携带blaoXA-58的鲍曼不动杆菌的克隆相关性分析

目的 了解三甲医院携带碳青霉烯酶基因blaoXA-58的鲍曼不动杆菌的检出率和菌株克隆相关性,为临床合理使用抗菌药物和制定恰当的感染控制措施提供理论依据.方法 收集四川大学华西医院非重复鲍曼不动杆菌临床分离株.菌种的鉴定通过recA基因测序鉴定.PCR检测菌株的固有碳青霉烯酶基因blaOXA-51/66和获得性碳青霉烯酶基因blaOXA-58.用肠杆菌科基因间重复序列-聚合酶链反应分型技术(ERIC-PCR)、多位点序列分型技术(MLST)和脉冲场凝胶电泳分型技术(PFGE)对blaOXA-58阳性的菌株进行克隆相关性分析.结果 经recA和blaOXA51/66检测证实有115株鲍曼不动杆菌临床分离株.其中,9株对亚胺培南敏感性下降[最小抑菌浓度(MIC)≥2 mg/L]的菌株携带有blaOXA-58,占7.8％.其ERIC-PCR指纹图谱相似.MLST分型结果显示有8株菌属于ST-95型,1株菌属于ST-75型.8株ST-95型鲍曼不动杆菌的PFGE图谱显示为同一个克隆,分属于两个差异很小的亚型.结论 我院部分对碳青霉烯敏感性下降的鲍曼不动杆菌临床分离株携带有获得性碳青霉烯酶基因blaoXA-58.blaoXA-58阳性的鲍曼不动杆菌在我院主要以克隆性播散为主.     

难测序噬菌体基因组PaP1的大片段克隆及测序

目的采用大片段克隆策略对难测序铜绿假单胞菌噬菌体PaP1基因组进行克隆及测序.方法用限制性内切酶AatⅡ将噬菌体PaP1基因组DNA切成几个大片段,分别进行末端修饰后与线性化的大片段克隆载体pYLTAC7连接,将连接产物电转化感受态细胞,筛选阳性克隆进行测序.结果 AatⅡ将PaP1基因组切成8个片段,通过大片段克隆共获得3个阳性克隆,测出插入片段大小分别为9 805、8 335 bp和3 465 bp,使该难测序基因组的测出量达到47 757 bp.结论大片段克隆策略能够克服鸟枪法测序的不足,将有望获得噬菌体PaP1的全基因组序列.     

成人GHD患者的血清瘦素、脂联素、内脂素水平及相关性研究

【摘要】 目的了解三甲医院携带碳青霉烯酶基因blaOXA-58的鲍曼不动杆菌的检出率和菌株克隆相关性,为临床合理使用抗菌药物和制定恰当的感染控制措施提供理论依据。方法收集四川大学华西医院非重复鲍曼不动杆菌临床分离株。菌种的鉴定通过recA基因测序鉴定。PCR检测菌株的固有碳青霉烯酶基因blaOXA-51/66和获得性碳青霉烯酶基因blaOXA-58。用肠杆菌科基因间重复序列-聚合酶链反应分型技术(ERIC-PCR)、多位点序列分型技术(MLST)和脉冲场凝胶电泳分型技术(PFGE)对blaOXA-58阳性的菌株进行克隆相关性分析。结果经recA和blaOXA-51/66检测证实有115株鲍曼不动杆菌临床分离株。其中,9株对亚胺培南敏感性下降〔最小抑菌浓度(MIC)≥2mg/L〕的菌株携带有blaOXA-58,占7.8%。其ERIC-PCR指纹图谱相似。MLST分型结果显示有8株菌属于ST-95型,1株菌属于ST-75型。8株ST-95型鲍曼不动杆菌的PFGE图谱显示为同一个克隆,分属于两个差异很小的亚型。结论我院部分对碳青霉烯敏感性下降的鲍曼不动杆菌临床分离株携带有获得性碳青霉烯酶基因blaOXA-58。blaOXA-58阳性的鲍曼不动杆菌在我院主要以克隆性播散为主。     

大肠癌相关基因ST13转录启动区的增强子研究

目的:探讨大肠癌相关基因ST13上游5'近端调控区(-595～ 74)中增强子碱基序列.方法:设计系列缺失PCR引物,扩增ST13基因5'近端碱基序列片段,pGEMT-EASY克隆、测序,再亚克隆到pGL2系列瞬间报告载体上,等量转染SW620细胞,检测荧光酶活性.结果:系列扩增碱基序列片段669 bp、263 bp、163 bp对pGL2-Basic中的荧光素酶基因均具有较强的启动表达作用,片段101 bp、47 bp则几乎没有启动下游基因表达的作用.而101 bp片段与系列报告载体pGL2重组的分子,在其中含有启动子的报告基因表达载体中具有明显的增强作用(P＜0.01),但作用强度小于阳性对照pGL2-Control(P＜0.05).结论:位于ST13基因上游5'近端调控区的碱基序列101 bp片段(-595～-494),是一个基因转录调控增强子.     

6个弓形虫新基因的克隆与分析

目的 :克隆并分析弓形虫新的抗原基因 ,为弓形虫病疫苗的研制提供有效的候选抗原分子。方法 :以弓形虫RH株速殖子感染大鼠血清作为探针筛选弓形虫cDNA文库 ,对阳性克隆的插入片段进行PCR扩增及DNA序列测定。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白质的结构与功能。结果 :共筛选出 13个阳性克隆 ,其插入片段大小分别为 0 .4 5～ 2 .4kb。通过测序分析 ,其中新基因L3,L6 ,L7和L13分别编码 4 9,5 9,16 0和 76个氨基酸组成的非跨膜蛋白 ;新基因L11和L12基因分别编码 5 5 0和 114个氨基酸组成的跨膜蛋白。结论 :阳性克隆的筛选和鉴定可为抗弓形虫病疫苗的研制奠定基础     

肺癌相关抗原的血清学筛选与鉴定

目的:筛选和鉴定肺癌肿瘤相关抗原,为肺癌早期诊断提供血清学标志物,并为研制肺癌疫苗提供候选抗原.方法:5份异体肺癌患者血清采用重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)技术对肺癌cDNA表达文库筛选;对阳性克隆插入片段进行测序、生物信息学分析.结果:①筛选出70个阳性克隆,插入片段大小为300～2 800 bp.②测序:70个阳性克隆代表63个不同的基因.③生物信息学分析:1个基因与肺癌的发生、发展关系密切;34个基因报道与细胞的分化、代谢及信号转导等有关系,与其他肿瘤的发生、发展有关;26个基因的生理功能未见文献报道;2个插入片段未发现有同源基因,推测可能为新发现的基因.结论:使用SEREX技术成功鉴定了一组肺癌相关的肿瘤抗原.     

限制性显示-聚合酶链反应扩增苏云金杆菌基因片段的克隆与分析

目的运用限制性显示-PCR技术(RD-PCR)扩增苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)基因片段,并进行克隆、测序分析。方法设计特异性引物扩增长片段Bt基因,对扩增产物进行RD-PCR扩增,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体并进行快速鉴定。提取阳性克隆质粒进行测序分析。结果运用RD-PCR技术,将长片断的基因(2 000-3 000 bp)分为多个短的片段,片段长度较为均一(200~600 bp)。测序结果表明,所扩增的片段均属于特异扩增的Bt基因。结论运用RD-PCR技术可以将长片段基因进行片段化,使其适用于基因芯片的探针。     

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药基因检测与分子流行病学研究

目的 对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)耐药基因的携带情况与分子流行病学特征进行分析,为研究细菌耐药提供参考依据.方法 收集2016年2月至2017年2月临床分离到的37株CRKP菌株,采用微量肉汤稀释法检测菌株药物敏感性;改良霍奇实验及亚胺培南-EDTA协同法检测碳青霉烯酶表型;PCR检测KPC-2、VIM、NDM-1、OXA-48等耐药基因,进行测序及网上比对确定基因型;采用多位点序列分型(MLST)对菌株进行遗传相关性研究,MEGA软件构建进化树、eBURST软件分析亲缘关系.结果 37株菌株对常用抗菌药物耐药性均在90％以上.所有菌株均检测到KPC-2基因,3株同时携带NDM-1基因,其余基因均为阴性.MLST分型为ST11有25株,ST524 2株,ST789 4株,ST35、ST29、ST1066及ST244各1株,另外有1个新的ST型(2株)已被PubMlst数据库确认收录并命名为ST2792.ST11型组及非ST11型组在年龄、性别、感染途径、抗菌药物使用情况等方面差异无统计学意义(P＜0.05).结论 携带KPC-2基因是导致细菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要原因,ST11型是最流行的克隆型.     

真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1构建及意义

目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1.方法:通过PCR扩增FGFR1目的片段,双酶切纯化PCR产物及pcDNA3.1a,将扩增的FGFR1基因片段插入pcDNA3.1a线性质粒,即构建成pcDNA3.1a-FGFR1真核表达质粒,将质粒转化感受态DH5α菌株,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及测序鉴定.结果:酶...     

带有不同亚型HPV L1基因片段的哺乳动物细胞克隆的建立

目的构建携带HPV亚型L1基因片段的标准细胞株.方法根据HPV通用引物GP5 /GP6 ,用重叠延伸PCR方法合成HPV亚型L1基因中约150 bp片段;插入真核细胞表达载体EGFP-N1,用脂质体转染SPC细胞,筛选以获得带有不同HPV L1基因片段细胞克隆,并用定量PCR方法确认.结果重叠延伸PCR后得到约150 bp的基因片段,测序结果经BLAST比对,分别与相应HPV亚型公开报告序列一致;将所获片段与EGFP-N1载体连接后酶切及测序鉴定正确;经筛选获得了携带HPV6、11、16、18、31、35亚型L1基因片段的细胞株;并用定量PCR方法进行了确认.结论成功构建了带有不同HPV亚型L1基因片段的30个亚克隆和6个细胞株,为进一步的HPV分型检测研究提供了保证.     

广东省人感染猪链球菌2型10株病原学特征

目的分析广东省2005-2006年分离的10株2型猪链球菌菌株的病原学特征，为诊断、治疗和制定今后防控措施提供科学依据。方法对10株菌进行常规方法鉴定及PCR技术检测。结果经血清学分型和生化鉴定，10菌株均为猪链球菌2型，其中9株菌三种基因（菌种基因（16SrRNA）、荚膜多糖编码基因（CPS2J）和溶菌酶释放相关蛋白基因（mrp））均阳性，1株菌mrp基因检测阴性。结论广东省人感染猪链球菌病由2型猪链球菌引起。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MLST 联合SCCmec 基因分型与耐药性分析

目的 了解滨州医学院附属医院MRSA 菌株多位点序列分型（MLST）联合SCCmec 基因型分布 和各种基因型的耐药特征。方法 采用聚合酶链反应（PCR）对MRSA 菌株进行MLST 联合SCCmec 基因分型； 采用WalkWAY96PLUS PC33 药敏板检测MRSA 抗菌药物敏感性。结果 SCCmec 基因分型结果以Ⅲ型为 主（63/67 株，占94.03%），MLST 分型共检测出6 种基因型：ST 88、ST 121、ST 221、ST 82、ST 239 及ST 399， 其中以ST 239（61/67，91.04%）为主，耐药性分析显示SCCmec Ⅲ型MRSA 菌株表现为多重耐药。结论 ST239-MRSA-SCCmec Ⅲ型菌株为鲁北地区MRSA 主要流行菌株，该型菌株对多种抗生素呈多重耐药； MLST 联合SCCmec 基因分型方法是MRSA 遗传背景研究简便快速的方法。     

ICU病房血流感染白色念珠菌的多位点序列分型研究

目的调查四川大学华西医院ICU病房白色念珠菌血流感染现状,探讨其分子流行病学特征。方法收集2009～2011年四川大学华西医院全院送检的血培养分离所得白色念珠菌。对ICU病房血流感染白色念珠菌采用多位点序列分型(multilocus sequencing typing,MLST)分析菌株间的亲缘关系。结果 2009～2011年华西医院送检的血培养标本共分离念珠菌135株,以白色念珠菌为主(51株,37.8%)。进行MLST分型的17株白色念珠菌来自ICU病房的15名患者,标本来源包括外周血15份,中央静脉导管2份(有两名患者分别取外周血和中央静脉导管各1份且均培养出白色念珠菌)。17株菌经MLST分型得到15个序列型(sequence type,ST),其中3株菌具有相同的ST型,另外14株菌分别具有14个不同ST型。经聚类分析,5株菌(29.4%)归为Group 46克隆组,2株菌(11.8%)归为Group 47克隆组,其余10株菌为单体型。分离自同一患者外周血和中央静脉导管的2株菌(Calb-36和Calb-40)经MLST分型证实是同一克隆株。结论白色念珠菌为华西医院念珠菌血症的首要致病菌。ICU病房血流感染白色念珠菌的主要流行株属于Group46和Group47克隆组。我院ICU病房目前尚不存在白色念珠菌血流感染的暴发流行,但有导管相关性白色念珠菌血症的感染发生。     

广东省茂名市副溶血弧菌涉水产品分离株病原学特征

目的 了解茂名市涉水产品中副溶血弧菌分离株的病原学特征。方法 对茂名市食品安全风险监测中分离到的副溶血弧菌进行血清分型、抗生素敏感性实验、毒力基因检测、脉冲场凝胶电泳( PFGE) 分子分型和多位点序列分型（MLST）。结果 2017—2018年共分离到涉水产品中副溶血弧菌分离株44株,O型共分7个血清型,无明显优势血清型。44株分离株除对氨苄西林和头孢唑林表现出高度的耐药性外,对其它抗生素均敏感,未发现有分离株携带tdh和trh基因。44株分离株分成44种不同的PFGE带型,MLST分型发现有30个新的ST型,呈现一定的遗传多样性。结论 广东省茂名市涉水产品中副溶血弧菌分离株血清型别多样,对大部分的抗生素敏感,均未发现携带tdh和trh 基因,且呈现一定的遗传多态性,需要继续加大监测的力度和范围。     

Nosocomial spread of hospital-adapted CC17 vancomycin- resistant Enterococcus faecium in a tertiary-care hospital of Beijing, China

Background  The incidence of vancomycin-resistant enterococci (VRE) appeared to be increasing in China, but very few nosocomial outbreaks have been reported. Our hospital had experienced an outbreak of VRE since March 2008 to March 2009. The objective of this study was to analyze the molecular features of the isolates and the control measures used to eradicate a VRE outbreak in a tertiary institution in China.

Methods  We characterized VRE isolates from 21 infected and 11 colonized inpatients from a single hospital by pulsed field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST), the analysis of Tn1546-like elements and virulence genes detection. Infection control measures, including more environmental disinfection, screening for VRE colonization, contact precautions, education and strict antibiotic restriction, were implemented to control the outbreak.

Results  During the outbreak, a total of 32 VRE strains were obtained. There were 21 strains found in Emergency Intensive Care Unit (EICU), 9 isolates from Geriatric Ward, and two from other units. All the isolates harbored the vanA gene, however, four of them exhibited the VanB phenotype. Meanwhile, MLST analysis revealed that all isolates belonged to clonal complex (CC) 17. With the infection-control measures, the epidemic was constrained in two units (EICU and Geriatric Ward). After March 2009, no further case infected with VRE was detected in the following one-year period.

Conclusion  The outbreak was controlled by continuous implementation of the infection control programme, and more rigorous infection control policy is needed.

     

4例多重耐药非伤寒沙门菌的耐药基因和分子分型

目的 研究中山市多重耐药非伤寒沙门菌株的耐药基因和分子分型特征。 方法 分析2015年7月中山市博爱医院培养出的4例多重耐药NTS菌株的药敏结果,并且对该4例菌株进行脉冲场凝胶电泳分型（PFGE）多位点序列分型技术（MLST）和全基因组测序分析（WGS）,并在此基础上对4例菌株进行差异性分析,量化菌株之间的遗传发育距离,确定病例菌株之间的关系。 结果 4例菌株均为鼠伤寒沙门菌变种,并且均为多重耐药菌株,菌株S2、S3和S4药敏结果几乎相同,与S1差异较大。PFGE可将4例菌株分为两个大组（组A和组B）,菌株S2、S3、S4落到同一个大组B中,菌株S2、S3、S4抗原式相同并均与S1有差异;MLST发现菌株S1为ST19型,菌株S2、S3、S4为ST34型。菌株S1抗药基因谱与菌株S2、S3、S4差异大,菌株S2、S3和S4 均有blaCTX-M-55基因。菌株S2、S3和S4的WGS形似度非常高,几乎可确定为同一来源。 结论 4例多重耐药菌株均为鼠伤寒沙门菌变种,菌株S2、S3和S4为同一来源。 blaCTX-M-55基因可能是造成本次中山市NTS多重耐药的主要原因之一。     

猪链球菌2型感染的临床特征和治疗效果分析

目的 分析猪链球菌2型感染部分病例的临床特征及治疗效果.方法 回顾分析68例2005年夏季四川省猪链球菌2型感染的临床及病原学确诊的患者资料,从流行病学、临床特征及治疗效果等方面进行总结和分析.结果 猪链球菌2型感染流行于6～8月,传染源主要为猪,易感人群主要为农民,常见的暴露方式为宰杀、洗切病/死猪肉.临床表现为急起畏寒、发热、头昏、头痛、全身不适及疼痛,重者出现休克及昏迷.临床类型主要有单纯败血症型、休克型、脑膜炎型及混合型4型.所分离的猪链球菌2型均对四环素耐药,对其它多种抗菌药物均敏感.本组68例患者治疗后总有效率为76.5%(52/68),病死率为23.5%(16/68).有休克的患者治疗后有效率为42.3%(11/26),病死率为57.7%(15/26).化脓性脑膜炎患者治疗的有效率为97.5%(39/40).结论 猪链球菌2型感染的主要临床表现为化脓性脑膜炎和休克.治疗效果以脑膜炎型为好,休克型及混合型差,病死率高.     

侵袭性肺炎链球菌148株血清型、耐药性及分子分型研究

目的 研究临床分离的侵袭性肺炎链球菌血清型分布、耐药性及分子流行病学特点,为抗生素的应用和免疫预防提供参考依据.方法 收集2005年1月至2008年8月全国15个地区148株来自血液、脑脊液等侵袭性感染部位的肺炎链球菌.采用琼脂稀释法测定青霉素等抗生素对148株肺炎链球菌的最低抑菌浓度(MIC);采用简易棋盘式肺炎链球菌分型系统和荚膜肿胀实验进行血清分型;多位点序列分型(MIST)技术对53株19群菌株进行基因分型,了解其与国际流行株的关系.结果 血清分型共检出20个血清型/群,主要集中在19A、19F、3、23F、5、6、14和9血清型/群,共计105株,占70.9%,以19A(22.3%,33/148)、19F(16.9%,25/148)最常见,其次为3群(7.4%,11/148)和23F(6.8%,10/148).7价疫苗(PCV7)在2岁以下儿童中的覆盖率为33.3%(12/36).PCV7相关血清型肺炎链球菌对阿莫西林/克拉维酸、红霉素等耐药率均明显高于非疫苗相关血清型菌株(P<0.05).53株19群肺炎链球菌MIST分析共检出9种序列型(ST),其中以ST320(28/53,52.8%)和ST271(12/53,22.6%)为主.结论 我国侵袭性肺炎链球菌血清分型以19A、19F、3和23F血清型为主.侵袭性肺炎链球菌耐药情况严重.     

Molecular Characteristics of Neisseria meningitidis Isolated during an Outbreak in a Jail: Associatition with the Spread and Distributition of ST-4821 Complex Serogroup C Cltione in China

Objective To characterize the meningococcal strains isolated from cases and close contacts with meningococcal disease associated with an outbreak in a jail in May 2010 by investigating the national distribution of hyperinvasive ST-4821 serogroup C clone associated with this outbreak. Methods The cases were described based on the clinical symptoms and laboratory results. Pharyngeal swabs were cultured for N. meningitidis from men in the jail. Meningococcal isolates were identified by serogrouping, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST), respectively. Four hundred and sixteen serogroup C N. meningitidis strains were collected from 27 provinces between 2003 and 2010 for a nationwide survey and analyzed by PFGE and MLST. Results Three persons in a jail system were infected with invasive N. meningitidis serogroup C. All isolates tested had matching PFGE patterns and belonged to the multilocus sequence type (ST) 4821 clonal complex. All 47 N. meningitidis strains were identified from the pharyngeal swabs of 166 peoples in the jail, and 26 of them belonged to ST-4821 serogroup C clone, and 90.14% (375/416) serogroup C strains identified in the nationwide survey belonged to the ST-4821 complex. The ST-4821 serogroup C clone was spread nationwide, distributed in 24 provinces, especially in eastern provinces between 2003 and 2010. Conclusion Endemic transmission and carriage rate of ST-4821 serogroup C clone are high in this jail system. The ST-4821 serogroup C clone is spreading in China and nationwide distributed despite the existence of some effective vaccines.     

Molecular Typing of Leptospira interrogans Strains Isolated from Rattus tanezumi in Guizhou Province, Southwest of China

ObjectiveTo identify and type three leptospires isolated from Rattus tanezumi in Guizhou Province by using three molecular techniques (PFGE, MLVA, and MLST), reveal the molecular characteristic of causative agents of local leptospirosis and evaluate these three molecular methods based on their detection resolution and efficiency.MethodsThree Leptospira strains were isolated from the kidney of Rattus tanezumi and cultured with EMJH medium. PFGE, MLVA, and MLST assays were applied to type the three strains isolated from Rattus tanezumi in Guizhou Province.ResultsPFGE, MLVA, and MLST typing showed that the three leptospiral isolates matched with leptospiral serogroup Icterohaemorrhagiae serovar Lai. The findings of the genotyping methods were consistent. MLVA and MLST defined genotypes, whereas PFGE allowed the recognition of additional subgroups within the genotypes, and the findings of molecular typing were also consistent with those of traditional techniques.ConclusionThree leptospiral isolates from Guizhou Province matched with leptospiral serogroup Icterohaemorrhagiae serovar Lai, and PFGE, MLVA, and MLST, as reliable molecular techniques for identifying and typing of Leptospira interrogans, would contribute to the active surveillance, outbreak investigation and source tracking for leptospirosis in Guizhou Province.