抗炭疽毒素保护性抗原单克隆抗体的制备及功能分析

目的:原核表达炭疽杆菌保护性抗原PA10蛋白,制备单克隆抗体,并进行功能分析?方法:人工合成炭疽杆菌保护性抗原PA10编码基因并克隆入pUC57载体,酶切鉴定后,将PA10编码基因插入原核表达载体pColdⅡ中,测序验证正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG和低温条件下诱导蛋白表达,SDS-PAGE验证产物;用HiTrap IMAC HP柱纯化重组蛋白,Western blot进一步验证?以纯化获得PA10重组蛋白为抗原,常规程序免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,并检测所制备抗体的中和活性?结果:获得的PA10重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,最终获得了4株特异性的单克隆抗体(分别命名为2G8?5A8?7B3? 9C9)?经体外炭疽毒素保护试验证实,其中1株单抗(7B3)具有较强的中和活性,其保护率可高达96%?结论:本文成功构建并表达炭疽杆菌保护性抗原PA10,制备了具有中和活性的抗PA单克隆抗体,为构建人源化的抗PA中和抗体奠定基础,从而有望用于炭疽病的治疗?     

全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备与鉴定

目的:利用人源IgM转基因小鼠制备全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体,并对其进行初步鉴定?方法:以灭活的狂犬病病毒CTN株作为抗原免疫人IgM转基因小鼠?采用杂交瘤技术结合酶联免疫吸附试验(ELISA)高通量交叉筛选技术(HTS)制备全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体?通过双抗体夹心ELISA鉴定单抗的人源性和抗体型,间接ELISA?斑点杂交(Dot Blot)实验及Western blot检测单抗的特异性,BiaCore X-100测定单抗结合抗原的亲和力?结果:建立了2株稳定分泌抗狂犬病病毒人源性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为9E3和9F2?双抗体夹心ELISA结果显示2株单抗均为人源性免疫球蛋白IgM型?间接ELISA?斑点杂交实验结果表明2株单抗均能特异性识别灭活的狂犬病病毒CTN株?Western blot结果显示2株单抗均能与狂犬病病毒糖蛋白特异性结合?2株单抗与狂犬病病毒CTN株抗原结合的亲和力分别为 2.62 × 10-10 mol/L?4.06 × 10-11 mol/L?结论:筛选制备了2株特异性?高亲和力的全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体?本研究为进一步筛选人源抗狂犬病病毒免疫预防性中和抗体及其免疫治疗的应用奠定了基础?     

鼠抗早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鼠抗早孕因子（EPF）单克隆抗体,纯化并进行鉴定。方法用重组EPF免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术获得抗EPF杂交瘤细胞株,注入BALB/c小鼠腹腔制备腹水型单抗,Protein-G亲和层析纯化后,SDS-PAGE电泳鉴定其纯度,用间接ELISA法测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,用Western blotting鉴定其特异性,并进行类及亚类、细胞染色体核型分析。结果筛选出2株具有较高活性和良好稳定性的分泌抗EPF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其腹水的抗体效价均高于2×10^-5,2株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,2株单抗有不同的抗原表位。SDS-PAGE电泳显示纯化后抗体有较高的纯度,Western blotting表明其与EPF抗原有特异结合性。结论成功制备2株具有较高活性的鼠抗EPF单克隆抗体,为建立检测EPF方法奠定了良好的基础。     

小鼠脾内免疫法制备重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体

 目的 制备小鼠抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体,用于早期弓形虫感染的抗原检测。方法 用弓形虫RH株重组抗原SAG1进行常规免疫结合小鼠脾内免疫,杂交瘤技术制备单克隆抗体。ELISA法筛选阳性克隆,经亚克隆建株。诱生腹水法制备抗体,protein-G亲合层析法进行纯化,测定其亚类、效价;Western blot法分析其特异性;夹心-ELISA法检测抗体的敏感性及特异性;检测弓形虫感染小鼠血液循环抗原,同时用PCR法检测弓形虫B1基因并比较结果。结果 获得2株抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体3B6、10C4,抗体均为IgG1,轻链均为κ链,Western blot显示2株单抗均能识别弓形虫天然的和重组的SAG1抗原。3B6、10C4敏感度分别为31.3 ng和62.5 ng,与血吸虫病、钩虫病及疟疾患者血清均无交叉反应。弓形虫早期感染检测PCR及ELISA法阳性检出率分别为63.2%、47.4%。结论 成功制备小鼠抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体,初步用于早期弓形虫感染诊断。     

Identification of excreted and metabolic antigens from adult worms of Schistosoma japonicum

目的 制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原,对其免疫原性以及免疫反应性进行初步鉴定.方法 日本血吸虫尾蚴感染家兔,42 d后剖杀获取成虫,将虫体置无血清DMEM培养基中,5% CO2孵箱37℃培养4 h,得到成虫分泌代谢抗原;用该抗原免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体反应;用该抗原包板,ELISA法检测血吸虫感染人血清抗体效价;采用十二烷基硫酸钠聚丙酰烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其组分进行分析,然后用Western blot分析其对抗成虫分泌代谢抗原单抗发生反应的蛋白条带.结果 成功制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原;免疫小鼠可产生较高滴度(1:16 000)抗体反应;急性血吸虫病患者、慢性血吸虫病患者、晚期血吸虫病患者和钩虫病患者血清抗该抗原的抗体效价分别为1:800、1:400、1:800和1:100,华支睾吸虫患者和正常人血清均为阴性;SDS-PAGE显示其具有4条蛋白条带,分子量分别是13、40、60和180 ku左右;Western blot结果 表明该抗原能够被抗成虫分泌代谢抗原单抗在5 ku左右处识别.结论 制备的日本血吸虫成虫分泌代谢抗原具有较强的免疫原性和免疫反应性.     

全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗体的制备及鉴定

目的:利用重组狂犬病病毒糖蛋白(RVG)免疫人源IgM转基因小鼠,制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行初步鉴定?方法:以重组RVG蛋白作为抗原免疫人源IgM转基因小鼠,采用杂交瘤技术制备筛选全人源抗重组RVG蛋白杂交瘤细胞株,双抗体夹心ELISA实验鉴定单抗的人源性及抗体类型,并对其特异性及与灭活狂犬病病毒CVS-11株的结合能力进行鉴定?结果:建立了5株稳定分泌抗重组RVG的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5D1?6H11?9A3?15D6?19E6,均为人源IgM免疫球蛋白,5株单抗均能特异性识别重组RVG蛋白,其中3株能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合?结论:筛选制备了特异性全人源抗重组RVG蛋白的单克隆抗体,能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合,为进一步研制用于狂犬病防治的抗体药物奠定了基础?     

炭疽毒素受体单克隆抗体的制备、鉴定及结合位点分析

【目的】制备与鉴定针对两种炭疽毒素受体(anthrax toxin receptor,ATR)的特异性单克隆抗体,为建立ATR的检测方法、研究炭疽毒素的致病机理提供工具。【方法】以重组表达的两种ATR即毛细血管形态发生蛋白2(capkllary morphogenesis protein 2,CMG2)和肿瘤内皮标志8蛋白(tumor endothelial marker 8,TEM8)分别免疫小鼠,制备单克隆抗体,用ELISA、Western dot blotting及细胞保护性试验等方法对所制备的单克隆抗体进行鉴定和分析,并尝试应用上述单克隆抗体经双抗体夹心ELISA、Western blotting和IFA对ATR进行检测。【结果】获得针对CMG2的单克隆抗体4B5、4G3;针对TEM8的单克隆抗体2D6、4B9;以及可同时结合CMG2和TEM8的单克隆抗体2G4,其中4B5具有一定的细胞保护活性,这些单克隆抗体可用于ATR的特异性检测。【结论】本研究所制备的单克隆抗体可经ELISA、Western blotting和IFA用于ATR体内外检测,从而为探讨炭疽毒素的致病机理提供有效的研究手段。     

人高尔基体蛋白GP73基因的克隆?表达?单克隆抗体的制备及鉴定

目的:高尔基体蛋白73(Golgi protein 73,GP73)是新近发现的肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要血清学标志物?通过克隆?表达人GP73,制备抗GP73单克隆抗体并鉴定其特性?方法:克隆GP73基因,构建GP73原核表达载体pComb3XSS-GP73,诱导表达,以HisFF Trap亲和层析柱纯化GP73-6×His重组融合蛋白?以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗GP73单克隆抗体?以间接法ELISA检测抗体效价;Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法初步检测肝癌患者血清中GP73表达水平?结果:成功表达并纯化了GP73-6×His重组蛋白;获得5株稳定分泌抗人GP73单克隆抗体杂交瘤细胞株;免疫共沉淀证实抗GP73 单克隆抗体能与肝癌患者血清中GP73蛋白特异性结合,GP73水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高?结论:成功制备了抗人GP73单克隆抗体,为后期建立检测人GP73的双抗体夹心ELISA方法打下基础?     

抗猪鼻支原体单克隆抗体的研制及双抗体夹心ELISA检测法的建立

目的 制备多种抗猪鼻支原体的单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA方法用于该病原体的检测.方法 用猪鼻支原体CVCC361免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术和酶联免疫吸附实验筛选出抗该病原体的单克隆抗体;运用免疫双向扩散试验、Westem blotting确定IgG亚类及针对抗原的相对分子质量;筛选出配对抗体,建立双抗体夹心ELISA的检测方法,并评价其灵敏度和特异性.结果 共筛选出17株单克隆抗体,抗体亚类分别为ISG1、IsG2、 IgG2b、IgG3,免疫印迹结果表明单抗ZBI、ZB2及ZB16与相对分子质量为35×103的抗原有特异性结合,而ZB3和ZBl0与相对分子质量为70 × 103的抗原有特异性结合.确定了2个配对抗体(ZBI-ZBI-HRP和ZB1-ZB2-HRP),可检出最小抗原量为30ng/mL,检出猪鼻支原体活菌8.34×102CFU/mL,与人呼吸道常见的致病菌及支原体均无非特异性反应.结论 筛选的单克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,应用双抗体夹心ELISA方法可用于猪鼻支原体的检测.     

日本血吸虫成虫分泌抗原的鉴定

目的制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原,对其免疫原性以及免疫反应性进行初步鉴定。方法日本血吸虫尾蚴感染家兔,42 d后剖杀获取成虫,将虫体置无血清DMEM培养基中,5%CO2孵箱37℃培养4 h,得到成虫分泌代谢抗原;用该抗原免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体反应;用该抗原包板,ELISA法检测血吸虫感染人血清抗体效价;采用十二烷基硫酸钠聚丙酰烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其组分进行分析,然后用Western blot分析其对抗成虫分泌代谢抗原单抗发生反应的蛋白条带。结果成功制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原;免疫小鼠可产生较高滴度(1∶16 000)抗体反应;急性血吸虫病患者、慢性血吸虫病患者、晚期血吸虫病患者和钩虫病患者血清抗该抗原的抗体效价分别为1∶800、1∶400、1∶800和1∶100,华支睾吸虫患者和正常人血清均为阴性;SDS-PAGE显示其具有4条蛋白条带,分子量分别是13、40、60和180 ku左右;Westernblot结果表明该抗原能够被抗成虫分泌代谢抗原单抗在5ku左右处识别。结论制备的日本血吸虫成虫分泌代谢抗原具有较强的免疫原性和免疫反应性。     

鼠抗SARS病毒X4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备SARS病毒X4蛋白的单克隆抗体,探讨X4蛋白的结构和功能,以及临床应用的价值.方法:以重组SARS病毒X4蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞进行常规融合, 通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化,获得鼠抗SARS病毒X4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过ELISA,Western blot和免疫荧光实验等方法鉴定其特性.结果:成功地建立了3株稳定分泌抗X4蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为8A5,8H6和4A2.3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG2a.通过ELISA, Western blot等方法的鉴定,抗X4蛋白的单克隆抗体能与X4蛋白发生特异性反应.免疫荧光实验的结果表明,X4蛋白的单克隆抗体能与SARS-病毒感染的Vero E6 细胞发生特异性结合.结论:获得了特异性识别SARS病毒X4蛋白的单克隆抗体,为SARS病毒X4蛋白的生物学功能研究奠定了基础.     

McAb-ELISA检测血吸虫循环抗原——Ⅰ.McAb的制备、筛选及初步试验

将感染日本血吸虫或曼氏血吸虫尾蚴的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,制备了30余株分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤,其靶抗原分别为血吸虫成虫表面膜、肠道、体细胞和虫卵。预试验结果表明,抗血吸虫成虫肠道多糖抗原McAb活性最强,将其用于夹心ELISA检测血吸虫成虫三氯醋酸可溶性抗原,敏感度达1ng/ml。用夹心ELISA测定正常兔血清呈阴性反应;测定感染兔血清呈阳性反应,且抗原水平与感染度呈正相关;8只感染兔治疗后3个月,除2份兔血清外,其余血清均转为阴性。提示本方法优于一般抗体测定法,是一种有潜力的免疫诊断方法。     

重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备

目的：制备重组创伤弧菌溶细胞素（recombinant Vibrio vulnificus cytolysin,rVVC）鼠源性单克隆抗体,并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定,为创伤弧菌溶细胞素（Vibrio vulnificus cytolysin,VVC）致病机制的后续研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测试剂盒的研发奠定基础。方法：IPTG诱导含pET28a（＋）-vvhA的大肠杆菌表达rVVC,将rVVC纯化、复性后经甲醛脱毒作为抗原免疫BALB/c小鼠。SDS-PAGE检测蛋白纯化后效果。采用杂交瘤技术和ELISA法制备并筛选分泌rVVC单克隆抗体的杂交瘤细胞株,有限稀释法对阳性孔克隆化培养。采用免疫双扩法鉴定单克隆抗体类型,ELISA法、免疫双扩法鉴定单克隆抗体的特异性。结果：将纯化复性后的rVVC作为抗原免疫小鼠后,经ELISA检测,血清有效稀释度达1：12800。共获得2株可持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为B2C7和E3F4株,其抗体类型均为IgG1,且具有较高特异性,与多种其他细菌蛋白不发生免疫反应。结论：本研究成功免疫BALB/c小鼠,获得B2C7和E3F4两株可持续稳定分泌rVVC鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体类型为IgG1型。     

应用单克隆抗体检测华支睾吸虫病人的循环抗原

本文应用抗华支睾吸虫成虫抗原的单克隆抗体建立了Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ，以检测华支睾吸虫病人血清中的循环抗原。被检的６１例中５１例（８３％）呈阳性反应，而肺吸虫、血吸虫、旋毛虫、猪囊虫病人以及健康人均为阴性。     

抗HCV NS3抗原单克隆抗体的研制与初步鉴

目的：为研制抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ３抗原单克隆抗体,用于检测丙肝患者血清中的ＨＣＶＮＳ３抗原。方法：用基因工程表达的ＨＣＶ非结构区ＮＳ３蛋白与鼠血清白蛋白交联后,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,用杂交瘤技术获得能分泌单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的细胞株。结果：获得有实用价值的两株ＭｃＡｂ。两株ＭｃＡｂ与免疫抗原有较强的抗原－抗体反应,与ＨＣＶＮＳ４、ＮＳ５及核心区Ｃ３３肽、ＣＰ９、ＣＰ１０抗原无反应性,在竞争ＥＬＩＳＡ中,对ＨＣＶ－ＩｇＧ阳性血清有较好的抑制作用。结论：用基因工程表达的ＨＣＶ非结构区ＮＳ３蛋白,能够制备出有实用价值的单克隆抗体。     

炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针的制备

目的 快速制备炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针。方法 根据PubMed上公布的炭疽杆菌保护性抗原的DNA序列设计引物，扩增保护性抗原基因。利用酶切、AT克隆方法快速分析筛选出保护性抗原基因片段的重组子，从而制备成芯片探针。DNA自动分析仪对克隆片段进行序列测定，生物信息学软件对其基因序列进行分析。结果根据炭疽杆菌保护性抗原设计的引物，可以扩增出长2205bp的保护性抗原基因，经酶切、AT克隆方法筛选出约7个长度不一的片段，对其片段进行序列测定并进行Blast序列比对得知这些片段均属于炭疽杆菌保护性抗原基因。结论 利用PCR扩增产物并结合酶切、AT克隆方法可以快速、简便地制备基因芯片探针。     

人源性噬菌体抗体库中抗CEA单抗的筛选与初步鉴定

目的：探讨利用噬菌体抗体库技术制备抗CEA的人源性单抗的可行性。方法：以纯化的CEA为抗原，应用噬菌体表面呈现技术，通过3轮亲和 富集及2轮淋巴细胞吸附实验，从已构建好的人源性噬菌体抗体库中筛选出抗CEA的人源性单抗，随机挑出10株单克隆在大肠杆菌中进行表达，并采用ELISA 、SDS－PAGE及基因测序进行初步鉴定。结果：ELISA显示有9株单抗具有与CEA特异性结合的能力，挑选其中2株具有较高亲和力的单克隆，经12％SDS－PAGE蛋白电泳，在分子量约为25kd处可见一新增蛋白带，与基因编码蛋白的理论计算相符合，基因测序结果与Gene Bank等相比对具有较高的序列同源性。结论：噬菌体抗体库技术是研制人源性单抗的有效途径。     

炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针的制备

目的快速制备炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针。方法根据PubMed上公布的炭疽杆菌保护性抗原的DNA序列设计引物,扩增保护性抗原基因。利用酶切、AT克隆方法快速分析筛选出保护性抗原基因片段的重组子,从而制备成芯片探针。DNA自动分析仪对克隆片段进行序列测定,生物信息学软件对其基因序列进行分析。结果根据炭疽杆菌保护性抗原设计的引物,可以扩增出长2 205 bp的保护性抗原基因,经酶切、AT克隆方法筛选出约7个长度不一的片段,对其片段进行序列测定并进行Blast序列比对得知这些片段均属于炭疽杆菌保护性抗原基因。结论利用PCR扩增产物并结合酶切、AT克隆方法可以快速、简便地制备基因芯片探针。     

间接免疫荧光法检测麻疹抗原在麻疹早期诊断中的临床应用

目的:探讨间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence Assay,IEA)检测麻疹病毒抗原对儿童麻疹病毒(measles virus,MV)感染的早期诊断价值.方法:观察86例临床诊断麻疹的患儿,在发病的不同阶段IFA检测痰液MV抗原和酶联免疫吸附试验(engymelinked imgmunosorbent assay,ELISA)检测血清中MV特异性LgM抗体,采集30份上呼吸道感染患者痰液进行IFA麻疹病毒抗原检测,比较分析检测结果.结果:86例中发病7 d内IFA测抗原ELISA测抗体两种方法的阳性率为分别为97.1%和16.2%;7 d后为33.3%和88.9%,P均＜0.01.IFA测抗原阳性率与检测时间的相关系数为-0.91,P=0.02;ELISA测抗体阳性率与检测时间的相关系数为0.97,P=0.04.30份对照组的标本MV抗原检测均为阴性,IFA测抗原的特异性与敏感性分别是100%和97.1%.结论:IFA测抗原在疾病早期检出阳性率高,阳性检出率与检测时间成负相关,IFA测抗原痰液麻疹病毒抗原是一种早期快速、特异敏感的实验室检测方法.     

血清学方法检测SARS病毒抗体的比较

目的：比较血清学方法(间接ELISA法和双抗原夹心ELISA法)对SARS患者特异性抗体的检出情况。方法：采用间接法和双抗原夹心法分别检测健康人、发热非SARS患者、不同时期的SARS患者血清中的特异性抗体水平。结果：双抗原夹心法的阳性检出率为73．6％，而间接法的阳性检出率为57．5％，前者对SARS患者各时期特异性抗体的阳性检出率高于间接法，特别是住院第1周的阳性检出率为30％，而间接法对住院第1周的阳性检出率为0％。结论：双抗原夹心法检测SARS患者特异性抗体优于间接法。