法分别将复合壳多糖人工皮肤移植前、移植后1个月、移植后2个月、正常人皮肤、正常兔皮肤石蜡块切片,用抗广谱角蛋白多抗、抗角蛋白K5和K10单抗进行免疫组化染色,观察表皮层角蛋白的表达和表皮分化情况.结果复合壳多糖人工皮肤移植后1个月及2个月表皮层均有较强的角蛋白表达,与正常皮肤相似;基底层以上细胞有角蛋白K10表达,且越接近表皮表面表达越强,与正常人皮肤相似,基底层细胞有角蛋白K5表达,但明显弱于正常人皮肤.结论复合壳多糖人工皮肤移植家兔后表皮层均有角蛋白表达,有增生性细胞和分化细胞,表皮分化良好、层次清楚,与正常皮肤相近.     

异体表皮与异体复合皮移植的初步观察

目的：对比研究非培养的异体表皮与培养的异体表皮细胞膜片，以及异体真皮交叉移植于ＳＤ大鼠与Ｗｉｓｔａｒ大鼠后是否产生免疫排斥反应。方法：采用大体观察、组织学检查，和混合淋巴细胞反应。结果：非培养的异体表皮移植，培养的异体表皮细胞膜片单独移植，以及与异体真皮重组移植后均产生免疫排斥反应，三者出现排斥坏死的平均时间分别为１０．５ｄ，１２．０ｄ，１５．８ｄ，异体真皮能存活３０ｄ以上。结论：异体表皮抗原性强     

Influence of human fibroblasts on development and quality of multilayered composite grafts in athymic nude mice

In patients after extensive burn injury the lack of split thickness skin graft donor sites, and consecutive delay in wound closure are critical factors of morbidity and mortality. In addition limited functional and aesthetic results after transplantation of split thickness skin grafts present a socioeconomic problem. For improved wound closure the aim of this study was the development of a one stage technique for the establishment of a multi layer composite graft, existing of a collagen-GAG-matrix with silicon layer of a two layer synthetic dermal equivalent (DE) with integrated fibroblasts, and ceratinocytes. - In 64 athymic nude mice the evaluation of the multi layer skin grafts potential to re-establish a human epidermis, and high quality dermal structure was performed. In addition to clinical investigations we measured wound contraction, and analyzed histomorphologic, immunohistologic, "in situ hybridisation", and electro microscopic data. - Our results show, that the seeding of DE with human fibroblasts and ceratinocytes as a composite skin graft reproducible enabled a wound healing with an organised human dermis and epidermis within 10 - 15 days. The histological studies of the grafted composite skin grafts in this model showed morphologically a characteristic dermal-epidermal skin structure with a cornifying epithelium, being of human origin ("in situ hybridisation"). Through the co-cultivation of fibroblasts and ceratinocytes in the DE the generation and structural morphology of collagen fibres, and inflammatory reaction in the neodermis is positively influenced, and as a consequence wound contraction significantly reduced. In regard to the early preparation of composite grafts, and the minimal requirements for donor sites - with dependable stable reconstruction of the integument - this technique may present a step forward in the treatment of patients with extensive burns.     

组织工程化皮瓣的构建

目的应用脂肪组织来源干细胞(ASCs)在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组织工程化皮瓣。方法(1)构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。(2)构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮细胞(Kc)和成纤维细胞(Fb)。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液界面继续培养10 d形成复合皮。(3)构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果(1)ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。(2)经过气-液界面培养后,Kc成层分化,形成基底上层。(3)组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组装培育,可构建出组织工程化皮瓣。     

异体真皮对复合皮功能重建的作用研究

目的 :探讨异体真皮对复合皮功能重建的作用。方法 :大鼠动物模型分为两组。组 1,在大鼠背部创面移植自体角朊细胞膜片 (CKS) ;组 2 ,在大鼠背部创面重叠移植异体真皮和自体CKS。小香猪动物模型分三组 :A组为异体普通乳猪真皮 +成年小香猪自体表皮皮片 ;B组为异体成年真皮 +成年小香猪自体表皮皮片 ;C组为成年小香猪自体表皮皮片。术后观察皮片的存活质量及组织学变化。结果 :大鼠中 ,组 1质地及组织学结构欠佳 ,且太薄易破溃和收缩。组 2不仅移植物成活好 ,且质地、组织结构、创面收缩及抗磨损等方面均优于组 1。小香猪组中 ,根据皮片的成活率、收缩率、瘢痕增生和组织结构的完整性等情况进行综合分析 ,皮片质量的优劣依次是A组 ,B组 ,C组。结论 :异体真皮的存在能显著改进复合皮移植的质量     

人毛囊细胞来源双层皮肤替代物的构建和组织学特征

目的 探索人毛囊细胞构建的双层皮肤替代物的组织学特征.方法 用毛乳头细胞、真皮鞘细胞分别与外根鞘细胞构建复合壳多糖双层皮肤替代物,分析其体外和移植至大白鼠后的组织学特征.结果 毛囊来源细胞构建的皮肤替代物中表皮细胞排列更紧密、角化突出,真皮内可见与表皮相连的上皮细胞柱及球形膨大细胞团形成.结论 毛囊细胞是构建皮肤替代物的良好细胞来源.     

组织工程构建人工食管的初步实验研究

目的：初步探讨组织工程制备可降解人工食管的可行性。方法：体外分离、培养、扩增新生牛食管上皮细胞，接种于海绵状胶原蛋白-壳聚糖膜上，然后移植入裸鼠背阔肌表面，通过组织学及扫描、透射电镜观察食管上皮细胞在体内外的增殖与分化情况。结果：培养的新生牛食管上皮细胞在胶原蛋白-壳聚糖膜表面生长良好，食管上皮细胞-胶原蛋白-壳聚糖膜复合物植入裸鼠背阔肌表面2周，食管上皮细胞可进一步分化至10层，术后4周胶原蛋白-壳聚糖膜已被降解吸收。结论：海绵状胶原蛋白-壳聚糖膜是组织工程构建可降解人工食管的优良基质材料。     

毛囊球部细胞体外在胶原/壳聚糖多孔支架上形成皮肤样结构的研究

目的:观察毛囊球部细胞种植到胶原/壳聚糖多孔支架上皮肤重建情况.方法:采用细胞培养技术和细胞支架种植技术,将培养的毛囊球部细胞种植到胶原/壳聚糖多孔支架上,HE染色观察皮肤样结构形成情况,并作免疫组织化学鉴定,以证明细胞的来源属性.结果:毛囊球部细胞种植到胶原/壳聚糖多孔支架上可见皮肤样结构形成,表皮部分细胞分化良好,排列复层整齐,有角化现象,高分子与低分子角蛋白表达阳性.结论:低传代培养的毛囊球部细胞在体外胶原/壳聚糖多孔支架上可诱导皮肤样结构形成.     

L-谷氨酸/壳聚糖聚合物为支架的脂肪来源干细胞构建人造皮肤对糖尿病性损伤的加速愈合作用研究

研究背景 糖尿病性损伤如糖尿病足是糖尿病最严重的并发症之一。目前对慢性不愈合的糖尿病损伤尚没有明确有效的治疗方法。本研究探索应用以L-谷氨酸/壳聚糖为支架的人类脂肪来源干细胞构建的人造皮肤的可行性,这在链脲霉素致糖尿病的小鼠不愈合损伤的治疗上尚存很大争议。 方法 脂肪来源干细胞获得自新鲜的人体抽脂术,并间接体内扩增,之后植入L-谷氨酸/壳聚糖支架构建人造皮肤。将人造皮肤、单纯支架组织分别植于糖尿病模型小鼠损伤部位,并与正常小鼠及不处理糖尿病小鼠对比。同时分析人造皮肤的VEGF、TGFβ1表达,组织学指标,皮肤厚度和胶原含量。 结果 生长于支架的细胞显示了良好的增殖潜力和充分的基质胶原沉积,同时VEGF和TGFβ1保持较高的水平。人造皮肤治疗的糖尿病损伤相较单纯支架或者不处理的损伤明显愈合增速。组织学检查也显示皮肤修复提高。定量分析进一步显示人造皮肤厚度和胶原含量的增加。 总结 ASCs/ PLGA人造皮肤能有效促进糖尿病损伤愈合,其机制可能是血管生长因子和胶原合成的增加。     

去牛血清清蛋白化对复方壳多糖组织工程皮肤单向混合淋巴细胞反应的影响

目的探索复方壳多糖组织工程皮肤去牛血清清蛋白化的洗涤方法及对其单向混合淋巴细胞反应的影响。方法从头制备复方壳多糖组织工程皮肤,ELISA法检测不同洗涤条件下外渗液中牛血清清蛋白的浓度,然后检测在最优洗涤条件下组织工程皮肤单向混合淋巴细胞反应的强度。结果当洗涤间隔时间为3h,洗涤次数为2次时能使外渗液中牛血清清蛋白的浓度降到50ng/mL以下;按该方法洗涤后,组织工程皮肤的单向混合淋巴细胞反应强度显著降低。结论复方壳多糖组织工程皮肤以3h×2次洗涤,能够显著降低其外渗液中牛血清清蛋白的浓度及其单向混合淋巴细胞反应的强度。